移植免疫及相關問題的探討

移植免疫及相關問題的探討第1頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一

目的：救治末期器官衰竭、惡性血液病、腫瘤以及某些遺傳病。要求：盡可能讓移植物能在受體體內生存或暫存常時間。困惑：排斥反應、繼發(fā)感染。策略“immunotolerance”（免疫耐受），監(jiān)測和預防。第2頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一

免疫排斥（immunerejection）：指器官、組織或細胞移植后，受體發(fā)生免疫應答，引起針對移植物的免疫損傷而使其喪失功能的一個過程。表現(xiàn)：hyperacuterejectionacuterejectionchronicrejection第3頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一移植類型：1、autologoustransplantation自身移植2、syngeneictransplantation同系移植3、allogeneictransplantation同種異體、異基因移植★4、xenogeneictransplantation異種移植根據移植物所植部位—原位～異位～第4頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一第5頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一主要內容一、免疫排斥反應發(fā)生的機制二、移植排斥反應的類型三、移植中的組織配型四、移植排斥的免疫學防治五、干細胞移植六、移植排斥的特殊免疫學問題七、排斥反應的免疫學檢驗八、移植后藥物濃度的檢測第6頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一一、免疫排斥反應發(fā)生的機制

（一）移植抗原（transplantationantigen）1、主要組織相容性抗原（majorhistocompatibilityantigen，MHA）又人類白細胞抗原（humanleukocyteantigen，HLA）

2、次要組織相容性抗原（minorhistocompatibilityantigen，mHA）

3、其他同種異型抗原（血型、不同組織特異性抗原）第7頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一1、主要組織相容性抗原（MHA）：一組存在于各種脊椎動物某對染色體特定區(qū)域的基因群，其編碼的基因產物分布于各種有核細胞的表面，為重要的細胞膜抗原，也稱之主要組織相容性復合體（MHC）。人和脊椎動物都有各自獨特的MHA。除小鼠和大鼠有專門命名外，其他種屬的MHA均稱白細胞抗原（leukocyteantigen，LA）。（Humanleukocyteantigen，HLA）第8頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一HLA：位于人類的第6對染色體的短臂上，由400萬個堿基組成，分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類（復雜）。例——HLAⅠ類基因：HLA-A,-B,-C和-E～-H,-X;HLAⅡ類基因：HLA-DP,-DQ,-DR和-DN～-DOHLAⅢ類基因：位于HLA-Ⅰ和Ⅱ的之間。關于HLAⅠ、Ⅱ、Ⅲ類分子的結構（略）。關于HLA分型、應用與鑒定（后敘）。

第9頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一（二）T細胞識別同種異型抗原的機制直接識別間接識別同種異型抗原的直接識別和間接識別第10頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一直接識別（directrecognition）：指受者T細胞直接識別供者抗原遞呈細胞表面的MHC分子等。（急性、反應強）間接識別（indirectrecognition）：指受者T細胞識別經過受者抗原遞呈細胞加工處理的來源供者MHC分子的肽。（慢性、弱）

