第5章色譜法引論 引論

本文格式為Word版，下載可任意編輯——第5章色譜法引論引論第五章色譜分析導(dǎo)論Chromatography,第一節(jié)概述Introduction,色譜法是一種重要的分開分析方法，它是根據(jù)組分在兩相中作用才能不同而達成分開目的的。,一、歷史,Tswett研究植物色素分開，提卓越譜法概念；

,,,,,,,,,,,,t,s,1941Martin和Synge提出液-液色譜理論；

,1952James和Martin進展了氣相色譜；

,1956VanDeemter提出速率理論；

,1967Kirkland等研制高效液相色譜法；

,80年頭以后展現(xiàn)毛細管電泳和毛細管電動色譜等一系列新的色譜分析方法。,色譜法的根本特點是具備兩個相：不動的一相，稱一為固定相；

另一相是攜帶樣品流過固定相的滾動體，稱為滾動相。當(dāng)滾動相中樣品混合物經(jīng)過固定相時，就會與固定相發(fā)生作用，由于各組分在性質(zhì)和布局上的差異，與固定相相互作用的類型、強弱也有差異，在固定相滯留時間長短不同，從而按先后不同的次序從固定相中流出。（一次）,,,色譜法分類,1．按兩相狀態(tài)分類氣體為滾動相－－氣相色譜（GC）：固定相是固體吸附劑還是固定液（附著在惰性載體上的液膜），又可分為氣固色譜（GSC）和氣液色譜（GLC）。

液體為滾動相－－液相色譜（LC）。液相色譜亦可分為液固色譜（LSC）和液液色譜（LLC）。

超臨界流體為滾動相的稱為超臨界流體色譜（SFC）通過化學(xué)回響將固定液鍵合到載體外觀，這種化學(xué)鍵合固定相的色譜又稱化學(xué)鍵合相色譜（CBPC）。,2．按分開機理分類,組分在固定相上的吸附才能強弱不同－吸附色譜法。

組分在固定液（固定相）中溶解度不同－調(diào)配色譜法。

組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小不同－離子交換色譜法。

利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透－凝膠色譜法或尺寸排阻色譜法。

組分與固定相（固定化分子）的高專屬性親和力舉行分開的技術(shù)稱為親和色譜法，常用于蛋白質(zhì)分開。,3．按固定相的形狀分類固定相裝于柱內(nèi)的色譜法，稱為柱色譜。固定相呈平板狀的色譜法，稱為平板色譜，它又可分為薄層色譜和紙色譜。,,根據(jù)以上所述，將色譜法的分類總結(jié)于下表,5－2色譜流出曲線及有關(guān)術(shù)語一．流出曲線和色譜峰,,二、基線,是柱中僅有滾動相通過時，檢測器響應(yīng)訊號的記錄值，即圖18－3中O—t線。穩(wěn)定的基線理應(yīng)是一條水平直線。

三、峰高色譜峰頂點與基線之間的垂直距離，以h表示，如圖18－3中B′A,四、留存值,1．死時間tM不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進入色譜柱時，從進樣到展現(xiàn)峰極大值所需的時間稱為死時間，O′A′。因不被固定相吸附或溶解，故其流速與滾動相的滾動速度相近。測定滾動相平均線速ū時，可用柱長L與tM的比值計算。,,,,2．留存時間tR試樣從進樣開頭到柱后展現(xiàn)峰極大點時所體驗的時間，稱為留存時間，如圖18-3O’B。它相應(yīng)于樣品到達柱末端的檢測器所需的時間。,,3．調(diào)整留存時間tR′某組份的留存時間扣除死時間后稱為該組份的調(diào)整留存時間，即tR′=tR-tM,由于組份在色譜柱中的留存時間tR包含了組份隨滾動相通過柱子所需的時間和組份在固定相中滯留所需的時間，所以tR′實際上是組份在固定相中停留的總時間。

留存時間是色譜法定性的根本依據(jù)，但同一組份的留存時間常受到滾動相流速的影響，因此色譜工有時用留存體積等參數(shù)舉行定性檢定。,,4．死體積VM指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測器的空間的總和。當(dāng)后兩項很小而可疏忽不計時，死體積可由死時間與滾動相體積流速F0（L／min）計算：

