上海生科院實(shí)驗(yàn)生物學(xué)酶工程演示文稿

上海生科院實(shí)驗(yàn)生物學(xué)酶工程演示文稿當(dāng)前1頁，總共151頁。（優(yōu)選）上海生科院實(shí)驗(yàn)生物學(xué)酶工程當(dāng)前2頁，總共151頁。個(gè)人簡(jiǎn)歷1991-1995浙江大學(xué)化工系 本科生1995-2000上海生物化學(xué)研究所(酶工程組)

研究生2000-2002生化細(xì)胞所(酶工程組)

助理研究員2002-2006植生生態(tài)所(微生物代謝調(diào)控與酶工程組)

副研究員2006- 植生生態(tài)所/工業(yè)生物技術(shù)研究中心 研究員上海生科院湖州工業(yè)生物技術(shù)中心2008- 中科院合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 研究員上海工業(yè)生物技術(shù)研發(fā)中心

研究方向：發(fā)展和運(yùn)用改造蛋白質(zhì)、細(xì)胞代謝與運(yùn)輸途徑和基因組

的新方法，開發(fā)和優(yōu)化基于重組DNA的生物產(chǎn)品和制備

過程。當(dāng)前3頁，總共151頁。酶工程定義將酶所具有的生物催化功能,借助工程手段應(yīng)用于社會(huì)生活的一門科學(xué)技術(shù)；利用酶催化的作用,在一定的生物反應(yīng)器中,將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化為所需要的產(chǎn)品；利用酶、細(xì)胞器或細(xì)胞的特異催化功能，通過適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)人類所需產(chǎn)品或達(dá)到某種特殊目的的一門技術(shù)科學(xué)。(大唐搜索)當(dāng)前4頁，總共151頁。“工程”的定義(Webster)“酶工程”的定義運(yùn)用酶學(xué)知識(shí)結(jié)合數(shù)學(xué)和/或其他系統(tǒng)性知識(shí)設(shè)計(jì)有實(shí)用價(jià)值的新酶(生物催化劑，固定化生物催化劑，生物催化反應(yīng)體系,生物催化反應(yīng)器。。。)超越常規(guī)實(shí)踐技巧運(yùn)用數(shù)學(xué)或系統(tǒng)性知識(shí)設(shè)計(jì)有實(shí)用價(jià)值的復(fù)雜體系當(dāng)前5頁，總共151頁。教學(xué)目標(biāo)在具備生物化學(xué)/酶學(xué)/微生物學(xué)等基本知識(shí)的前提下了解蛋白質(zhì)重組表達(dá)和改造的基本概念，方法在文獻(xiàn)調(diào)研基礎(chǔ)上能獨(dú)立設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)重組表達(dá)和改造的實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線。當(dāng)前6頁，總共151頁。課程基礎(chǔ)張惠展 重組DNA技術(shù)與基因工程

鐘揚(yáng) 基因組學(xué)與生物信息學(xué)丁建平 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)技術(shù)生物化學(xué)(氨基酸，酶學(xué))蛋白質(zhì)化學(xué)(蛋白質(zhì)純化，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu))微生物學(xué)當(dāng)前7頁，總共151頁。參考資料ColinRatledge《BasicBiotechnology》2001MartinChaplin《EnzymeTechnology》1990AndreasS.Bommarius《Biocatalysis》2004當(dāng)前8頁，總共151頁。內(nèi)容安排

(約45分鐘休息10分鐘)復(fù)習(xí)與簡(jiǎn)介復(fù)習(xí)酶的基本概念酶工程發(fā)展概況基礎(chǔ)學(xué)習(xí)酶的生產(chǎn)方法重組表達(dá)酶的分離提取酶的固定化技術(shù)酶反應(yīng)器提高酶的改造提問？當(dāng)前9頁，總共151頁。酶學(xué)知識(shí)復(fù)習(xí)王鏡巖《生物化學(xué)》第3版第8章酶通論當(dāng)前10頁，總共151頁。酶是什么？有催化活力的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)一般不穩(wěn)定,反應(yīng)條件溫和催化能力高效性,專一性化學(xué)選擇性，區(qū)域選擇性，立體選擇性當(dāng)前11頁，總共151頁。TheMechanismofEnzymeCatalysis酶與過渡態(tài)中間物的緊密結(jié)合，穩(wěn)定了底物的過渡態(tài)結(jié)構(gòu)，從而降低了底物形成其過渡態(tài)所需克服的能壘，提高了反應(yīng)的速度當(dāng)前12頁，總共151頁。酶學(xué)相關(guān)定義U酶活力單位

1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1umol底物所需酶量Vmax最大反應(yīng)速度酶分子所有的活性部位都被底物占據(jù)時(shí)的反應(yīng)速度Km米氏常數(shù)反應(yīng)速度達(dá)到Vmax一半時(shí)的底物濃度Kcat酶轉(zhuǎn)換數(shù)

以每分鐘每酶分子形成的產(chǎn)物的分子數(shù)表示的Vmax米氏方程當(dāng)前13頁，總共151頁。HowAnEnzyme'sECNumberIsAssigned

