免疫組化雙重或多重標記

免疫組化雙重或多重標記第一頁，共二十八頁，2022年，8月28日操作的原則和要求基本上與單標免疫組化方法雷同

優(yōu)點：不同抗原成分位置、功能關(guān)系更直觀

缺點：流程長

脫片機率更高

前后重染色試劑間有交叉干擾第二頁，共二十八頁，2022年，8月28日第三頁，共二十八頁，2022年，8月28日第四頁，共二十八頁，2022年，8月28日二、技術(shù)類型（一）雙重或多重免疫熒光標記染色采用呈現(xiàn)不同顏色的熒光色素配伍，分別標記不同的抗體，再通過各自與同一切片上的相應(yīng)抗原特異性結(jié)合而加以區(qū)別顯示所建立起來的雙重或多重免疫組化染色技術(shù)。第五頁，共二十八頁，2022年，8月28日優(yōu)點：方法敏感、特異缺點：需選用各自特定的激發(fā)濾光片分別觀察或二次曝光顯影樣本不能長期保存組織結(jié)構(gòu)背景不清晰。第六頁，共二十八頁，2022年，8月28日直接法---特異、快速

間接法---敏感、多用

技術(shù)類型抗體試劑異種動物抗體---?；旌蠎?yīng)用，操作步驟少，脫片率相對較低同種動物抗體---分別應(yīng)用，操作步驟加倍，脫片機率較高；前后重免疫熒光標記交叉重疊機會多，需用酸性洗脫或多聚甲醛蒸氣處理第七頁，共二十八頁，2022年，8月28日

操作舉例：垂體腺瘤----ACTH與GH雙重免疫熒光標記染色（間接法）(1)石蠟切片，脫蠟，梯度酒精水化，入PBS。(2)1％人血清白蛋白（HAS）孵育10min(3)抗ACTH血清（McAb）1:200，孵育(4)0.05mol/LTBS洗第八頁，共二十八頁，2022年，8月28日(5)羊抗鼠IgG-TRITC，避光反應(yīng)1h。(6)0.05mol/LTBS(pH7.4)洗(第一重ACTH-TRITC標記染色已完成)。(7)切片脫水，二甲苯透明，空氣干燥后，置于裝有多聚甲醛粉末的密閉容器內(nèi)，放在80℃烤箱或溫箱內(nèi)以甲醛蒸氣固定2～4h，使第一重染色中二抗的抗原結(jié)合部位失活。第九頁，共二十八頁，2022年，8月28日(8)切片以TBS洗(9)1％HSA孵育30min(10)抗GH血清(McAb)1:400，孵育30min(11)0.05mol/LTBS(pH7.4)洗(12)羊抗鼠IgG-FITC，避光反應(yīng)1h。(13)0.05mol/LTBS(pH7.4)洗(第二重GH-FITC標記染色完成)。(14)緩沖甘油封片。第十頁，共二十八頁，2022年，8月28日(15)熒光顯微鏡下分別以546nm及490nm波長的激發(fā)光觀察切片組織內(nèi)TRITC及FITC所標示的ACTH及GH抗原（TRITC陽性細胞呈紅色，F(xiàn)ITC陽性細胞呈綠色）。(16)用彩色底片對切片同一部位用546nm及490nm波長激發(fā)光分別作兩次曝光，即可在同一張照片上顯示不同顏色標示的ACTH與GH兩種抗原。第十一頁，共二十八頁，2022年，8月28日TRITC-GAMIgG鼠抗人ACTH（IgG）FITC-GAMIgG鼠抗人GH（IgG）T游離FabTTTFGH抗原ACTH抗原FFab被滅活圖1同種動物抗體間接法（分步固定）雙重免疫熒光熒色原理第十二頁，共二十八頁，2022年，8月28日（二）雙重或多重免疫酶標記染色

以酶催化不同底物呈現(xiàn)不同顏色產(chǎn)物標示同一切片內(nèi)兩種或兩種以上抗原為理論基礎(chǔ)所建立起來的多重免疫標記染色方法。優(yōu)點：光鏡下可以同時觀察和對比一次曝光即可成像樣品保存時間相對較長第十三頁，共二十八頁，2022年，8月28日

