MicroRNA-現(xiàn)代專題講座2012

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RNA的分類細胞核和胞質(zhì)線粒體功能核蛋白體RNArRNAmtrRNA核蛋白體組成成分信使RNAmRNAmtmRNA蛋白質(zhì)合成模板轉(zhuǎn)運RNAtRNAmttRNA轉(zhuǎn)運氨基酸不均一核RNAhnRNA成熟mRNA的前體小核RNAsnRNA參與hnRNA剪接、轉(zhuǎn)運小胞漿RNAscRNA/7SL-RNA蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成的信號識別體的組成成分第一頁，共66頁。2小RNA分子本身又包含若干種RNA，根據(jù)小RNA的生成、結(jié)構(gòu)和功能可分為三類：miRNA（microRNA)siRNA(shortinterferingRNA)

其他小RNA第二頁，共66頁。3一、miRNA定義及特征第三頁，共66頁。4命名原則(1)將物種縮寫置于miRNA之前，如hsa-miR-195。(2)確定命名規(guī)則之前發(fā)現(xiàn)的miRNA，如let-7，則保留原來名字。(3)microRNA簡寫成miR，再根據(jù)其被克隆的先后順序加上阿拉伯數(shù)字，如miR-21。(4)高度同源的miRNA在數(shù)字后加上英文小寫字母(a、b、c??)，如miR-199a和miR-199b。第四頁，共66頁。5WhataremicroRNAs？（1）miRNA是廣泛存在于真核生物中的一組短小的、不編碼蛋白質(zhì)的RNA家族，由19-25個核苷酸組成的單鏈RNA（3′端可有1-2個堿基長度變化）；miRNA表達具有組織特異性和階段特異性。第五頁，共66頁。6第六頁，共66頁。7WhataremicroRNAs？（2）miRNA具有高度保守性，即各種miRNA都能在其他種系中找到同源體；miRNA獨有的特征：其5＇端第一個堿基對U有強烈的傾向性，而對G卻有抗性，但第二到第四個堿基缺乏U，一般來講，除第四個堿基外，其他位置堿基通常都缺乏CmiRNA執(zhí)行一定的生物學(xué)功能：對與其互補的mRNA表達水平具有調(diào)節(jié)作用；一些偏大miRNA可能參與基因組的重組裝（27nt）；第七頁，共66頁。8第八頁，共66頁。9miRNA的成熟體內(nèi)外實驗研究表明miRNA的生成至少需要兩個步驟：

1）由長的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA)生成70nt左右的miRNA前體（pre-miRNA)，該過程發(fā)生在細胞核;2)將pre-miRNA加工為成熟miRNA，該過程發(fā)生在細胞質(zhì)。第九頁，共66頁。10第十頁，共66頁。11第十一頁，共66頁。12第十二頁，共66頁。13第十三頁，共66頁。14第十四頁，共66頁。15第十五頁，共66頁。16Pre-miRNAPre-miRNA是由內(nèi)源性基因間區(qū)或內(nèi)含子的DNA反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄而來,它是一種長約70nt的非編碼RNA,具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)也即發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)。Pre-miRNA在Dicer的作用下可被剪切成miRNAmiRNA只是pre-miRNA莖中的一個臂第十六頁，共66頁。17miRNA與靶mRNA的作用模式：二者不完全互補，即二者不完全配對結(jié)合時，主要影響翻譯過程而對mRNA的穩(wěn)定性無任何影響。如線蟲的lin-4二者完全互補，即二者完全配對結(jié)合后，類似siRNA與靶mRNA的結(jié)合，特異性的切割mRNA。如miR39/miR171兩種模式均具備。當其與靶mRNA完全互補配對，直接靶向切割mRNA，而不完全互補配對時起調(diào)節(jié)基因翻譯作用。如let-7果蠅/線蟲第十七頁，共66頁。18miRNA與siRNA的作用機制：第十八頁，共66頁。19miRNA與siRNA的區(qū)別：