FirstE.C.NumberSecondE.C.NumberMeans:ThirdE.C.NumberMeans:1:OxidoreductasesIndicatestheH+ore-donorthatundergoesoxidationIndicatestheacceptor2:TransferasesIndicatesthegrouptransferredFurtherinformationonthegrouptransferred3:HydrolasesIndicatesthenatureofthebondhydrolysedIndicatesthenatureofthesubstrate4:LyasesIndicatesthenatureofthebrokenbondFurtherinformationontheeliminatedgroup5:IsomerasesIndicatesthetypeofisomerismIndicatesthetypeofsubstrates6:LigasesIndicatesthetypeofbondformedOnlyusedinC-NligasesInallcases,thefourthECnumberisspecifictoaparticularreaction.當(dāng)前14頁，總共151頁。酶的命名

EC編號(hào)規(guī)則

第一位第二位第三位氧化還原酶

氧化反應(yīng)的供體是

H+還是

e-受體類型轉(zhuǎn)移酶發(fā)生轉(zhuǎn)移的基團(tuán)種類發(fā)生轉(zhuǎn)移的基團(tuán)細(xì)分水解酶

水解的化學(xué)鍵種類天然底物類型裂合酶斷裂的化學(xué)鍵種類脫去的基團(tuán)種類異構(gòu)酶同分異構(gòu)體的種類

底物類型連接酶

形成的化學(xué)鍵種類僅限于C-N化學(xué)鍵連接E.C.number第四位取決于具體的反應(yīng)過程國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)EnzymeCommission(EC)當(dāng)前15頁，總共151頁。酶的命名

氧、轉(zhuǎn)、水、裂、異、合(連)

Oxidoreductases 氧化還原酶Transferases 轉(zhuǎn)移酶Hydrolases 水解酶Lyases 裂合酶Isomerases 異構(gòu)酶Ligases 連接酶ATP水解偶聯(lián)國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)EnzymeCommission(EC)當(dāng)前16頁，總共151頁。當(dāng)前17頁，總共151頁。酶知識(shí)復(fù)習(xí)小結(jié)酶是有催化活力的蛋白質(zhì)酶與過渡態(tài)中間物的緊密結(jié)合，穩(wěn)定了底物的過渡態(tài)結(jié)構(gòu)，從而降低了底物形成其過渡態(tài)所需克服的能壘，提高了反應(yīng)的速度酶分為6大類，酶的命名可以在上查詢當(dāng)前18頁，總共151頁?；A(chǔ)篇學(xué)習(xí)酶的生產(chǎn)方法重組表達(dá)系統(tǒng)酶的分離提取酶的固定化技術(shù)酶反應(yīng)器當(dāng)前19頁，總共151頁。酶工程的歷史酶的歷史在麥芽中發(fā)現(xiàn)淀粉酶 1833在胃中發(fā)現(xiàn)消化酶--胃蛋白酶 1836

1873

從小牛胃提取凝乳酶用于制酪Enzyme定名--意為"在酵母中" 1878鑰匙-鎖理論提出

1894

以米曲霉生產(chǎn)淀粉酶作為消化酶中間產(chǎn)物學(xué)說米氏方程 1913獲得脲酶結(jié)晶酶是蛋白質(zhì) 1926 1949液體深層發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌α-淀粉酶固定化酶 1953操縱子學(xué)說酶生物合成機(jī)制 1960

1969

固定化氨基?；干a(chǎn)L-氨基酸

1973基因工程技術(shù)

1978定點(diǎn)突變技術(shù)

1984TyrRS的蛋白質(zhì)工程

1986重組酶生產(chǎn)

1993定向進(jìn)化

1994DNAshuffling

當(dāng)前20頁，總共151頁。酶的生產(chǎn)當(dāng)前21頁，總共151頁。植物來源來源 酶 應(yīng)用刀豆 脲酶 診斷木瓜 木瓜蛋白酶 烘焙，制酪，制革，

嫩肉粉，啤酒澄清無花果 無花果蛋白酶 嫩肉粉菠蘿 菠蘿蛋白酶 烘焙辣根 辣根過氧化物酶 診斷檸檬 β-糖苷酶 科研小麥 酯酶 酯水解與合成大麥 β-淀粉酶 烘焙，麥芽糖漿大豆 β-淀粉酶 烘焙，麥芽糖漿當(dāng)前22頁，總共151頁。動(dòng)物來源的工業(yè)用酶來源酶工業(yè)用途肝過氧化氫酶食品胰腺胰凝乳蛋白酶制革胰腺脂肪酶食品皺胃凝乳酶制酪胰腺胰蛋白酶皮革當(dāng)前23頁，總共151頁。微生物來源的工業(yè)用酶EnzymeECnumberSourceIntra/extra-cellular