directrecognition對環(huán)孢素敏感

indirectrecognition對環(huán)孢素不敏感第11頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一（三）移植排斥反應的效應機制1、超急性排斥反應：時間：幾分、幾時～48小時發(fā)生機制：預存于受體的抗移植物抗體隨血流進入移植物，通過與血管內皮細胞結合，激發(fā)一系列免疫損傷應答。過程：補體活化-血小板黏附聚集-凝血系統(tǒng)活化-血栓形成-缺血性壞死～血型不符、多次妊娠、反復輸血、移植過～第12頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一2、急性排斥反應：時間：數周～數月內機制：①殘留于供體移植物中的APC對受體的免疫系統(tǒng)提供最初的抗原性刺激，激活免疫應答～（directpath）②通過受體的APC對移植物抗原的識別后，再刺激并激活免疫應答反應～（indirectpath）分類：急性體液排斥反應/急性細胞排斥反應第13頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一1）急性體液排斥反應：（急性脈管排斥反應），主要由抗內皮細胞表面HLA分子的抗體所介導，不引起血栓，出現(xiàn)移植組織和器官的血管炎。對免疫移植劑治療無效，被迫切除移植物。2）急性細胞排斥反應：（加速性細胞排斥反應），發(fā)生此類反應患者的血液中，可以有抗供者的抗體，但不一定引發(fā)急性脈管排斥反應，卻以移植組織或器官實質性損害、壞死為主，伴淋巴細胞侵潤。（CD8+CTL的細胞毒作用等）第14頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一3、慢性排斥反應：時間：術后數月～數年機制：與免疫相關—系急排發(fā)作致移植物退行性變，由遲發(fā)超敏反應介導的免疫炎癥。非免疫相關—局部缺血、微生物感染第15頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一二、移植排斥反應的類型HVGR（hostversusgraftreaction）GVHR（graftversushostreaction）HVGR—指宿主對移植物攻擊，排斥～GVHR—指移植物中的過路T細胞對宿主攻擊，排斥～臨床上HVGR多見～。第16頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一HVGR：（一）超急性排斥反應（＜48小時）受者體內預存針對移植物抗體～（二）急性排斥反應（幾天～2周）

CD4+Th1介導的超敏反應，CD8+CTL毒性受體產生抗移植物抗體～；NK、MΦ激活（三）慢性排斥反應（數周、月、年）未明了，與上述免疫學機制有關；有非特異性免疫學機制參與（感染、并發(fā)癥等）

