核酸的生物合成與降解

第1頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五1.轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)n1ATPn2CTPn3GTPn4UTPRNA聚合酶DNA模板RNA+（n1+n2+n3+n4)PPi定義：從DNA區(qū)段(基因)中的一條鏈為模板，在RNA聚合酶的催化下，以四種核苷酸為原料，按照A-U，G-C配對原則合成RNA一.概論第2頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五特點：不對稱轉(zhuǎn)錄--我們將用作RNA合成的模板的鏈叫做反義鏈；另一條不做模板的鏈叫有義鏈。RNA為全保留轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄開始不需要引物，鏈的延長方向也是5′→3′RNA聚合酶對利福平敏感2.轉(zhuǎn)錄的方式一.概論第3頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五2.轉(zhuǎn)錄的方式一.概論第4頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五2.轉(zhuǎn)錄的方式對于整個DNA雙鏈，每條鏈上有的區(qū)段用作有義鏈，有的區(qū)段用作反義鏈。所以，具有相對意義。一.概論第5頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五1.轉(zhuǎn)錄的酶亞基組成：a2bb'ws=a2bb'w+s

全酶核心酶

——

RNA聚合酶

a亞基

——解開前方的DNA雙螺旋、恢復(fù)后面的DNA雙螺旋b亞基

——催化磷酸二酯鍵的形成b'亞基

——與DNA的非模板鏈結(jié)合

二.原核生物轉(zhuǎn)錄第6頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五亞基組成：a2bb'ws=a2bb'w+s

全酶核心酶

核心酶：解開前方的DNA雙螺旋、RNA鏈的延伸、恢復(fù)后面的DNA雙螺旋s亞基：識別DNA上轉(zhuǎn)錄的起始部位，從而引導(dǎo)全酶結(jié)合上去此外，每個RNA聚合酶還含有2個Zn離子。1.轉(zhuǎn)錄的酶二.原核生物轉(zhuǎn)錄第7頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

DNA上存在著轉(zhuǎn)錄的起始信號，它是特殊的核苷酸序列，稱為啟動子（promoter）。轉(zhuǎn)錄是由RNA聚合酶全酶結(jié)合于啟動子而被啟動的。

2.轉(zhuǎn)錄過程-轉(zhuǎn)錄啟動二.原核生物轉(zhuǎn)錄第8頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五ThenucleotidesequencesofrepresentativeE.colipromoters

2.轉(zhuǎn)錄過程-轉(zhuǎn)錄啟動二.原核生物轉(zhuǎn)錄第9頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

聚合酶全酶上的s因子能識別啟動子，并識別有義鏈，從而使全酶定位到啟動子部位。二.原核生物轉(zhuǎn)錄2.轉(zhuǎn)錄過程-轉(zhuǎn)錄啟動第10頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五第11頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

如何確定啟動子部位？DNAFoot-printing第12頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

由全酶在啟動子附近將DNA局部解鏈，約解開17個堿基對。（酶與啟動子結(jié)合的部位是AT富集區(qū)，有利于解鏈）

第一個核苷三磷酸(常常是GTP或ATP)結(jié)合到全酶上，形成“啟動子-全酶-核苷三磷酸”三元起始復(fù)合物。

第二個核苷酸參入，連結(jié)到第一個核苷酸的3'羥基上，形成了第一個磷酸二酯鍵。s因子從全酶上掉下，又去結(jié)合其它的核心酶。

二.原核生物轉(zhuǎn)錄2.轉(zhuǎn)錄過程-轉(zhuǎn)錄啟動第13頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

當s因子從核心酶上脫落后，核心酶與DNA鏈的結(jié)合變得疏松(依靠其蛋白質(zhì)的堿性與酸性核酸之間的非特異性的靜電引力)，可以在模板鏈上滑動，方向為DNA模板鏈的3′→5′，同時將核苷酸逐個加到RNA鏈的3'-OH端，使RNA鏈以5′→3′方向延伸。二.原核生物轉(zhuǎn)錄2.轉(zhuǎn)錄過程-鏈的延伸第14頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

DNA上的解螺旋區(qū)：在RNA鏈延伸的同時，RNA聚合酶繼續(xù)解開它前方的DNA雙螺旋，暴露出新的模板鏈，而后面被解開的兩條DNA單鏈又重新形成雙螺旋，DNA上的解螺旋區(qū)保持約17個堿基對的長度。二.原核生物轉(zhuǎn)錄2.轉(zhuǎn)錄過程-鏈的延伸第15頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

RNA-DNA雜交區(qū)：剛合成出來的RNA鏈與解開的DNA模板鏈之間可形成一小段RNA-DNA雜交區(qū)。隨著核心酶的移動，RNA鏈不斷地延伸，雜交區(qū)也往前延伸，但后面的雜交區(qū)隨著DNA雙螺旋的回復(fù)，RNA鏈逐漸被置換出來，因此，雜交區(qū)也保持著固定一小段。二.原核生物轉(zhuǎn)錄2.轉(zhuǎn)錄過程-鏈的延伸第16頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