ScaleofproductionIndustrialuseBacterialenzymesa-AmylaseBacillusE+++Starchb-AmylaseBacillusE+StarchAsparaginaseEscherichiacoliI-HealthGlucoseisomeraseBacillusI++FructosesyrupPenicillinamidase1BacillusE-PharmaceuticalProtease4BacillusE+++DetergentPullulanase1KlebsiellaE-StarchFungalenzymesa-AmylaseAspergillusE++BakingAminoacylase4AspergillusI-PharmaceuticalGlucoamylaseAspergillusE+++StarchCatalaseAspergillusI-FoodCellulaseTrichodermaE-WasteDextranase1PenicilliumE-FoodGlucoseoxidaseAspergillusI-FoodLactase3AspergillusE-DairyLipaseRhizopusE-FoodRennetMucormieheiE++CheesePectinase5AspergillusE++DrinksPectinlyase0AspergillusE-DrinksProteaseAspergillusE+BakingRaffinase2MortierellaI-FoodYeastenzymes

Invertase6SaccharomycesI/E

-ConfectioneryLactase3KluyveromycesI/E-DairyLipaseCandidaE-FoodRaffinase2SaccharomycesI-Food當(dāng)前24頁，總共151頁。微生物酶生產(chǎn)率提高的手段菌種選育 －－誘變育種發(fā)酵工藝優(yōu)化－－發(fā)酵工程重組表達(dá)－－基因工程在張惠展教授課程基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高當(dāng)前25頁，總共151頁。分子生物學(xué)知識(shí)復(fù)習(xí)理論中心法則操縱子理論工具PCR限制性內(nèi)切酶連接酶當(dāng)前26頁，總共151頁。分子生物學(xué)知識(shí)復(fù)習(xí)

中心法則操縱子理論重組蛋白質(zhì)表達(dá)載體必需元件選擇標(biāo)記啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)復(fù)制起點(diǎn)

(自主復(fù)制質(zhì)粒必需)編碼(c)DNA當(dāng)前27頁，總共151頁。重組蛋白質(zhì)的表達(dá)獲取基因選擇表達(dá)系統(tǒng)選擇表達(dá)載體

基因克隆至表達(dá)載體

轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主細(xì)胞篩選轉(zhuǎn)化子

生長(zhǎng)表達(dá)蛋白質(zhì)當(dāng)前28頁，總共151頁?？寺∶富蛞阎蛄袕奈膸熘衼喛寺?RT)PCR直接擴(kuò)增化學(xué)合成未知序列聯(lián)配同類酶的已發(fā)表序列，根據(jù)保守氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增基因純化酶，測(cè)定部分氨基酸序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增基因以方法1，2設(shè)計(jì)DNA探針進(jìn)行southern雜交和/或菌落雜交，篩選文庫建立表達(dá)文庫利用能表達(dá)酶活性的宿主菌的表型不同進(jìn)行篩選純化酶，制備抗體，用免疫印跡的方法篩選陽性克隆當(dāng)前29頁，總共151頁。ModelPCRproductsshowingcombinationsofproteinexpressionmotifsrelativetothecloningsitesusedtoinsertthegeneintoanexpressionvector.PCRproductencodingaproteinwithaC-terminalepitope(forantibodydetectionorpurification)ortag(forpurification).PCRproductencodingaproteinwithanupstreamproteasesite(forremovalofanN-terminaltagderivedfromtheexpressionvector)andaC-terminalepitopeortag.PCRproductencodingaproteinsecretionsignalandaC-terminalepitopeortag.PCRproductencodingaproteinwithoutastopcodon,sothatavarietyofC-terminaltagscanbeaddedbytheexpressionvector.PCRproductencodingaproteinthatrequirestheexpressionvectortosupplyboththetranslationstartandstop(i.e.theproteinwillhaveextraaminoacidsfromtheexpressionvectoratboththeNandCtermini).Kz,Kozak;SD,Shine–Dalgarnosequence.CurrentOpinioninBiotechnology2006,17:359–366當(dāng)前30頁，總共151頁。Typicalcombinationsofproteinexpressionelementsinexpressionvectors.AllexpressionvectorssupplyapromoterupstreamoftheN-terminalcloningsite,whichmayormaynotbecontrollable.TheN-andC-terminalcloningsitescanbeasinglesite.(a)ProvidesaC-terminalepitopetag.(b)ProvidesanN-terminaltranslationstartandaffinitytag.(c)Avectorsimilarto(b)butwiththepresenceofatoxicgenebetweenthecloningsitesforselectionagainstemptyvectormolecules(i.e.vectorsthatdonotcontainthegeneofinterest).(d)VectorcontainingaC-terminalfluorescentproteintag(e.g.greenfluorescentprotein)formakingfluorescentfusionproteins.drugR,drugresistancegene;ori,originofreplication.CurrentOpinioninBiotechnology2006,17:359–366當(dāng)前31頁，總共151頁。

重組表達(dá)系統(tǒng)E.coli(T7,tac/trc,T5,ara…)BacillusPichiapastoris(aox1,gap)Aspergillusniger……BaculovirusCHO體外翻譯系統(tǒng)蛋白質(zhì)產(chǎn)量翻譯后修飾加工，