第17頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一GVHR（GVHD）發(fā)生的前提：①受、供者HLA型不匹配，②移植物中存在足夠量的免疫細胞（成熟T），③受者免疫無能或極低。移植物抗宿主反應導致移植物抗宿主病，臨床表現(xiàn)為急性/慢性，難以逆轉死亡率高T細胞是介導GVHR的主要效應細胞，去除骨髓中成熟T細胞有效預防GVHR的發(fā)生。第18頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一三、移植中的組織配型（一）選擇組織相匹配的供者1、一般情況（供物狀態(tài)、全身情況、年齡）2、ABO血型相容（擬輸血）3、HLA相容性（受、供者HLA等位基因相合的數目越多越好）（二）HLA相容程度測試1、血清學分型2、細胞學分型3、基因分型第19頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一1、血清學分型：原理—利用各種已知的HLA標準血清型，與檢測細胞反應，添加補體后觀察細胞反應（CDC）～（micro-complementdependentcytotoxicity）技術要點—分離淋巴細胞，與標準抗血清反應，添加補體，死細胞染色記數、判斷評價—較理想，標準抗血清難～第20頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一2、細胞學分型—采用淋巴細胞混合培養(yǎng)（MLC），分雙向/單向。雙向MLC—受、供體淋巴細胞混合體外培養(yǎng)，彼此作用，觀察細胞形態(tài)與細胞增殖，互不影響示受、供體間HLA型相匹配，否則～技術要點—分離計數彼此淋巴細胞，共孵育，染色計數轉化細胞～評價—用于移植前的交叉配合試驗，但不能判定HLA-D型～第21頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一單向MLC—用已處理的標準型細胞與測試細胞共孵育，觀察測試細胞的反應。標準型細胞為只表達LD抗原的細胞，經絲裂霉素C或Ｘ線處理失去增殖能力，作為刺激細胞，與測試細胞孵育，觀察測試細胞的增殖反應，稱純合子細胞分型試驗（HTC）。測試細胞無增殖反應示彼此相同，又稱陰性分型試驗。第22頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一當標準型細胞為只能對單倍型細胞具有識別而增殖的現(xiàn)處于靜止狀態(tài)的淋巴細胞，經預處理后成為致敏淋巴細胞（PL），作為反應細胞，與測試細胞孵育時，經測試細胞的刺激使PL轉化、增殖，又稱其為陽性分型試驗（PLT）。HTC/PLT—均為單向MLC，技術要點類同雙向～，但有許多預處理等～。評價—實際但繁瑣、技術要求高～第23頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一3、基因分型①限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分型②聚合酶鏈反應-序列特異性寡核苷酸探針～（PCR-SSOP）③PCR-序列特異性引物（PCR-SSP）分型④PCR-單鏈構象多態(tài)性（PCR-SSCP）分型⑤PCR指紋圖譜技術⑥其他第24頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一①限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分型：利用不同個體的HLA相應堿基序列不同，其內源性酶切位點不同，經同一組內切酶的酶切反應后，出現(xiàn)酶切片段的個數、長短不一（酶切圖譜）?！c已知型的比對、分析——用以定型。第25頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一②聚合酶鏈反應-序列特異性寡核苷酸探針～（PCR-SSOP）：將待檢細胞HLA基因片段經PCR擴增、產物轉移至尼龍膜上，再與核素標記的特異性寡核苷酸探針進行雜交，——結合完好說明其基因序列相似（互補）。第26頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一③PCR-序列特異性引物（PCR-SSP）分型：先設計特異性引物（SSP），因為此SSP只能和相應的等位基因特異性片段的堿基序列互補結合～④PCR-單鏈構象多態(tài)性（PCR-SSCP）分型：相同長度的單鏈DNA，其堿基順序不同即便只有單個堿基不同，經不變性的中性聚丙烯胺凝膠電泳后，可反映不同的空間構象（泳動速度、遷移率）。第27頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一⑤PCR指紋圖譜技術：DNA指紋圖是指，由于不同個體的DNA具有不同的分子構象，其在非變性聚丙烯胺凝膠電泳中呈現(xiàn)的特異性區(qū)帶圖譜。操作步驟是，先分別得到供者/受者的DNA指紋圖；然后將得到供者和受者的混合DNA指紋圖，并作一致性比較分析～第28頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一（三）交叉配型試驗目的：檢測受者體內是否存在抗供者的特異性抗體以及受者對供者HLA抗原的相容程度。技術要點：供者淋巴細胞+受者血清（混合）供者淋巴細胞+受者淋巴細胞等等方法：1、微量細胞毒試驗，2、流式細胞術，3、混合培養(yǎng)，4、CML～第29頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一四、移植排斥的免疫學防治移植排斥反應是根據臨床表現(xiàn)、移植物功能狀態(tài)、實驗室多種相關檢測結果的綜合性判斷的。移植排斥反應是移植失敗的主因；是移植免疫致力克服的關鍵難題。關注點（一）排斥反應的監(jiān)測（二）排斥反應的防治第30頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一（一）排斥反應的監(jiān)測

1、細胞免疫學監(jiān)測①T淋巴細胞數量、功能以及亞群比例等，②殺細胞活性（CTL和NK）。2、細胞因子監(jiān)測：Th1型/Th2型

Th1型包括IL-2、TNF-a、IFN-r等

Th2型包括IL-4、IL-10等3、抗HLA抗體檢測4、蛋白、酶類、補體檢測第31頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一3、抗HLA抗體檢測：

原理：與異體排斥反應有關的體液、細胞免疫效應主要是針對HLA抗原的～，移植前所檢測的包括面不夠（其他抗體/群體反應性抗體(PRA)？群體反應性抗體(PRA)：是指器官移植受者體內的抗HLA（特異+其他），因為測得血清中PRA的水平更有助于移植時受者對移植物的敏感程度。移植術前后的PRA高低與術后急性排斥反應明顯有關。第32頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一（二）排斥反應的防治

1、HLA配型（組織配型）2、免疫抑制劑3、移植耐受的誘導4、移植物等的預處理第33頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一1、HLA配型—越接近，成功率越高。