★常用標記酶與底物的配伍

單酶雙底物DAB(棕色):4CN(藍色)AEC(紅色):4CN(藍色)堅固紅(fastred紅色)堅固藍(fastblue藍色)HRPAP-萘酚AS-MX第十四頁，共二十八頁，2022年，8月28日雙酶雙底物HRP(DAB):AP(萘酚AS.MX-堅固藍)HRP(4CN):AP(萘酚AS.MX-堅固紅)直接法、間接法、橋法均可使用靈敏度以橋法中的復(fù)合物法最高特異性則以直接法最佳第十五頁，共二十八頁，2022年，8月28日操作方法類同單酶標記，有直接法、間接法、復(fù)合物法之分。間接法與復(fù)合物法較常采用。★操作舉例淋巴瘤輕鏈κ、λ的雙重酶標記（雙酶雙底物）第十六頁，共二十八頁，2022年，8月28日(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟進水（若用含汞固定液固定的組織則需用0.5%碘的乙醇溶液脫汞5min，乙醇濃度為70％，經(jīng)自來水洗后，以2.5%硫代硫到鈉浸洗1min，水洗)；(2)0.3%H2O2甲醇液浸泡切片30min,自來水洗，蒸餾水洗,入PBS(0.01mol/LpH7.2);第十七頁，共二十八頁，2022年，8月28日(3)滴加正羊血清1:10，濕盒，室溫，10min，不洗；(4)加一抗(抗人κPcAb與抗人λMcAb的混合液)1:200，濕盒，37℃，45min或更長；(5)PBS液，5min×3第十八頁，共二十八頁，2022年，8月28日(6)加二抗(GARG＋GAMG混合液1:200)，溫盒，37℃，30min；(7)PBS洗，5min×3;(8)加酶抗酶抗體復(fù)合物(兔PAP＋鼠APAAP混合液1:100)，濕盒，37℃，30min；(9)PBS洗，5min×3；第十九頁，共二十八頁，2022年，8月28日(10)過氧化物酶顯色反應(yīng)：以DAB-H2O2液顯色7～10min(鏡下控制顯色程度)，PBS洗，5min×3；(11)鹼性磷酸酶顯色反應(yīng)：以萘酚AS.MX及堅固藍(fastblue)顯色10～15min(鏡下控制顯色程度)，PBS洗、自來水洗；(12)緩沖甘油封片，光鏡下觀察第二十頁，共二十八頁，2022年，8月28日PPPAAAκλ圖2雙酶雙底物(復(fù)合物法)雙重酶標染色原理兔PAPGARIgG兔抗KAg鼠APAAPGAM.IgG鼠抗人第二十一頁，共二十八頁，2022年，8月28日注：若用同種動物抗血清分別進行標記染色時，尚需考慮在前后重染色之間是否設(shè)置“多聚甲醛蒸氣處理2-4h（封閉固定）或用pH2.2的甘氨酸---鹽酸溶液處理2h（酸洗脫）的操作步驟”，目的為了避免前后重免疫試劑間的交叉反應(yīng)。可視預(yù)實驗結(jié)果來確定。

第二十二頁，共二十八頁，2022年，8月28日（三）雙重及多重免疫金標記(電鏡）電鏡下的雙重免疫標記染色不是靠顏色區(qū)分，而是靠標記物的不同電子密度或顆粒的不同大小來區(qū)別不同抗原，有別于光鏡下的雙重免疫標記方法。第二十三頁，共二十八頁，2022年，8月28日常用的方法多為雙重免疫金標記

優(yōu)點：高電子密度，分辨率高，抗原定位精確，顆粒大小可人工控制，標記試劑易制備。

缺點：試劑質(zhì)量要求高，非特異吸附干擾大(背景)第二十四頁，共二十八頁，2022年，8月28日金標抗體雙重抗原標記常用間接法顯示，且多采用異種動物抗體混合同步操作。優(yōu)點：敏感性提高，操作步驟減少缺點：標記二抗質(zhì)量要求高，背景染色深。可通過采用固相吸附或過量二抗封閉，或用多聚甲醛蒸氣處理，使二抗的游離抗原結(jié)合部位（Fab段）滅活加以克服。第二十五頁，共二十八頁，2022年，8月28日（四）其它雙重標記法

1.免疫熒光法與免疫酶法聯(lián)合應(yīng)用(先酶標

后熒光)；

2.免疫熒光法與免疫金銀法聯(lián)合應(yīng)用(先免疫金銀標記后熒光標記)；

3.免疫酶法與免疫金法聯(lián)合應(yīng)用(20nm,紅

色），此法忌用銀液放大，易吸附干擾；

4.免疫金銀法與免疫酶法聯(lián)合應(yīng)用(對比明

顯)。

第二十六頁，共二十八頁，2022年，8月28日三、注意事項

1.標記染色的順序確定需視組織標記抗原的性質(zhì)，量少、脆弱先標記，量多、耐受后標記。

2.結(jié)構(gòu)保存與抗原保護并重，電鏡樣品一般忌用餓酸后固定，PG固定液中的戊二醛(G)濃度不宜超過2％，光鏡樣品的固定劑類型和固定時間的選擇也應(yīng)如此；

第二十七頁，共