折疊

(二硫鍵)和糖基化蛋白質(zhì)純化經(jīng)濟(jì)性可用設(shè)備表達(dá)系統(tǒng)選擇考慮因素:當(dāng)前32頁，總共151頁。首選重組蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)－－大腸桿菌生長(zhǎng)最快

實(shí)驗(yàn)操作最方便可高密度發(fā)酵遺傳背景清楚

容易獲得各種載體和宿主當(dāng)前33頁，總共151頁。FactorsinfluencingrecombinantproteinproductioninE.coliMergulhaoetalJournalMicrobiolBiotechnology2004當(dāng)前34頁，總共151頁。

E.coli表達(dá)系統(tǒng)可用啟動(dòng)子列表當(dāng)前35頁，總共151頁。常用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)trc啟動(dòng)子pTrcHIS(Invitrogen)pKK223,pTrc99(Pharmacia)T7啟動(dòng)子pET(Novagen)pRSET,pCRT7(Invitrogen)araBAD啟動(dòng)子pBAD(Invitrogen)T5啟動(dòng)子pQE系列(Qiagen)當(dāng)前36頁，總共151頁。首選中的首選--pET系統(tǒng)當(dāng)前37頁，總共151頁。T7表達(dá)系統(tǒng)工作原理當(dāng)前38頁，總共151頁。pET表達(dá)流程當(dāng)前39頁，總共151頁。pETVectorCharacteristicsTable當(dāng)前40頁，總共151頁。以pET24開始當(dāng)前41頁，總共151頁。

利用增溶標(biāo)簽

進(jìn)行蛋白質(zhì)

重組表達(dá)和純化當(dāng)前42頁，總共151頁。MBP作為增溶標(biāo)簽的優(yōu)越性KataevaI,ChangJ,XuH,LuanCH,ZhouJ,UverskyVN,LinD,HoranyiP,LiuZJ,LjungdahlLGetal.:ImprovingsolubilityofShewanellaoneidensisMR-1andClostridiumthermocellumJW-20proteinsexpressedintoEscherichiacoli.JProteomeRes2005,4:1942-1951. Resultsfromahigh-throughputstructuralgenomicsprojectcomparingMBP,GST,NusAandHis6solubilitytags.Thestudyof152proteinsfrommesophilicandthermophilicbacteriasuggestedthatMBPwasthebesttagformakingsolublefusions,andalsoshowedthepositiveeffectofloweredexpressiontemperatureonsolubility.Theauthorsdiscussalgorithmsforpredictingthesolubilityofproteins.DysonMR,ShadboltSP,VincentKJ,PereraRL,McCaffertyJ:ProductionofsolublemammalianproteinsinEscherichiacoli:identificationofproteinfeaturesthatcorrelatewithsuccessfulexpression.BMCBiotechnol2004,4:32. Theauthorschose30diversehumangenesandcomparedexpressionwithsixdifferentN-terminalandeightdifferentC-terminalsolubilityfusions.ResultsshowedthatMBPandTrxwerethebesttagsandthatMBPalsoworkedasaC-terminalfusion,contrarytopreviousresults.Theauthorsnicelyhighlighttheproteinfeaturesthatseemtocorrelatewithsolubility:molecularweight,numberofhydrophobicresidues,andlowcomplexityregions.BussoD,Delagoutte-BussoB,MorasD:Constructionofasetgateway-baseddestinationvectorsforhigh-throughputcloningandexpressionscreeninginEscherichiacoli.AnalBiochem2005,343:313-321. Thisarticledescribestheconstructionof10recombinationalcloningvectorsandtheiruseforcomparingexpressionandsolubilityofasmallnumberofgenesfromBacillussubtilis.MethodsforgeneratingandtestingnewvectorsareclearlydiscussedandtheresultsofthesolubilityanalysissuggestthatMBPandNusAaremuchbetterthanGSTorTrxinthecaseofthesepartnerproteins.當(dāng)前43頁，總共151頁。大腸桿菌表達(dá)實(shí)驗(yàn)策略首選pET系統(tǒng),如pET24/BL21(DE3)1mMIPTG誘導(dǎo)無表達(dá)?融合表達(dá)，T5,pBAD系統(tǒng)包涵體？IPTG濃度(1uM,10uM,100uM)，降溫低至18℃LBTB培養(yǎng)基與MBP融合表達(dá)共表達(dá)分子伴侶改善可溶性定向進(jìn)化當(dāng)前44頁，總共151頁。重組表達(dá)制備有功能的蛋白質(zhì)參考文獻(xiàn)報(bào)道改變誘導(dǎo)條件（溫度，誘導(dǎo)劑的量）增溶標(biāo)簽（MBP)改換表達(dá)載體，如不同的啟動(dòng)子分子伴侶根據(jù)基因來源，考慮所使用的表達(dá)宿主及載體包涵體純化定向進(jìn)化當(dāng)前45頁，總共151頁。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)小結(jié)優(yōu)點(diǎn)最方便，最有效缺點(diǎn)分泌表達(dá)能力弱二硫鍵形成困難無翻譯后修飾當(dāng)前46頁，總共151頁。酵母表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen)當(dāng)前47頁，總共151頁。PichiaExpressionKits當(dāng)前48頁，總共151頁。Pichiapastoris