DNA分子上有終止轉(zhuǎn)錄的特殊信號，也是特定的核苷酸序列，稱為終止子。核心酶能識別終止子，停止轉(zhuǎn)錄。

這一過程有時需要一種蛋白質(zhì)——

因子的幫助（當終止信號較弱時）；有時不需要（當終止信號較強時）。

核心酶釋放出RNA，自己也離開DNA。

DNA上的解鏈區(qū)重新形成雙螺旋。二.原核生物轉(zhuǎn)錄2.轉(zhuǎn)錄過程-終止第17頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五真核細胞的轉(zhuǎn)錄比較復(fù)雜。真核基因的順式作用元件（cis-actingelement），即DNA上對基因表達有調(diào)節(jié)活性的特定序列，按其功能可分為啟動子、增強子（enhancer）和沉默子（silencer）等。真核生物的轉(zhuǎn)錄，是由RNA聚合酶與這些元件相互作用，在蛋白質(zhì)輔助因子ρ的協(xié)同下完成的。三.真核生物轉(zhuǎn)錄1.真核細胞的聚合酶第18頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五三.真核生物轉(zhuǎn)錄1.真核細胞的聚合酶第19頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

真核細胞啟動子是指通用(基礎(chǔ))轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶II通過相互作用，組裝轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體的位點。三.真核生物轉(zhuǎn)錄2.真核細胞的啟動子

第20頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五三.真核生物轉(zhuǎn)錄2.真核細胞的啟動子

第21頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五第22頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五真核生物啟動子的多元性

啟動子包括

TATA序列(TATAbox)：-25-35TATAbox的作用：使轉(zhuǎn)錄精確地起始；啟動子是指確保轉(zhuǎn)錄精確而有效地起始的DNA序列；TATA序列也叫核心啟動元件(corepromoterelement)第23頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五(GCbox)GCCACACCC或GGGCGGG序：-80-110;GC區(qū)主要控制轉(zhuǎn)錄起始頻率。CCAAT序列(CAATbox)：-70-80CAAT區(qū)主要控制轉(zhuǎn)錄起始頻率。第24頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五第25頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

增強子、及其對轉(zhuǎn)錄的影響

a增強子是指能使和它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率明顯增加的DNA序列；

b增強效應(yīng)十分明顯，一般能使基因轉(zhuǎn)錄頻率增加10-200倍；

c增強效應(yīng)與其位子和取向無關(guān)；三.真核生物轉(zhuǎn)錄3.真核細胞的增強子

第26頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五d大多為重復(fù)序列，一般長度為50bp，其內(nèi)部常含有一個核心序列(G)TGGA/TA/TA/T(G)；e增強效應(yīng)有嚴密的組織和細胞特異性；f沒有基因?qū)Ｒ恍?；g許多增強子還受外部信號的調(diào)控。第27頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

Enhancer的結(jié)構(gòu)與功能

雙方向性，組織特異性，位點非專一性

----Enhancer由兩個以上的增強子成分(EnhancerElement)組成

----EnhancerElement必需由兩個緊密相連,具有間距效應(yīng)的

增強子元(Enhanson）組成

----各個Enhanson(cis-factor)與激活蛋白(trans-factor)結(jié)合

增強特異性轉(zhuǎn)錄

第28頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

En.Elem.En.ElemEn.Elem.-250-180

coreCTCIITCIsphIIsphI

Ap3Ap2Ap1e.g.SV40Enhancer(-179~-250)

遠距離控制，無方向性

mRNA

+1GCCAATTATA

促進轉(zhuǎn)錄復(fù)合體基本轉(zhuǎn)錄復(fù)合體第29頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五RNAinterference(RNAi)representsamechanisminventedbynaturetoprotectthegenome.Inthepastfewyearsthefieldhasemergedatasurprisinglyhighpace.

ThewholestorystartedwhenFireetal.(1998)identifieddoublestrandedRNA(dsRNA)asthemediatorofgenesilencinginC.elegansandreferredtothetermRNAi.三.真核生物轉(zhuǎn)錄4.基因沉默-iRNA