HLA配型應包括對HLA-Ⅰ類分子和其Ⅱ類分子的配型。尤其Ⅱ類分子的匹配與否，更關系到移植物能否長期存活問題。

HLA的配型包括HLA交叉配型、預存抗體的檢測。交叉配型包括淋巴細胞間、T細胞淋巴細胞毒性間、B細胞淋巴細胞毒性間、流式細胞法、自身等。第34頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一2、免疫抑制劑

1）藥物:

皮質類固醇細胞增殖抑制劑（霉酚酸酯；MMF）抑制T細胞活化（環(huán)孢素；CsA）（普樂可復；FK605）

2）抗體：抗淋巴細胞、抗胸腺細胞、抗CD3等

3）輸血：與活化Ts細胞、產生封閉抗體等第35頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一3、移植耐受的誘導：

1）照射：

X線照射（全淋巴照射-細胞破壞）紫外線照射（滅活傳遞細胞功能，活化

Ts）

2）藥物：環(huán)磷酰胺、環(huán)孢霉素A等，誘導免疫耐受可能與誘導Ts細胞增生有關。

3）抗體：抗淋巴細胞血清、抗T細胞表面分子抗體，使得T細胞等無能～第36頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一4、移植物等的預處理

1）移植物的預處理：不同組織器官的移植，其移植物的處理不盡相同（外科修整、動脈灌洗）。動脈灌洗，清除殘留于待移植器官內的血液及細胞成分，尤其是免疫細胞（過客細胞），以防止過客細胞導致的GVHR。用灌洗液前例腺素E1、硫酸鎂、Collins液；或添加抗體～

2）受體的準備（略）第37頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一五、干細胞移植干細胞指人體中尚未發(fā)育的原始細胞，具有“樹干”和“根源”的雙重意義。

干細胞的定向分化第38頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一干細胞的發(fā)育受多種內在機制和微環(huán)境因素的影響。體外經一定條件可使其定向分化—細胞、組織、器官等。干細胞種類：胚胎～指受精卵分裂發(fā)育成囊胚時的內層細胞團（全能性）。成體～指成年動物中某些具再生、修復能力的干細胞。第39頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一干細胞移植的臨床應用：

1、作為種子細胞，用于細胞治療或組織細胞替代治療。

2、研究胚胎發(fā)育的調控機制

3、作為疾病基因治療的理想載體

4、用于藥物篩選和新藥開發(fā)

5、催生了細胞性心肌成形術第40頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一六、移植排斥的特殊免疫學問題指跨物種間的移植（異種移植），解決供體器官的同時，強烈的排斥反應～（一）異種間移植的排斥反應

1、特性：①、②、③、④、⑤

2、類型（附圖）

3、預防：①脾切除，②阻斷補體活性，③吸附除去天然抗體（二）骨髓移植的排斥反應第41頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一（一）異種間移植的排斥反應

1、特性：①、細胞表面“異物”更多～②、急性血管性排斥反應～③、加速性細胞排斥反應～④、受者體內本存抗體，可促進

ADCC的發(fā)生與發(fā)展⑤、異種間的免疫障礙大于同種

2、類型（附圖）第42頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一第43頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一協(xié)調性(concordant):指屬異種，但種屬比較近的異種移植排斥；非協(xié)調性(discordant):指異種移植排斥發(fā)生在種系間較遠的～。根據參與反應發(fā)生的的機制不同，協(xié)調性—容易型/困難型非協(xié)調性—抗體介導型/補體介導型協(xié)調性與非協(xié)調性區(qū)別：前者為誘導型抗體后者為天然型抗體第44頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一3、預防：①脾切除，

②阻斷補體活性，

③吸附除去天然抗體第45頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一（二）骨髓移植的排斥反應

同種異基因（異體）骨髓移植用于治療白血病、再障等，目前面臨兩大主要問題：

1、白血病的復發(fā)

2、移植物抗宿主反應（GVHR）GVHR定義（略）GVHR發(fā)生原因（略）GVHR發(fā)生機制（初）：①CD4+Th1/Th2②CD8+Tc1/Tc2③NK、單核、粒細胞等慢性GVHR被視為一種自身免疫病。第46頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一七、排斥反應的免疫學檢驗