簡(jiǎn)介BuddingPichiapastoris醇氧化酶的催化場(chǎng)所––––過氧化物酶體可占到細(xì)胞總體積的80%無快速碳源而含有甲醇，產(chǎn)生醇氧化酶能占到細(xì)胞總蛋白的30%當(dāng)前49頁，總共151頁。Pichiapastoris表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn)外源基因穩(wěn)定整合醇氧化酶基因的啟動(dòng)子強(qiáng)，且可用甲醇嚴(yán)格調(diào)控表達(dá)重組蛋白質(zhì)可以以胞內(nèi)或胞外形式表達(dá)含有真核表達(dá)系統(tǒng)共有的翻譯后修飾功能有商品化宿主/載體，操作簡(jiǎn)便放大方便，發(fā)酵密度極高當(dāng)前50頁，總共151頁。TypicalPichiapastorisexpressionvector

5’AOX1:AOX15’regionincludingpromoterMCS:MultiplecloningsiteTT:AOX1terminatorHIS4:histidinoldehydrogenase3’AOX1:AOX13’regionAmp:Ampicillin-resistancemarkerfiori:f1bacteriophageorigin.Sig:signalsequencesSacI,SalI,StuIandBglIIcuttingsiteareusedtolinearizethevectorbeforetransformation當(dāng)前51頁，總共151頁。Promotoraox1啟動(dòng)子：強(qiáng)啟動(dòng)子甲醇誘導(dǎo)葡萄糖，甘油等快速碳源阻遏表達(dá)調(diào)控技術(shù)較成熟gap啟動(dòng)子組成型強(qiáng)啟動(dòng)子葡萄糖 強(qiáng)啟動(dòng)子甘油 中等強(qiáng)啟動(dòng)子甲醇 弱啟動(dòng)子當(dāng)前52頁，總共151頁。Pichiapastorisstrains

StrainGenotypeApplicationX33Wild-typeSelectionofZeocin-resistantexpressionvectorsGS115his4SelectionofHIS4expressionvectorsKM71his4,aox1::ARG4;arg4SelectionofHIS4expressionvectorstogeneratestrainswithMutSphenotypeKM71Haox1::ARG4;arg4SelectionofZeocin-resistantexpressionvectorstogeneratestrainswithMutSphenotypeSMD1165his4prB1SelectionofHIS4expressionvectorstogeneratestrainswithoutproteinBactivitySMD1168his4pep4SelectionofHIS4expressionvectorstogeneratestrainswithoutproteaseAactivitySMD1163his4pep4prB1SelectionofHIS4expressionvectorstogeneratestrainswithoutproteaseAandproteaseBactivitySMD1168Hpep4SelectionofZeocin-resistantexpressionvectorstogeneratestrainswithoutproteaseA當(dāng)前53頁，總共151頁。Pichiapastoris表達(dá)實(shí)驗(yàn)流程電轉(zhuǎn)化GS115初篩(50ml離心管)有表達(dá)復(fù)篩(250ml搖瓶)發(fā)酵罐無表達(dá)

以pPIC3.5K嘗試胞內(nèi)表達(dá)外源基因克隆到pPIC9的alpha信號(hào)肽序列之后當(dāng)前54頁，總共151頁。Pichiapastoris表達(dá)系統(tǒng)小結(jié)優(yōu)點(diǎn)有商品化宿主/載體，操作簡(jiǎn)便真核表達(dá)系統(tǒng)重組蛋白質(zhì)可以以胞內(nèi)或胞外形式表達(dá)高密度發(fā)酵方便有翻譯后加工缺點(diǎn)翻譯后加工形式有獨(dú)特性當(dāng)前55頁，總共151頁。重組酶表達(dá)小結(jié)首選文獻(xiàn)報(bào)道表達(dá)系統(tǒng)次選大腸桿菌大腸桿菌中無活性選用酵母系統(tǒng)根據(jù)基因來源定表達(dá)系統(tǒng)芽孢桿菌放線菌酵母霉菌基因加親和標(biāo)簽便于純化當(dāng)前56頁，總共151頁。酶制備流程圖當(dāng)前57頁，總共151頁。細(xì)胞破碎手段超聲波目前只用于實(shí)驗(yàn)室或小規(guī)模高壓勻漿機(jī)(highpressurehomogenizer)珠磨機(jī)(beadmills)freeze-presses小規(guī)模滲透壓沖擊法自發(fā)分解(yeast,Bacillus)酶裂解(溶菌酶，Lyticase,Zymolase,蝸牛酶)當(dāng)前58頁，總共151頁。細(xì)胞破碎需考慮因素HeatAllmechanicalmethodsrequirealargeinputofenergy,generatingheat.Coolingisessentialformostenzymes.Thepresenceofsubstrates,substrateanaloguesorpolyolsmayalsohelpstabilisetheenzyme.ShearShearforcesareneededtodisruptcellsandmaydamageenzymes,particularlyinthepresenceofheavymetalionsand/oranairinterface.ProteasesDisruptionofcellswillinevitablyreleasedegradativeenzymeswhichmaycauseseriouslossofenzymeactivity.Suchactionmaybeminimisedbyincreasedspeedofprocessingwithasmuchcoolingaspossible.Thismaybeimprovedbythepresenceofanexcessofalternativesubstrates(e.g.inexpensiveprotein)orinhibitorsintheextractionmedium.pHBufferedsolutionsmaybenecessary.Thepresenceofsubstrates,substrateanaloguesorpolyolsmayalsohelpstabilisetheenzyme.ChemicalSomeenzymesmaysufferconformationalchangesinthepresenceofdetergentand/orsolvents.Polyphenolicsderivedfromplantsarepotentinhibitorsofenzymes.Thisproblemmaybeovercomebytheuseofadsorbents,suchaspolyvinylpyrrolidone,andbytheuseofascorbicacidtoreducepolyphenoloxidaseaction.OxidationReducingagents(e.g.ascorbicacid,mercaptoethanolanddithiothreitol)maybenecessary.Foaming

