MicroRNA-現(xiàn)代專題講座2012

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RNA的分類細(xì)胞核和胞質(zhì)線粒體功能核蛋白體RNArRNAmtrRNA核蛋白體組成成分信使RNAmRNAmtmRNA蛋白質(zhì)合成模板轉(zhuǎn)運(yùn)RNAtRNAmttRNA轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸不均一核RNAhnRNA成熟mRNA的前體小核RNAsnRNA參與hnRNA剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)小胞漿RNAscRNA/7SL-RNA蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成的信號(hào)識(shí)別體的組成成分第一頁(yè)，共66頁(yè)。2小RNA分子本身又包含若干種RNA，根據(jù)小RNA的生成、結(jié)構(gòu)和功能可分為三類：miRNA（microRNA)siRNA(shortinterferingRNA)

其他小RNA第二頁(yè)，共66頁(yè)。3一、miRNA定義及特征第三頁(yè)，共66頁(yè)。4命名原則(1)將物種縮寫(xiě)置于miRNA之前，如hsa-miR-195。(2)確定命名規(guī)則之前發(fā)現(xiàn)的miRNA，如let-7，則保留原來(lái)名字。(3)microRNA簡(jiǎn)寫(xiě)成miR，再根據(jù)其被克隆的先后順序加上阿拉伯?dāng)?shù)字，如miR-21。(4)高度同源的miRNA在數(shù)字后加上英文小寫(xiě)字母(a、b、c??)，如miR-199a和miR-199b。第四頁(yè)，共66頁(yè)。5WhataremicroRNAs？（1）miRNA是廣泛存在于真核生物中的一組短小的、不編碼蛋白質(zhì)的RNA家族，由19-25個(gè)核苷酸組成的單鏈RNA（3′端可有1-2個(gè)堿基長(zhǎng)度變化）；miRNA表達(dá)具有組織特異性和階段特異性。第五頁(yè)，共66頁(yè)。6第六頁(yè)，共66頁(yè)。7WhataremicroRNAs？（2）miRNA具有高度保守性，即各種miRNA都能在其他種系中找到同源體；miRNA獨(dú)有的特征：其5＇端第一個(gè)堿基對(duì)U有強(qiáng)烈的傾向性，而對(duì)G卻有抗性，但第二到第四個(gè)堿基缺乏U，一般來(lái)講，除第四個(gè)堿基外，其他位置堿基通常都缺乏CmiRNA執(zhí)行一定的生物學(xué)功能：對(duì)與其互補(bǔ)的mRNA表達(dá)水平具有調(diào)節(jié)作用；一些偏大miRNA可能參與基因組的重組裝（27nt）；第七頁(yè)，共66頁(yè)。8第八頁(yè)，共66頁(yè)。9miRNA的成熟體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明miRNA的生成至少需要兩個(gè)步驟：

1）由長(zhǎng)的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA)生成70nt左右的miRNA前體（pre-miRNA)，該過(guò)程發(fā)生在細(xì)胞核;2)將pre-miRNA加工為成熟miRNA，該過(guò)程發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)。第九頁(yè)，共66頁(yè)。10第十頁(yè)，共66頁(yè)。11第十一頁(yè)，共66頁(yè)。12第十二頁(yè)，共66頁(yè)。13第十三頁(yè)，共66頁(yè)。14第十四頁(yè)，共66頁(yè)。15第十五頁(yè)，共66頁(yè)。16Pre-miRNAPre-miRNA是由內(nèi)源性基因間區(qū)或內(nèi)含子的DNA反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄而來(lái),它是一種長(zhǎng)約70nt的非編碼RNA,具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)也即發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)。Pre-miRNA在Dicer的作用下可被剪切成miRNAmiRNA只是pre-miRNA莖中的一個(gè)臂第十六頁(yè)，共66頁(yè)。17miRNA與靶mRNA的作用模式：二者不完全互補(bǔ)，即二者不完全配對(duì)結(jié)合時(shí)，主要影響翻譯過(guò)程而對(duì)mRNA的穩(wěn)定性無(wú)任何影響。如線蟲(chóng)的lin-4二者完全互補(bǔ)，即二者完全配對(duì)結(jié)合后，類似siRNA與靶mRNA的結(jié)合，特異性的切割mRNA。如miR39/miR171兩種模式均具備。當(dāng)其與靶mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)，直接靶向切割mRNA，而不完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)起調(diào)節(jié)基因翻譯作用。如let-7果蠅/線蟲(chóng)第十七頁(yè)，共66頁(yè)。18miRNA與siRNA的作用機(jī)制：第十八頁(yè)，共66頁(yè)。19miRNA與siRNA的區(qū)別：

miRNA產(chǎn)生：細(xì)胞內(nèi)RNA的固有組分之一（正常）來(lái)源：內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本直接來(lái)源：發(fā)夾狀pre-miRNA結(jié)構(gòu)：?jiǎn)捂溁パa(bǔ)性：不完全互補(bǔ)，存在錯(cuò)配現(xiàn)象對(duì)靶RNA特異性：相對(duì)較低，一個(gè)突變不影響miRNA的的效應(yīng)途徑：miRNA途徑對(duì)RNA的影響：在RNA代謝的各個(gè)層面進(jìn)行調(diào)控功能：調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)在蛋白質(zhì)合成水平發(fā)揮作用，與mRNA的穩(wěn)定性無(wú)關(guān)

siRNARNAi的活性形式，病毒感染和人工插入dsRNA之后誘導(dǎo)而產(chǎn)生（異常）

轉(zhuǎn)基因或病毒ＲＮＡ（外源）長(zhǎng)dsRNA雙鏈，3‘端有2個(gè)非配對(duì)堿基，通常為UU完全互補(bǔ)較高，一個(gè)突變即引起RNAi沉默效應(yīng)的改變