WhatisRNAinterference(RNAi)第30頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五TheunderlyingmolecularmechanismofgenesilencingprovidesuswithshortinterferingRNAs(siRNAs)whichallowstotargetanygenewithhighspecificityandefficiency.WhatisRNAinterference(RNAi)第31頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五Whatistheoutcome,indeed?Introductionintocellsofadouble-strandedRNAcorrespondingtoanexpressedgeneleadstodown-regulationofthatgenethroughdegradationofitsmRNA第32頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五HowdoesthesiRNAwork?Introductionofsyntheticsmalldouble-strandoligonucleotide(21-23ntlength)correspondingtospecificgeneintocellwillspecificallyknockdowncorrespondingmRNAinthecell第33頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五Anenzymecomplex(Dicer),wasdiscoveredinDrosophila(Bernsteinetal.,2001)aspartofaconservedDicerfamilyexpressedinorganismsundergoingRNAi.DicercontainsdomainsfordsRNAbinding,RNAunwinding,andribonucleaseactivity,andisassociatedwithadditionalproteinstodrivethecleavageofdsRNAinanATPdependentmanner.TheresultingsiRNAaspartofamultiproteinRNA-inducingsilencingcomplex(RISC)istargetedtothecomplementaryRNAspecieswhichisthencleaved.第34頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五siRNA:SmallinterferingRNA第35頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五第36頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五真核基因轉(zhuǎn)錄的蛋白因子為蛋白質(zhì)編碼的基因的準確轉(zhuǎn)錄受多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。RNA聚合酶必須在特定的轉(zhuǎn)錄因子的參與下才能起始轉(zhuǎn)錄。至今有20種以上蛋白因子參與轉(zhuǎn)錄起始，可分為三類：通用(基礎(chǔ))轉(zhuǎn)錄因子(basaltranscriptionalactivity)：

包括TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、TFIIH、TFIIJ等。這些蛋白因子對于準確轉(zhuǎn)錄起始是必需的。三.真核生物轉(zhuǎn)錄5.轉(zhuǎn)錄因子

第37頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五2.啟動子特異性轉(zhuǎn)錄激活蛋白(promoter-specifictranscriptionalactivators)它們通過與啟動了附近或遠離啟動子的DNA分子上調(diào)控區(qū)(增強子)相結(jié)合，作用于轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體組裝過程，具有DNA結(jié)合域和激活轉(zhuǎn)錄所需要的激活結(jié)構(gòu)域。第38頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五一般情況，細胞中通用轉(zhuǎn)錄因子的種類同基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控蛋白因子(包括轉(zhuǎn)錄激活蛋白、輔助激活蛋白、負調(diào)控蛋白因子等)相比，數(shù)量較少，但在細胞中的含量是豐富的；這些通用轉(zhuǎn)錄因子在啟動子區(qū)同RNA聚合酶一起組裝成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物;第39頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五特異性調(diào)控蛋白因子種類繁多，但含量即非常之少，它們通過其DNA結(jié)合域識別特定的DNA序列，這種特性決定了特異性開或關(guān)。第40頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

SpecificTrans-factorcharacteristics

l

多為變構(gòu)蛋白，具有兩個功能結(jié)構(gòu)域（domain）DNA-bindingdomainactivationdomainDNA-bindingdomainDimerizationdomain(insomedimerfactor)activationdomain第41頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

Transcriptionactivationdomainhaveaveryhighproportionofacidicaminoacid(alsocalledacidicdomainoracidblobsornegativenoodles)

Trans-factor的活性調(diào)節(jié)受到嚴格的信號因子的調(diào)控signal一般狀態(tài)（無活性）bindingDNA

變構(gòu)活化狀態(tài)激活轉(zhuǎn)錄第42頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五幾種常見的DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)第43頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五Helix-turn-helixmotif第44頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五Helix-turn-helixdomainandbindingwithDNA第45頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五亮氨酸“拉鏈”式二聚體亮氨酸“拉鏈”(leucinezipper)指調(diào)控蛋白中發(fā)現(xiàn)的一段富含亮氨酸序列，這個區(qū)域易于形成兩性-螺旋或卷曲螺旋構(gòu)象，這些蛋白能形成穩(wěn)定的二聚體。轉(zhuǎn)錄因子在模板DNA上形成同源(或異源)二聚體的能力決定了基因表達。第46頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五亮氨酸“拉鏈”式二聚體在“拉鏈”式蛋白中，“拉鏈”區(qū)以外的氨基酸在都呈堿性，具有結(jié)合DNA的本領(lǐng)，“拉鏈”的吻合有利于形成平行的二重DNA結(jié)合區(qū)。第47頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五Monomeric&dimericstructureofLuczipperLuczipperdimerization第48頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五Zincfingerregion一對組氨酸殘基TFIIIA蛋白具有9個相似的重復(fù)單位每個單位大約由30個氨基酸殘基組成一對半胱氨酸zinc

Zincfingerregion第49頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His單個鋅指的保守區(qū)序列第50頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五典型真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控示意圖通用轉(zhuǎn)錄因與RNA聚合酶II在啟動處組裝成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體;不同的基因調(diào)控蛋白結(jié)合到各自的基因調(diào)控序列上;轉(zhuǎn)錄起始速率是由調(diào)控蛋白與通用轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體相互作用而得以調(diào)整.第51頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五基因調(diào)控序列—啟動子—調(diào)控蛋白的spatial關(guān)系A(chǔ).結(jié)合于增強子處的調(diào)控蛋白NtrC與細