Thegas-liquidphaseinterfacespresentinfoamsmaydisruptenzymeconformation.

Heavy-metaltoxicityHeavymetalions(e.g.iron,copperandnickel)maybeintroducedbyleachingfromthehomogenisationapparatus.Enzymesmaybeprotectedfromirreversibleinactivationbytheuseofchelatingreagents,suchasEDTA.當(dāng)前59頁，總共151頁。Manton-Gaulin勻漿機(jī)當(dāng)前60頁，總共151頁。從澄清液中提取酶超濾硫酸銨沉淀有機(jī)溶劑沉淀熱處理濃縮去不耐熱的雜蛋白當(dāng)前61頁，總共151頁。胞內(nèi)酶純化去除核酸非特異性硫酸銨沉淀特異性帶正電荷材料

(與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)作用形成復(fù)合物)聚乙烯亞胺，陰離子洗滌劑十六烷基三乙基溴化銨，硫酸鏈霉素，硫酸魚精蛋白牛胰核酸酶當(dāng)前62頁，總共151頁。色譜（層析）離子交換色譜吸附色譜親和色譜疏水色譜凝膠排阻色譜（分子篩）當(dāng)前63頁，總共151頁。酶制劑使用添加劑共價(jià)修飾固定化當(dāng)前64頁，總共151頁。小結(jié)酶的來源很多，但主要來源于微生物發(fā)酵酶的工業(yè)化應(yīng)用取決于他們的效果，成本和安全性離心一般用于收集含酶固體

過濾更多用于液體酶回收

雙水相體系將會(huì)在酶回收操作中得到更多應(yīng)用制備工業(yè)用酶需盡量壓縮分離提取步驟酶制劑必須穩(wěn)定，使用安全當(dāng)前65頁，總共151頁。固定化酶優(yōu)點(diǎn)便于從反應(yīng)體系中分離從而易于控制反應(yīng)時(shí)間，減少酶失活可反復(fù)使用降低用酶成本提高酶穩(wěn)定性缺點(diǎn)傳質(zhì)限制動(dòng)力學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化固定化增加額外成本當(dāng)前66頁，總共151頁。

a.吸附

b.共價(jià)連接

c.包埋

d.膜限制

酶的固定化方法當(dāng)前67頁，總共151頁。多點(diǎn)作用使酶穩(wěn)定化當(dāng)前68頁，總共151頁。固定化酶方法比較Characteristics

Adsorption

Covalent

bindingEntrapmentMembraneconfinementPreparation

Simple

Difficult

Difficult

SimpleCost

Low

High

Moderate

HighBindingforce

VariableStrong

Weak

StrongEnzymeleakage

Yes

No

Yes

NoApplicability

Wide

Selective

Wide

VerywideRunningProblems

High

Low

High

HighMatrixeffects

Yes

Yes

Yes

NoLargediffusionalbarriers

No

No

Yes

YesMicrobialprotection

No

No

Yes

Yes

當(dāng)前69頁，總共151頁。固定化載體EupergitC?Sepabeads?series當(dāng)前70頁，總共151頁。新型固定化方法—無載體固定化Thedifferentapproachestotheproductionofcarrier-freeimmobilisedenzymes:crystallization;(b)aggregation;(c)spray-drying;(d)directcross-linking.AGG,aggregates;CRY,crystals;SDE,spray-driedenzyme.當(dāng)前71頁，總共151頁。固定化酶小結(jié)酶的固定化使得它們能高效和連續(xù)使用酶的固定化形式有4種酶的固定化影響動(dòng)力學(xué)性質(zhì)酶的固定化一般可提高其使用的經(jīng)濟(jì)性酶的固定化新技術(shù)－－無載體固定化當(dāng)前72頁，總共151頁。酶反應(yīng)器圖解當(dāng)前73頁，總共151頁。基礎(chǔ)篇小結(jié)重組微生物是酶的最重要來源工業(yè)用酶的分離提取對(duì)成本敏感固定化酶是工業(yè)用酶制劑的重要形式酶反應(yīng)器對(duì)于發(fā)揮酶的催化作用也很重要當(dāng)前74頁，總共151頁。提高篇酶的改造當(dāng)前75頁，總共151頁。獲得新酶的途徑自然界中獲取有理設(shè)計(jì)新酶隨機(jī)方法篩選新酶當(dāng)前76頁，總共151頁。酶的設(shè)計(jì)方法無理設(shè)計(jì)天然設(shè)計(jì)有理設(shè)計(jì)當(dāng)前77頁，總共151頁?；诠δ?-生物多樣性與新酶的發(fā)現(xiàn)嗜熱菌（Thermophiles)嗜冷菌（Phyphophiles)嗜酸菌（Acidophiles)嗜堿菌（Alkaliphiles)嗜鹽菌（Halophiles)嗜壓菌（Barophiles)

