植物基因克隆的載體優(yōu)秀課件

第三章基因克隆載體

Vectors載體(vector)：在基因工程中，攜帶目的基因或DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的DNA分子。一、載體的概念作為載體使用的必須是能進(jìn)入植物寄主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的核酸分子。二、載體的功能1、運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞；2、為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力；3、為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件。按載體性質(zhì)分四、分類(lèi)質(zhì)粒載體、噬菌體載體和人工染色體目前發(fā)展起來(lái)的植物基因轉(zhuǎn)移的載體系統(tǒng)分為兩大類(lèi)：一是病毒載體系統(tǒng)二是質(zhì)粒載體系統(tǒng)※（1）有復(fù)制起點(diǎn)※（2）具有若干個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶的單一識(shí)別位點(diǎn)※（3）具備合適的篩選標(biāo)記※（4）具備合適的拷貝數(shù)目（5）分子量要相對(duì)較?。?）在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性要高（7）易分離純化

※表示載體必須具備的條件五、基因工程載體必須具備的條件第一節(jié)質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒(plasmid)獨(dú)立于細(xì)菌染色體外的能獨(dú)立復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，偶見(jiàn)于鏈霉菌和酵母比病毒還簡(jiǎn)單的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，一旦離開(kāi)寄主細(xì)胞則無(wú)法繁殖。二、質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)和命名1946年，第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌質(zhì)粒是大腸桿菌的F因子，它的發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌遺傳學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。1957年，日本學(xué)者報(bào)道了志賀菌(Shigella)中質(zhì)粒介導(dǎo)抗生素抗性的轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。（一）質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)在以后的20多年中，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)各種細(xì)菌攜帶質(zhì)粒，且它們的表型特征已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了致育性和藥物抗性的范圍。70年代末，隨著遺傳工程的崛起，質(zhì)粒作為載體己被廣泛應(yīng)用在遺傳工程和分子生物學(xué)的研究中。對(duì)很多不同微生物中的質(zhì)粒進(jìn)行了基因克隆和生物學(xué)功能分析，使質(zhì)粒的生物學(xué)跨入了空前繁榮的研究時(shí)期。二、質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)和命名（一）質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)（二）質(zhì)粒的命名原則質(zhì)?？梢砸罁?jù)其表型效應(yīng)、大小、復(fù)制特性、轉(zhuǎn)移性或親和性差異劃分為不同的類(lèi)型。最初發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒均由研究者根據(jù)表型、大小等特征自行命名，如F因子(fertilityfactor，致育因子)、R質(zhì)粒(resistancefactor，抗性質(zhì)粒)和Col質(zhì)粒(colicin，大腸桿菌毒素質(zhì)粒)等。隨著研究工作的深入和發(fā)展，愈來(lái)愈多的含有質(zhì)粒的微生物新類(lèi)群和新質(zhì)粒被發(fā)現(xiàn)，但由于缺乏統(tǒng)一的命名規(guī)則而導(dǎo)致文獻(xiàn)中質(zhì)粒名稱(chēng)的混亂。命名舉例pBR322是最早構(gòu)建的質(zhì)粒之一“p”表明它是一個(gè)質(zhì)?！癇R”表示最初構(gòu)建它的兩個(gè)人的名字首字母：Bolivar和Rodriguez“322”區(qū)別于該實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的其他質(zhì)粒，如pBR325、pBR327等三、質(zhì)粒的基本特性（1）質(zhì)粒分子較小一般為1-200Kb，最大的可達(dá)1400kb(如苜蓿根瘤菌質(zhì)粒pRm141a)。（2）編碼特性——表型多樣化如抗生素的抗性、產(chǎn)生抗生素、降解復(fù)雜有機(jī)化合物、產(chǎn)生毒素（如大腸桿菌素、腸毒素）、合成限制性?xún)?nèi)切酶或修飾酶、生物固氮和殺蟲(chóng)等。3、質(zhì)粒的存在形式體外理化因子作用下可形成下列形式開(kāi)環(huán)DNA分子(oc-DNA)線性DNA分子(l-DNA)超螺旋DNA分子(scDNA)生理?xiàng)l件下：以共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子(Covalentclosecircular,ccc-DNA)形式存在三、質(zhì)粒的基本特性在變性條件下，質(zhì)?？沙蔀閱捂淒NA分子（ss-DNA）。三、質(zhì)粒的基本特性（5）自主復(fù)制性

攜帶有自己的復(fù)制起始區(qū)（ori）控制質(zhì)粒拷貝數(shù)的基因能獨(dú)立于宿主細(xì)胞的染色體DNA而自主復(fù)制（6）不相容性同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒在同一細(xì)菌中不能相容，不同復(fù)制系統(tǒng)的質(zhì)粒在同一細(xì)菌中可共存