RNAi途徑降解靶mRNA抑制轉(zhuǎn)座子活性和病毒感染在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮作用，影響mRNA的穩(wěn)定性第十九頁(yè)，共66頁(yè)。20miRNA與siRNA的聯(lián)系：均為Dicer的產(chǎn)物：長(zhǎng)度均為22nt左右

5＇端是磷酸基

3＇端是羥基均需Argonaute家族蛋白的存在同為RISC的組分二者進(jìn)化關(guān)系上可能的兩種推論：

siRNA是miRNA的補(bǔ)充

miRNA進(jìn)化過(guò)程中替代了siRNA沉默機(jī)制有重疊第二十頁(yè)，共66頁(yè)。21二、microRNAs的生物學(xué)功能第二十一頁(yè)，共66頁(yè)。22第二十二頁(yè)，共66頁(yè)。23第二十三頁(yè)，共66頁(yè)。24第二十四頁(yè)，共66頁(yè)。25第二十五頁(yè)，共66頁(yè)。26第二十六頁(yè)，共66頁(yè)。27第二十七頁(yè)，共66頁(yè)。28第二十八頁(yè)，共66頁(yè)。29miR-155與炎癥反應(yīng)miR-155基因的表達(dá)與炎性刺激因子密切相關(guān)。在巨噬細(xì)胞中，炎癥介質(zhì)（聚肌胞苷酸Poly（I:C）、干擾素-β（IFN-β））；細(xì)菌脂多糖(LPS)；Toll樣受體（Toll-likereceptors,TLRs）配體誘導(dǎo)miR-155大量表達(dá)。第二十九頁(yè)，共66頁(yè)。30類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）

Stancyzk等用TNF-α處理RA病人滑液成纖維細(xì)胞，miR-155表達(dá)水平明顯上調(diào)。用炎癥因子IL-1β、polyI:C、LPS和細(xì)菌脂蛋白刺激RA病人后，miR-155在滑液中表達(dá)水平明顯高于骨關(guān)節(jié)炎病人。RA滑液?jiǎn)魏思?xì)胞中miR-155表達(dá)明顯高于外周血單核細(xì)胞。MMPs1、MMPs3屬于蛋白水解酶類，是RA損傷程度的標(biāo)志。miR-155表達(dá)增加能抑制由TOLL樣受體配體和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的MMPs1、MMPs3生成。miR-155可能作為一種保護(hù)性的miRNA下調(diào)特定MMPs的表達(dá)，減少組織損傷引發(fā)的炎癥反應(yīng)。第三十頁(yè)，共66頁(yè)。31miR-155與免疫反應(yīng)

活化的B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞中bic/miR-155表達(dá)顯著增加。在骨髓CD14+單核細(xì)胞中，miR-155表達(dá)水平是外周血中的4.4倍。Tili等發(fā)現(xiàn)miR-155在Th細(xì)胞分化、T細(xì)胞依賴性抗體反應(yīng)、細(xì)胞因子生成的免疫過(guò)程中起著重要作用。第三十一頁(yè)，共66頁(yè)。32miR-155與腫瘤在甲狀腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、胰腺癌、肺癌等實(shí)體瘤中，miR-155高表達(dá)，預(yù)示預(yù)后不良。miR-155在B細(xì)胞淋巴瘤、急性髓性白血病M4、M5型中、慢性淋巴細(xì)胞白血病表達(dá)增加。Nikiforava等檢測(cè)甲狀腺癌的乳頭狀型、濾泡狀癌型、末分化癌型中，miR-155表達(dá)分別上調(diào)9.5、5.5、13.2倍。第三十二頁(yè)，共66頁(yè)。33第三十三頁(yè)，共66頁(yè)。34DLBCL:彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤CLL:慢性淋巴細(xì)胞白血病

ABC：活化B淋巴細(xì)胞GC：生發(fā)中心第三十四頁(yè)，共66頁(yè)。35第三十五頁(yè)，共66頁(yè)。36第三十六頁(yè)，共66頁(yè)。37第三十七頁(yè)，共66頁(yè)。38