極端微生物的特殊生長(zhǎng)環(huán)境及代謝產(chǎn)物，使酶在“惡劣”環(huán)境下能夠發(fā)揮高效催化作用。當(dāng)前78頁，總共151頁?；谛蛄?-目前已經(jīng)有無數(shù)的基因組被測(cè)序當(dāng)前79頁，總共151頁。SαIβDistributionforpenicillinGacylasePGAprecursorstructure當(dāng)前80頁，總共151頁。天然酶化學(xué)

-轉(zhuǎn)化天然底物物理 -耐受差生物 -代謝調(diào)控和高轉(zhuǎn)換數(shù)環(huán)境不同要求不同自然進(jìn)化中天然酶的結(jié)構(gòu)功能對(duì)應(yīng)于其活細(xì)胞的生理功能而進(jìn)化的天然酶往往不適用于生物技術(shù)應(yīng)用當(dāng)前81頁，總共151頁。改造目的高專一性

只催化所需反應(yīng)

減少甚至沒有副產(chǎn)物高活性高生產(chǎn)率不易受抑制高穩(wěn)定性

存放時(shí)間長(zhǎng)操作穩(wěn)定性高生物催化劑應(yīng)用依賴于天然酶改造或重新設(shè)計(jì)方法當(dāng)前82頁，總共151頁。酶的改造蛋白質(zhì)工程－－理性設(shè)計(jì)

通過蛋白質(zhì)化學(xué)、蛋白質(zhì)晶體學(xué)和動(dòng)力學(xué)的研究獲取關(guān)于蛋白質(zhì)物理、化學(xué)等方面的信息，在此基礎(chǔ)上對(duì)編碼該蛋白的基因進(jìn)行有目的的設(shè)計(jì)改造，并通過基因工程等手段將其進(jìn)行表達(dá)和分離純化，最終將其投入實(shí)際應(yīng)用?；蚬こ蹋Y(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物信息學(xué)化學(xué)修飾固定化誘變篩選－－無理設(shè)計(jì)當(dāng)前83頁，總共151頁。Timeline|20yearsofproteinengineeringJamesA.BranniganandAnthonyJ.Wilkinson.Proteinengineering20yearson.

NatureReviewsMolecularCellBiology2002,3,964-70CDR,complementarity-determiningregions:TyrRS,tyrosyl-tRNAsynthetase當(dāng)前84頁，總共151頁。分子生物學(xué)知識(shí)復(fù)習(xí)

中心法則蛋白質(zhì)功能＝f(蛋白質(zhì)序列)

改變序列影響蛋白質(zhì)功能(c)DNA序列蛋白質(zhì)序列立體結(jié)構(gòu)功能當(dāng)前85頁，總共151頁。蛋白質(zhì)序列空間a表示最小蛋白質(zhì)的氨基酸殘基數(shù)，b表示最大蛋白質(zhì)的氨基酸殘基數(shù)。n個(gè)氨基酸殘基組成的線性長(zhǎng)鏈的序列空間為20n所有蛋白質(zhì)都可以表示為這個(gè)b維空間的唯一一點(diǎn)，比如枯草芽孢桿菌蛋白酶BPN’坐標(biāo)為（A,Q,S,V,P,Y,G,V,S,Q,I,K,A,…,A,Q,0,…,0,0,0）。小至100個(gè)氨基酸殘基組成的酶的序列空間也大至20100序列空間蛋白質(zhì)特性序列空間距離近蛋白質(zhì)性質(zhì)接近當(dāng)前86頁，總共151頁。PAM250氨基酸相對(duì)突變率矩陣

和

基本氨基酸性質(zhì)關(guān)系venn圖當(dāng)前87頁，總共151頁。有理設(shè)計(jì)根據(jù)詳盡的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系知識(shí)結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu) 氨基酸順序二級(jí)結(jié)構(gòu) a-螺旋,b-折疊,轉(zhuǎn)角,無規(guī)卷曲三級(jí)結(jié)構(gòu) 3D折疊(結(jié)晶，NMR)功能活性位點(diǎn) 氨基酸殘基和輔因子催化 機(jī)理,