（7）可擴(kuò)增性質(zhì)粒就其復(fù)制方式而言分為兩類(lèi)

松弛型復(fù)制嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制（8）可轉(zhuǎn)移性在天然條件下，大多質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)細(xì)菌接合作用從一種宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種宿主內(nèi)。 非結(jié)合細(xì)菌可通過(guò)人工方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化五、質(zhì)粒載體的構(gòu)建（一）為什么要進(jìn)行質(zhì)粒載體的構(gòu)建？天然質(zhì)粒載體具有一定的缺陷天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿(mǎn)足基因工程中克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。

方法：重組，“拼拼接接，挖肉補(bǔ)瘡”

（1）pSC101，第一個(gè)用于基因克隆的天然質(zhì)粒，分子長(zhǎng)9.1kb。但只有一個(gè)EcoRI切點(diǎn)充當(dāng)克隆位點(diǎn)，Tetr作為篩選標(biāo)志。分子量大，拷貝數(shù)低（2）ColE1質(zhì)?！Y選標(biāo)志不理想ColE1質(zhì)粒的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素E1（colicinE1）。colicinE1能殺死不含ColE1質(zhì)粒的菌，形成“噬菌斑”。

唯一的克隆位點(diǎn)EcoRI正好位于這個(gè)基因的內(nèi)部。因此可通過(guò)插入失活篩選。但細(xì)菌群體容易自發(fā)突變出抗colicinE1的細(xì)胞…….（三）質(zhì)?？寺≥d體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建過(guò)程的原則選擇合適的出發(fā)質(zhì)粒（親本質(zhì)粒）。正確獲得構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的元件。組裝合適的選擇標(biāo)記基因。選用合適的啟動(dòng)子。在能達(dá)到預(yù)期目的的前提下，構(gòu)建質(zhì)粒克隆載體的構(gòu)建過(guò)程力求簡(jiǎn)單。四、常見(jiàn)的人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體pBR322是F.Bolivar和R.L.Rodriguez于

20世紀(jì)70年代后期構(gòu)建出來(lái)的，也是第一個(gè)經(jīng)人工改造的一種較為理想的大腸桿菌質(zhì)粒載體，應(yīng)用廣泛?，F(xiàn)在已經(jīng)被許多更優(yōu)良的新型克隆載體所替代。（一）pBR322系列pSP2124質(zhì)粒的Ampr基因（1）元件來(lái)源①?gòu)?fù)制起點(diǎn)

oripMB1系列（來(lái)源于ColE1）的高拷貝型復(fù)制起點(diǎn)②

Ampr基因③Tetr基因pSC101的Tetr基因。（2）長(zhǎng)度4363bp（3）選擇標(biāo)記氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。（4）克隆位點(diǎn)其中9個(gè)會(huì)導(dǎo)致Tetr基因失活（如BamHI、HindⅢ、SalI）；3個(gè)會(huì)導(dǎo)致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。24個(gè)克隆位點(diǎn)。（5）pBR322的優(yōu)點(diǎn)①雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記

插入失活，分兩次先后選擇：沒(méi)有獲得載體的寄主細(xì)胞

在Amp或Tet中都死亡。獲得載體的寄主細(xì)胞

在Amp或Tet其中之一中死亡。外源基因BamHIAmp中存活但在Tet中死亡外源基因PstITet中存活但在Amp中死亡加入氯霉素之后，每個(gè)細(xì)胞可達(dá)1000~3000copy④安全失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mob（mobilization）。不能通過(guò)接合轉(zhuǎn)移。③

高拷貝數(shù)②分子小，克隆能力大載體越小越好。>10kb的DNA在純化過(guò)程中容易斷裂。①刪除mob識(shí)別位點(diǎn)（如質(zhì)粒pBR327、pAT153等）。pAT153：從pBR322上切去HaeII片斷，既除去了mob識(shí)別位點(diǎn)，又增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)。（7）PBR322的改進(jìn)pBR325：在pBR322位點(diǎn)上接入一段來(lái)自噬菌體PICm的HaeII酶切片斷（帶有氯霉素抗性基因cmlr）。cmlr上也帶一個(gè)EcoRI位點(diǎn)。使EcoRI也成為插入失活型位點(diǎn)。②