（一）體液免疫水平的檢測

檢測指標—ABO血型、其他血型、抗HLA抗體及供者組織細胞抗體、血管內皮、細胞抗體、冷凝集素抗體等。測定方法（略）

第47頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一（二）細胞免疫水平檢測檢測指標—參與細胞免疫有關的細胞數量、功能和產生細胞因子水平。檢測手段—外周血T細胞及其亞類的計數

T細胞轉化試驗（4h）

NK細胞活性測定血清細胞因子的測定黏附分子及其配體的檢測第48頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一（三）補體水平的檢測檢測指標—補體成分（C1q）、其裂解產物（C3a）及總補體活性（CH50）檢測方法（略）（四）急性時相反應物質的檢測檢測指標—C反應蛋白、TNF-a、IL-1、-6

檢測方法（略）第49頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一八、移植后藥物濃度的檢測

為什么要進行藥物濃度監(jiān)測如何進行藥物濃度監(jiān)測

1）藥物濃度監(jiān)測的臨床指征

2）藥物濃度監(jiān)測的目的

3）藥物監(jiān)測的種類與方法

4）藥物濃度監(jiān)測的要點第50頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一第51頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一第52頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一治療藥物監(jiān)測的臨床意義

一．治療藥物檢測的概念治療藥物監(jiān)測是指臨床生化實驗室通過理化方法測定病人體液中藥物濃度，對病人施行個體化的治療方案以保證較好的治療效果和較高的安全性的一種措施。第53頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一藥物濃度監(jiān)測的缺點費用昂貴影響因素復雜第54頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一需進行監(jiān)測的常見藥物呋塞米（速尿）利尿藥環(huán)孢素、FK506、MPA、雷帕霉素免疫抑制劑甲氯蝶呤等抗惡性腫瘤藥慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、氯霉素等抗生素阿司匹林、對乙酰氨基酚解熱鎮(zhèn)痛藥碳酸鋰抗躁狂癥藥丙咪嗪、阿米替林、去甲替林等抗抑郁藥氨茶堿平喘藥普萘洛爾、美托洛爾、阿替洛爾β受體阻斷劑苯妥因銨、苯巴比妥、乙琥胺、卡馬西平、丙戊酸鈉抗癲癇藥利多卡因、普魯卡因胺、奎尼丁、乙胺碘呋酮、因卡胺、異丙吡胺等抗心律失常藥地高辛、洋地黃毒苷強心甙藥品分類第55頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一移植和免疫抑制劑的應用1596年，意大利外科醫(yī)生成功進行最早一次成功的自體組織移植.19世紀初，嘗試異體皮膚移植,但因排斥而失敗。1940年，Medewar證實了同種異體移植排斥是一種免疫現(xiàn)象.1954年，美國醫(yī)生Murray在單卵雙生姐妹間進行腎移植獲得成功。

1962年，應用HLA分型技術選擇合適的供體，第一次用無親緣關系的供體腎進行異體移植，獲得成功。80年代初，由于環(huán)孢素A等應用，明顯提高了器官移植的成功率，器官移植已廣泛應用于臨床。第56頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一免疫抑制劑的發(fā)展1960年前，硫唑嘌呤1963年，去氫氫化可的松1968年，抗胸腺細胞球蛋白1978年，CSA1992年，F(xiàn)K5061999年，重組抗CD3陽性細胞單抗2002年，雷帕霉素2004年，依羅莫司第57頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一免疫抑制劑的發(fā)展其它有發(fā)展前景的藥物康樂霉素C

布列奎鈉（BQR）來氟米特和同類物（MNA）

CTLA41g第58頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一藥物監(jiān)測的種類與方法

方法（常見）：熒光偏振免疫分析（FPIA）微粒子熒光免疫分析（MEIA）ＥＬ