VM=tM·F0,5．留存體積VR指從進樣開頭到被測組份在柱后展現(xiàn)濃度極大點時所通過的滾動相體積。留存體積與留存時間t。的關(guān)系如下：

VR=tR·F0,6．調(diào)整留存體積VR′某組份的留存體積扣除死體積后，稱該組份的調(diào)整留存體積，即VR′=VR-VM,五、區(qū)域?qū)挾壬V峰的區(qū)域?qū)挾仁墙M份在色譜柱中譜帶擴張的函數(shù)，它反映了色譜操作條件的動力學(xué)因素。度量色譜峰區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N方法：,1.標(biāo)準(zhǔn)偏差σ即0.607倍峰高處色譜峰寬的一半，如圖18-3中EF距離的一半。

2.半峰寬W1/2即峰高一半處對應(yīng)的峰寬，如圖18-3中GH間的距離。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差σ的關(guān)系是：

W1/2=2.354σ,,3.基線寬度W即色譜峰兩側(cè)拐點上的切線在基線上的截距，如圖18－3中IJ的距離。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系是：

W=4σ,,,從色譜流出曲線上，可以得到大量重要信息,（l）根據(jù)色譜峰的個數(shù)，可以判斷樣品中所合組份的最少個數(shù)。

（2）根據(jù)色譜峰的留存值，可以舉行定性分析。

（3）根據(jù)色譜峰下的面積或峰高，可以舉行定量分析。

（4）色譜峰的留存值及其區(qū)域?qū)挾龋窃u價色譜柱分開效能的依據(jù)。

（5）色譜峰兩峰間的距離，是評價固定相(和滾動相)選擇是否適合的依據(jù)。,,相對留存值γ2.1某組份2與組份1的校正留存值之比，稱為相對留存值：,,由于相對留存值只與柱溫及固定相的性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長、填充處境及滾動相流速無關(guān)。,選擇因子定性分析中，通常固定一個色譜峰作為標(biāo)準(zhǔn)（s），然后再求其它峰（i）對這個峰的相對留存值。在多元混合物分析中，通常選擇一對最難分開的物質(zhì)對，可用符號α表示：,假設(shè)進樣量很小，濃度很低，在吸附等溫線的線性范圍內(nèi)，色譜峰假設(shè)對稱，可用Gauss正態(tài)分布函數(shù)表示：,式中：C—不同時間t時某物質(zhì)的濃度，C0—進樣濃度，tr—留存時間，σ—標(biāo)準(zhǔn)偏差。,,,5-3色譜法分析的根本原理色譜分析的目的是將樣品中各組分彼此分開，組分要達成完全分開，兩峰間的距離務(wù)必足夠遠，兩峰間的距離是由組分在兩相間的調(diào)配系數(shù)抉擇的，即與色譜過程的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。但是兩峰間雖有確定距離，假設(shè)每個峰都很寬，以致彼此重疊，還是不能分開。這些峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質(zhì)和分散行為抉擇的，即與色譜過程的動力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。因此，要從熱力學(xué)和動力學(xué)兩方面來研究色譜行為。,（5）調(diào)配系數(shù)和調(diào)配比（容量因子）,調(diào)配系數(shù)：

確定溫度與壓力下兩相達平衡后，組分在固定相和滾動相濃度的比值,調(diào)配比（容量因子）：

確定溫度與壓力下兩相達平衡后，組分在固定相和滾動相量的比值,固定相重量滾動相重量,,,K與k的關(guān)系：,（6）容量因子k與留存值的關(guān)系,,組分在兩相中的質(zhì)量比等于組分在液相中的停留時間與氣相中的停留時間之比,色譜根本留存方程,四、分開效能指標(biāo),1、選擇性（相對留存值）,相對留存值由兩組分的熱力學(xué)性質(zhì)抉擇，與色譜柱的長短粗細無關(guān)。,2、峰寬度,3、分開度,分開度考慮了留存時間和峰寬度，是一個綜合指標(biāo)：,R1.0兩峰明顯重疊R=1.0兩峰達97.7%分開R1.5兩峰完全分開,,二、塔板理論最早由Martin等人提出塔板理論，把色譜柱比作一個精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來描述組分在兩相間的調(diào)配行為，同時引人理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指標(biāo)。,該理論假定：