改造EcoRI位點(diǎn)（二）pUC系列UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基礎(chǔ)上改造而成。屬正選擇載體。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19pUC18/19的結(jié)構(gòu)復(fù)制起點(diǎn)：來(lái)自pBR322質(zhì)粒。Ampr基因：來(lái)自pBR322質(zhì)粒lacZ的啟動(dòng)子：來(lái)自大腸桿菌lacZ’基因：大腸桿菌lacZ的-肽鏈序列，是LacZ的氨基端片斷多克隆位點(diǎn)：10個(gè)連續(xù)的單酶切位點(diǎn)，位于lacZ’基因的5’端。pUC18/19的結(jié)構(gòu)pUC18/19質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)①更小的分子量：如pUC18為2682bp，pUC8為2750bp。②選擇方便：X-gal顯色、抗菌素雙重直接選擇。③克隆便利：具有多克隆位點(diǎn)（MCS），使有兩個(gè)不同粘性末端的外源DNA方便地插入。④測(cè)序方便：pUC的MCS與M13噬菌體載體的MCS完全相同，便于把外源DNA轉(zhuǎn)移到M13載體上測(cè)序。選擇原理Ampicillin抗性和lacZ的肽互補(bǔ)（藍(lán)白斑）相結(jié)合。

藍(lán)白斑篩選X-gal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside）是-半乳糖苷酶的作用底物-半乳糖苷酶作用于X-gal顯色反應(yīng)-半乳糖苷酶能把無(wú)色的化合物X-gal分解成半乳糖和一個(gè)深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-氯靛藍(lán)誘導(dǎo)物：IPTGIPTG是乳糖的類(lèi)似物。能誘導(dǎo)lac操縱子的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，使受體菌基因組中的lacZ的C端部分和載體的lacZ’肽都表達(dá)，從而互補(bǔ)。但載體MCS上插入外源DNA后，不能產(chǎn)生肽！lacZ的肽互補(bǔ)-肽（lacZ’基因編碼）：-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片斷（11-41氨基酸）。lacZ只有在4聚體的狀態(tài)下才有功能。pUC質(zhì)粒載體上的lacZ’編碼的肽與這個(gè)缺失突變的-半乳糖苷酶“互補(bǔ)”，使它能形成4聚體，又能分解X-gal，產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。質(zhì)粒克隆載體引入與lacZ’互補(bǔ)的E.coli，在含IPTG和X-gal的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，菌落呈藍(lán)色。如果在MCS區(qū)插入一個(gè)外源片斷，就會(huì)使lacZ’基因失活，引入lacZ’互補(bǔ)的E.coli，肽不能生成，就無(wú)所謂互補(bǔ)，在含IPTG和X-gal的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中X-gal不會(huì)被降解，菌落呈白色。IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果：藍(lán)白斑篩選MCS無(wú)插入時(shí)，互補(bǔ)，藍(lán)菌斑。MCS有插入時(shí)，不互補(bǔ)，白菌斑通過(guò)看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有DNA插入。IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果（三）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒表達(dá)載體Ti（tumor-inducingplasmid）質(zhì)粒：根癌農(nóng)桿菌含有一種內(nèi)源質(zhì)粒，當(dāng)農(nóng)桿菌同植物接觸時(shí)，Ti質(zhì)粒中有一段DNA，稱(chēng)為T(mén)-DNA（transfer-DNA），能轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組中，并導(dǎo)致冠癭瘤的形成。大小因種類(lèi)而異，在200-250kb之間。章魚(yú)堿型農(nóng)桿堿型農(nóng)桿菌素型琥珀堿型Ti質(zhì)粒分為4個(gè)功能區(qū)

T-DNA區(qū)：是根癌農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)從Ti質(zhì)粒上切割下來(lái)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA，含有編碼植物激素和冠癭堿的基因

Vir區(qū)：Vir區(qū)上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使根癌農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性

Con區(qū)：該區(qū)段上存在與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因，調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移

Ori區(qū)：Ori區(qū)上的基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制。TiPlasmidT-DNA區(qū)LeftborderRightbordervir

區(qū)Ori區(qū)Con區(qū)T-DNA區(qū)Ti質(zhì)粒進(jìn)入植物細(xì)胞的只是一小部分，約25kb。能轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi)的DNA片斷稱(chēng)為T(mén)-DNA（transfer-DNA）T-DNA左右兩端邊界各有一個(gè)25bp長(zhǎng)的正向重復(fù)序列(左邊界，右邊界)，在不同Ti質(zhì)粒中高度保守。

邊界序列對(duì)T-DNA轉(zhuǎn)移和整合不可缺少；已證實(shí)只要保留兩端邊界序列，雖然中間序列不同程度被外源片斷所替換，仍可轉(zhuǎn)移整合到植物基因組中－

Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化的理論依據(jù)。T-DNA進(jìn)入植物細(xì)胞后，能以單拷貝或多拷貝形式隨機(jī)整合到染色體DNA上。且T-DNA上的基因能被植物轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)識(shí)別，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。在T-DNA區(qū)已鑒定出多種基因章魚(yú)堿合成基因（ocs）或胭脂堿合成基因（nos）或其他胭脂堿合成基因。細(xì)胞分裂素合成基因位點(diǎn)Shi和

控制植物生長(zhǎng)素合成的基因位點(diǎn)Roi。在兩種基因表達(dá)產(chǎn)物的共同作用下，破壞植物內(nèi)源激素的平衡，干擾植物細(xì)胞的正常分裂，引發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤。Vir區(qū)Ti質(zhì)粒T-DNA上游的一組基因，表達(dá)產(chǎn)物可激活T-DNA向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移，引發(fā)腫瘤，顯示致病性。Con區(qū)含有與農(nóng)桿菌之間接合轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因，受宿主合成的冠癭堿激活，使Ti質(zhì)粒在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移。Ori區(qū)調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制Ti質(zhì)粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的過(guò)程①根癌農(nóng)桿菌對(duì)植物細(xì)胞的識(shí)別和附著②根癌農(nóng)桿菌對(duì)植物信號(hào)物質(zhì)的感受③根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的vir基因以及染色體上操縱子的活化④vir區(qū)基因被激活，virD基因編碼的核酸內(nèi)切酶分別將T-DNA的RB序列和LB序列切出單鏈切口，釋放出T-DNA的單鏈線性拷貝，T-DNA復(fù)合體的產(chǎn)生⑤T-DNA復(fù)合體在RB序列的引導(dǎo)下定向地穿過(guò)農(nóng)桿菌的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、進(jìn)入植物細(xì)胞壁并整合到植物的染色體基因組中Ti質(zhì)粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞示意圖天然的基因工程天然的基因工程1、Ti質(zhì)粒是一種天然的質(zhì)粒表達(dá)載體，外源基因組裝在T-DNA上，有可能引入植物細(xì)胞。2、轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞只能分裂，而不能分化成植株，不能達(dá)到選育轉(zhuǎn)基因植物的目的。3、通過(guò)改造T-DNA，構(gòu)建了一系列Ti質(zhì)粒表達(dá)載體。Ti質(zhì)粒本身存在的缺陷轉(zhuǎn)化細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生植物激素，從而破壞受體激素的平衡，阻礙轉(zhuǎn)化細(xì)胞的再生，因此需將參與合成植物生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的基因剔除冠癭堿合成基因?qū)D(zhuǎn)基因植物意義不大，因此也可刪除Ti質(zhì)粒分子量過(guò)大（200～800kb），小一些利于操作，因此可除去不必要的大片段DNA需加入大腸桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)，以利于在大腸桿菌中的操作和保存pCAMBIA1300圖譜潮霉素抗性基因左邊界右邊界復(fù)制起點(diǎn)卡那霉素抗性基因穿梭質(zhì)粒載體人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記、可以在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。

常用的穿梭質(zhì)粒載體大腸桿菌枯草桿菌穿梭載體大腸桿菌釀酒酵母穿梭載體大腸桿菌動(dòng)物細(xì)胞穿梭載體穿梭質(zhì)粒

能在兩種不同的生物中復(fù)制的載體。例如既能在原核生物(如大腸桿菌)中復(fù)制，又能在真核細(xì)胞(如酵母)中復(fù)制的載體。很多酵母菌的穿梭載體，用于功能互補(bǔ)法分離、鑒定真核生物基因的研究

穿梭載體的優(yōu)點(diǎn)①利用大腸桿菌進(jìn)行基因克隆、表達(dá)

②也能利用其它細(xì)胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等）進(jìn)行基因表達(dá)。③可以自如地在兩種不同寄主細(xì)胞之間來(lái)回轉(zhuǎn)移基因。

TA克隆載體（T載體）由Invitrogen公司發(fā)展而來(lái)的商業(yè)性試劑盒，用于PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序。原理：利用Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3’末端加上一個(gè)非模板依賴(lài)的A，而T載體是一種帶有3’T突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)（MCS）中。優(yōu)點(diǎn)：操作最簡(jiǎn)單，快速和高效，是Taq聚合酶PCR產(chǎn)物的最佳克隆方法TA克隆的優(yōu)點(diǎn)不需使用含限制酶序列的引物不需把PCR產(chǎn)物做平端處理不需在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上加接頭，即可直接進(jìn)行克隆。

注意事項(xiàng)1.要獲得目的基因的TA克隆，PCR產(chǎn)物的特異性要好。

2.PCR產(chǎn)物在TA克隆前要通過(guò)純化。

3.在PCR產(chǎn)物回收、純化過(guò)程中防止外來(lái)DNA