miRNA產(chǎn)生：細胞內(nèi)RNA的固有組分之一（正常）來源：內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本直接來源：發(fā)夾狀pre-miRNA結(jié)構(gòu)：單鏈互補性：不完全互補，存在錯配現(xiàn)象對靶RNA特異性：相對較低，一個突變不影響miRNA的的效應(yīng)途徑：miRNA途徑對RNA的影響：在RNA代謝的各個層面進行調(diào)控功能：調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達在蛋白質(zhì)合成水平發(fā)揮作用，與mRNA的穩(wěn)定性無關(guān)

siRNARNAi的活性形式，病毒感染和人工插入dsRNA之后誘導(dǎo)而產(chǎn)生（異常）

轉(zhuǎn)基因或病毒ＲＮＡ（外源）長dsRNA雙鏈，3‘端有2個非配對堿基，通常為UU完全互補較高，一個突變即引起RNAi沉默效應(yīng)的改變

RNAi途徑降解靶mRNA抑制轉(zhuǎn)座子活性和病毒感染在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮作用，影響mRNA的穩(wěn)定性第十九頁，共66頁。20miRNA與siRNA的聯(lián)系：均為Dicer的產(chǎn)物：長度均為22nt左右

5＇端是磷酸基

3＇端是羥基均需Argonaute家族蛋白的存在同為RISC的組分二者進化關(guān)系上可能的兩種推論：

siRNA是miRNA的補充

miRNA進化過程中替代了siRNA沉默機制有重疊第二十頁，共66頁。21二、microRNAs的生物學(xué)功能第二十一頁，共66頁。22第二十二頁，共66頁。23第二十三頁，共66頁。24第二十四頁，共66頁。25第二十五頁，共66頁。26第二十六頁，共66頁。27第二十七頁，共66頁。28第二十八頁，共66頁。29miR-155與炎癥反應(yīng)miR-155基因的表達與炎性刺激因子密切相關(guān)。在巨噬細胞中，炎癥介質(zhì)（聚肌胞苷酸Poly（I:C）、干擾素-β（IFN-β））；細菌脂多糖(LPS)；Toll樣受體（Toll-likereceptors,TLRs）配體誘導(dǎo)miR-155大量表達。第二十九頁，共66頁。30類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）

Stancyzk等用TNF-α處理RA病人滑液成纖維細胞，miR-155表達水平明顯上調(diào)。用炎癥因子IL-1β、polyI:C、LPS和細菌脂蛋白刺激RA病人后，miR-155在滑液中表達水平明顯高于骨關(guān)節(jié)炎病人。RA滑液單核細胞中miR-155表達明顯高于外周血單核細胞。MMPs1、MMPs3屬于蛋白水解酶類，是RA損傷程度的標志。miR-155表達增加能抑制由TOLL樣受體配體和細胞因子誘導(dǎo)的MMPs1、MMPs3生成。miR-155可能作為一種保護性的miRNA下調(diào)特定MMPs的表達，減少組織損傷引發(fā)的炎癥反應(yīng)。第三十頁，共66頁。31miR-155與免疫反應(yīng)

活化的B細胞、T細胞、巨噬細胞、樹突細胞中bic/miR-155表達顯著增加。在骨髓CD14+單核細胞中，miR-155表達水平是外周血中的4.4倍。Tili等發(fā)現(xiàn)miR-155在Th細胞分化、T細胞依賴性抗體反應(yīng)、細胞因子生成的免疫過程中起著重要作用。第三十一頁，共66頁。32miR-155與腫瘤在甲狀腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、胰腺癌、肺癌等實體瘤中，miR-155高表達，預(yù)示預(yù)后不良。miR-155在B細胞淋巴瘤、急性髓性白血病M4、M5型中、慢性淋巴細胞白血病表達增加。Nikiforava等檢測甲狀腺癌的乳頭狀型、濾泡狀癌型、末分化癌型中，miR-155表達分別上調(diào)9.5、5.5、13.2倍。第三十二頁，共66頁。33第三十三頁，共66頁。34DLBCL:彌漫大B細胞淋巴瘤CLL:慢性淋巴細胞白血病