（i）在柱內(nèi)一小段長度H內(nèi)，組分可以在兩相間急速達成平衡。這一小段柱長稱為理論塔板高度H。

（ii）以氣相色譜為例，載氣進入色譜柱不是連續(xù)舉行的，而是脈動式，每次進氣為一個塔板體積（ΔVm）。

（iii）全體組分開頭時存在于第0號塔板上，而且試樣沿軸（縱）向分散可疏忽。

（iv）調(diào)配系數(shù)在全體塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無關(guān)。,下表列出經(jīng)過各級轉(zhuǎn)移后組分在每一級塔板中的量：,,,,,,,,,當(dāng)經(jīng)過1次轉(zhuǎn)移（N=1）以后：,第0級塔板：r=0,組分的分量=,若抽象成一個規(guī)律：,由上表可以看出，經(jīng)N次轉(zhuǎn)移后，組分在各級塔板上的量符合二相式分布，即,當(dāng)N=4時，組分分布在5級塔板上：,以A組分為例，5級塔板上的分量分別是：,對于兩個組分A和B，假設(shè)k不同，那么流出曲線的外形不同：,由于所獲得的流出曲線在N很大時呈正態(tài)分布，,可知：,m為組分質(zhì)量，Vr為留存體積，n為理論塔板數(shù)。

當(dāng)V=Vr時，C值最大，即,或：,n稱為色譜柱的理論塔板數(shù)。

由于tR是熱力學(xué)常數(shù)，當(dāng)色譜柱的長度確定，理論板數(shù)目n越大，色譜峰越窄。,,從上兩式可以看出，色譜峰W越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指標(biāo)。

通常填充色譜柱的n＞103，H＜1mm。而毛細管柱n=105--106，H＜0.5mm由于死時間tm包括在tr中，而實際的tm不參與柱內(nèi)調(diào)配，所計算的n值增大，H很小，但與實際柱效能相差甚遠。所以，提出把tm扣除，采用有效理論塔板數(shù)neff和有效塔板高Heff評價柱效能。,理論塔板高度（H）,塔板理論用熱力學(xué)觀點形象地描述了溶質(zhì)在色譜柱中的調(diào)配平衡和分開過程，導(dǎo)出流出曲線的數(shù)學(xué)模型，并告成地解釋了流出曲線的外形及濃度極大值的位置，還提出了計算和評價柱效的參數(shù)。但由于它的某些根本假設(shè)并不完全符合柱內(nèi)實際發(fā)生的分開過程，例如，縱向分散不能解釋造成譜帶擴張的理由和影響板高的各種因素，也不能說明為什么在不同流速下可以測得不同的理論塔板數(shù)，這就限制了它的應(yīng)用。,,,三、速率理論,1、塔板理論的缺乏塔板理論雖然指出了理論板數(shù)n或理論板高度H對色譜柱效率的影響，但是沒有指出影響塔板高度的因素，因此無法在理論指導(dǎo)下從測驗上提高色譜柱的效率。,2、VanDeemter方程1956年荷蘭學(xué)者范弟姆特等提出了色譜過程的動力學(xué)理論，他們吸收了塔板理念的概念，并把影響塔板高度的動力學(xué)因素結(jié)合進去，導(dǎo)出了塔板高度H與載氣線速度u的關(guān)系：

其中A渦流分散項,B分子分散項，C傳質(zhì)阻力項。,式中u—線速度,說明A與填充物dp的大小和填充的不平勻性λ有關(guān)，而與載氣性質(zhì)、線速度和組分無關(guān)，因此使用適當(dāng)細粒度和顆粒平勻的擔(dān)體，并填充平勻，是裁減渦流分散，提高柱效的有效途徑。,渦流分散示意圖,(2)分子分散項B/u由于試樣組分前后(縱向)存在著濃度差而形成濃度梯度，因此使運動著的分子產(chǎn)生縱向分散。

B=2rDgr是因載體而引起氣體分散路徑彎曲的因數(shù)(彎曲因子)，與填充物有關(guān)；

Dg為組分在氣相中的分散系數(shù)。與組分及載氣的性質(zhì)有關(guān)：相對分子質(zhì)量大的組分，其Dg小,所以采用相對分子質(zhì)量較大的載氣(如氮氣)，可使B項降低，Dg隨柱溫增高而增加，但反比于柱壓。彎曲因子r為與填充物有關(guān)的因素。,(3)