三、miRNA研究方法第三十八頁(yè)，共66頁(yè)。39miRNA研究思路表達(dá)譜分析生物信息學(xué)分析miRNA研究miRNA表達(dá)調(diào)控miRNA功能研究miRNA作用機(jī)理表觀遺傳學(xué)過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)抑制表達(dá)實(shí)驗(yàn)靶標(biāo)確認(rèn)信號(hào)通路探討第三十九頁(yè)，共66頁(yè)。40面臨的挑戰(zhàn)：尋找一種有效方法來(lái)研究miRNA將是目前面臨的首要問(wèn)題。同時(shí)又將產(chǎn)生一系列問(wèn)題：如何分離miRNA分子？如何尋找miRNA分子作用的靶基因？如何研究miRNA與靶mRNA之間的關(guān)系？第四十頁(yè)，共66頁(yè)。413.1尋找miRNA的方法：A.分子信息學(xué)的方法應(yīng)用計(jì)算機(jī)的方法如MirScan來(lái)尋找miRNA分子在線蟲(chóng)及脊椎動(dòng)物體內(nèi)取得了巨大的成功。B.分子生物學(xué)的方法miRNABioinfoanalysis1:miRNA序列及同源性分析2:miRNA靶標(biāo)的計(jì)算機(jī)分析相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)：第四十一頁(yè)，共66頁(yè)。42A.分子信息學(xué)篩選miRNA原理出發(fā)點(diǎn)為miRNA前體的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)及miRNA在物種間的保守性。miRNA基因可能定位于編碼蛋白基因的內(nèi)含子區(qū)域（有意義鏈或反意義鏈）及遠(yuǎn)離任何已知基因的基因間區(qū)域。有時(shí)幾個(gè)發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)以多順?lè)醋拥男问絽布谝黄?提高尋找miRNA基因準(zhǔn)確性的一些附加條件：1）上游和下游保守序列的數(shù)量；2）候選發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的上游高度保守模序的存在。第四十二頁(yè)，共66頁(yè)。43B.分子生物學(xué)的方法NothernblotMicroarrayQuantitativeReal-timePCR新一代測(cè)序第四十三頁(yè)，共66頁(yè)。44qPCR的方法每次RT只能檢測(cè)1種miRNA特異性高多個(gè)樣品中檢測(cè)同一miRNA價(jià)格較高每次RT能檢測(cè)所有miRNA通用性高適合miRNA的高通量檢測(cè)經(jīng)濟(jì)、方便Loop反轉(zhuǎn)錄PolyA加尾法第四十四頁(yè)，共66頁(yè)。45miRNA表達(dá)量的高通量篩選第四十五頁(yè)，共66頁(yè)。46

miRNAQ-PCRArrayWorkflow第四十六頁(yè)，共66頁(yè)。47miRNA功能研究的方法：

A分子信息學(xué)的手段：MIT的BartelandChrisBurge報(bào)道了一種可以用來(lái)探測(cè)miRNA與其作用的靶基因之間關(guān)系的新的計(jì)算機(jī)方法—TatgetScan。他們針對(duì)已知的每一個(gè)miRNA，掃描mRNA的數(shù)據(jù)庫(kù)——DNA轉(zhuǎn)譯為蛋白的生化信息，搜索與miRNA匹配的片段，然后對(duì)miRNA與mRNA的匹配程度評(píng)分，推測(cè)在三個(gè)或以上物種中獲得高分的mRNA為該miRNA的靶基因。

B分子生物學(xué)方法第四十七頁(yè)，共66頁(yè)。48第四十八頁(yè)，共66頁(yè)。49第四十九頁(yè)，共66頁(yè)。50miRNAfunctionanalysis功能獲得研究：把miRNA導(dǎo)入到細(xì)胞，進(jìn)行研究-miRNAmimics-miRNAexpressionclones功能缺失研究：抑制miRNA的表達(dá)-miRNA抑制劑miRNA抑制劑表達(dá)克隆miRNA的靶標(biāo)確證第五十頁(yè)，共66頁(yè)。51miRNA過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)------miRNA表達(dá)克隆ExpressionTranslationSuppressionAnd/OrmRNACleavageandDegradation第五十一頁(yè)，共66頁(yè)。52使用案例------miRNA前體表達(dá)克隆第五十二頁(yè)，共66頁(yè)。53miRNA抑制表達(dá)實(shí)驗(yàn)------miRNAinhibitorclone第五十三頁(yè)，共66頁(yè)。54miRNA抑制表達(dá)實(shí)驗(yàn)------MechanismofmiRNAinhibitorclone抑制翻譯封閉miRNA的調(diào)節(jié)第五十四頁(yè)，共66頁(yè)。55miRNA靶標(biāo)確證------靶標(biāo)確證克隆構(gòu)建的載體為含雙熒光報(bào)告基因；螢火蟲(chóng)熒光素酶（hLuc)同miRNA靶標(biāo)融合表達(dá)，用于監(jiān)控miRNA對(duì)靶標(biāo)的作用效果；海腎熒光素酶（hRLuc),可作為內(nèi)參進(jìn)行轉(zhuǎn)染和表達(dá)效率檢測(cè)第五十五頁(yè)，共66頁(yè)。56miRNA靶標(biāo)確證------單個(gè)靶標(biāo)鑒定發(fā)光不發(fā)光第五十六頁(yè)