ABC：活化B淋巴細胞GC：生發(fā)中心第三十四頁，共66頁。35第三十五頁，共66頁。36第三十六頁，共66頁。37第三十七頁，共66頁。38

三、miRNA研究方法第三十八頁，共66頁。39miRNA研究思路表達譜分析生物信息學(xué)分析miRNA研究miRNA表達調(diào)控miRNA功能研究miRNA作用機理表觀遺傳學(xué)過表達實驗抑制表達實驗靶標確認信號通路探討第三十九頁，共66頁。40面臨的挑戰(zhàn)：尋找一種有效方法來研究miRNA將是目前面臨的首要問題。同時又將產(chǎn)生一系列問題：如何分離miRNA分子？如何尋找miRNA分子作用的靶基因？如何研究miRNA與靶mRNA之間的關(guān)系？第四十頁，共66頁。413.1尋找miRNA的方法：A.分子信息學(xué)的方法應(yīng)用計算機的方法如MirScan來尋找miRNA分子在線蟲及脊椎動物體內(nèi)取得了巨大的成功。B.分子生物學(xué)的方法miRNABioinfoanalysis1:miRNA序列及同源性分析2:miRNA靶標的計算機分析相關(guān)數(shù)據(jù)庫：第四十一頁，共66頁。42A.分子信息學(xué)篩選miRNA原理出發(fā)點為miRNA前體的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)及miRNA在物種間的保守性。miRNA基因可能定位于編碼蛋白基因的內(nèi)含子區(qū)域（有意義鏈或反意義鏈）及遠離任何已知基因的基因間區(qū)域。有時幾個發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)以多順反子的形式叢集在一起.提高尋找miRNA基因準確性的一些附加條件：1）上游和下游保守序列的數(shù)量；2）候選發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的上游高度保守模序的存在。第四十二頁，共66頁。43B.分子生物學(xué)的方法NothernblotMicroarrayQuantitativeReal-timePCR新一代測序第四十三頁，共66頁。44qPCR的方法每次RT只能檢測1種miRNA特異性高多個樣品中檢測同一miRNA價格較高每次RT能檢測所有miRNA通用性高適合miRNA的高通量檢測經(jīng)濟、方便Loop反轉(zhuǎn)錄PolyA加尾法第四十四頁，共66頁。45miRNA表達量的高通量篩選第四十五頁，共66頁。46

miRNAQ-PCRArrayWorkflow第四十六頁，共66頁。47miRNA功能研究的方法：

A分子信息學(xué)的手段：MIT的BartelandChrisBurge報道了一種可以用來探測miRNA與其作用的靶基因之間關(guān)系的新的計算機方法—TatgetScan。他們針對已知的每一個miRNA，掃描mRNA的數(shù)據(jù)庫——DNA轉(zhuǎn)譯為蛋白的生化信息，搜索與miRNA匹配的片段，然后對miRNA與mRNA的匹配程度評分，推測在三個或以上物種中獲得高分的mRNA為該miRNA的靶基因。

B分子生物學(xué)方法第四十七頁，共66頁。48第四十八頁，共66頁。49第四十九頁，共66頁。50miRNAfunctionanalysis功能獲得研究：把miRNA導(dǎo)入到細胞，進行研究-miRNAmimics-miRNAexpressionclones功能缺失研究：抑制miRNA的表達-miRNA抑制劑miRNA抑制劑表達克隆miRNA的靶標確證第五十頁，共66頁。51miRNA過表達實驗------miRNA表達克隆ExpressionTranslationSuppressionAnd/OrmRNACleavageandDegradation第五十一頁，共66頁。52使用案例------miRNA前體表達克隆第五十二頁，共66頁。53miRNA抑制表達實驗------miRNAinhibitorclone第五十三頁，共66頁。54miRNA抑制表達實驗------MechanismofmiRNAinhibitorclone抑制翻譯封閉miRNA的調(diào)節(jié)第五十四頁，共66頁。55miRNA靶標確證------靶標確證克隆構(gòu)建的載體為含雙熒光報告基因；螢火蟲熒光素酶（hLuc)同miRNA靶標融合表達，用于監(jiān)控miRNA對靶標的作用效果；海腎熒光素酶（hRLuc),可作為內(nèi)參進行轉(zhuǎn)染和表達效率檢測第五十五頁，共66頁。56miRNA靶標確證------單個靶標鑒定發(fā)光不發(fā)光第五十六頁