特異性和動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié) 競(jìng)爭(zhēng)性抑制和變構(gòu)控制

怎么獲得這些信息？當(dāng)前88頁，總共151頁。經(jīng)典途徑純化目標(biāo)酶，分析氨基酸序列分離基因并重組表達(dá)結(jié)晶目標(biāo)酶，X射線分析當(dāng)前89頁，總共151頁。當(dāng)前90頁，總共151頁。Copyrightrestrictionsmayapply.Chang,A.etal.Nucl.AcidsRes.200937:D588-D592;doi:10.1093/nar/gkn820Inputdataandtheirsourcedatabasesusedfortheco-occurencebasedtext-miningapproachthatgeneratestheBRENDAsupplementsFRENDAandAMENDA當(dāng)前91頁，總共151頁。序列與結(jié)構(gòu)分析多重聯(lián)配 序列保守性信息結(jié)晶/同源模建 獲得立體結(jié)構(gòu)三維結(jié)構(gòu)分析 分子圖像分析當(dāng)前92頁，總共151頁。多重聯(lián)配

ClustalW當(dāng)前93頁，總共151頁。Crystals:18%PEG6K,0.1MBicine,pH8.5,0.01MCdCl2.StructuralstudiesofD-hydantoinasefromBurkholderiapickettiiSummaryofpurificationofDHasefromE.coliBL21(DE3)/pXZPH2PurificationstepSamplevol(ml)Totalprotein(mg)Totalactivity(U)Spact(U/mg)PurificationfactorActivityyield(%)Cellextract25.060030.80.051.0100Ni2+chelateaffinitycolumn

4.04.45.01.1322.616.6ARibbondiagramshowingtheoverallstructureofDHasemonomerandtetramerviewedfromthecatalyticactivesite.XuZetalJournalofBacteriology2003當(dāng)前94頁，總共151頁。當(dāng)前95頁，總共151頁。當(dāng)前96頁，總共151頁。當(dāng)前97頁，總共151頁。PyMOL:Itcanproducehighquality3Dimagesofsmallmoleculesandbiologicalmacromolecules當(dāng)前98頁，總共151頁。MVD蛋白質(zhì)與配體分子對(duì)接分析HIV-1proteaseXK263PDBID:1HVR文件格式：PDB、Mol2、SDF等預(yù)測(cè)活性中心Docking配體與蛋白質(zhì)間氫鍵當(dāng)前99頁，總共151頁。有理設(shè)計(jì)目標(biāo)催化效率穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性有機(jī)溶劑穩(wěn)定性pH曲線當(dāng)前100頁，總共151頁。提高熱穩(wěn)定性的重要全局性因素環(huán)區(qū)長(zhǎng)度減少以及隨之而來的二級(jí)結(jié)構(gòu)增加表面電荷相互作用敏感氨基酸殘基減少

(如半胱氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺)芳香環(huán)堆積增加疏水作用增加金屬離子結(jié)合能力提高寡聚增加JasonKYanoandThomasLPoulos.Newunderstandingofthermostableandpeizostable

enzymes.CurrentopinioninBiotechnology,2003,14:1-6

常用提高穩(wěn)定性方法 引入二硫鍵和/或鹽橋當(dāng)前101頁，總共151頁。CCOOCCOOCCOOCCOOCCOOIndex1Index2Index3Index40<OSP<0.150.15<OSP<0.300.30<OSP<0.450.45<OSP<0.600.60<OSP<0.75FullyexposedstateExposedstateBoundarystateBuriedstateWell-buriedstateIndex5當(dāng)前102頁，總共151頁。氨基酸殘基分布差異高

PRO

低

MET

低極顯著低低SER

（低）低（低）ASN高

TYR高

TRP

低LYS

高極顯著

高

GLU

高

高

ARG

高ILE

低

VAL高極顯著

低極顯著

ALA完全包埋包埋部分包埋/部分暴露暴露完全暴露

當(dāng)前103頁，總共151頁。對(duì)于熱穩(wěn)定性改造的具體指導(dǎo)完全暴露

SER,LYS

ILE

暴露

ALA,VAL,ASN,SER

ARG,GLU

部分包埋/部分暴露SER

?

包埋： MET

ARG,GLU

完全包埋： ?

ALA,TRP,TYR,PRO

當(dāng)前104頁，總共151頁。pH曲線的改變將蛋白質(zhì)表面變得更帶負(fù)電荷將提高酸性基團(tuán)的pKa值，因?yàn)樗鼈冊(cè)陔x子化時(shí)丟失質(zhì)子。反之，將表面變得更帶正電荷則降低所有酸性基團(tuán)的pKa值。低離子強(qiáng)度時(shí)變化將最大如果避免多電荷抗衡離子，當(dāng)離子強(qiáng)度高至0.1M時(shí)會(huì)出現(xiàn)明顯的變化。突變?cè)O(shè)計(jì)應(yīng)避免在活性中心空穴附近聚集抗衡離子。RussellandFersht.Rationalmodificationofenzymecatalysisbyengineeringsurfacecharge.

Nature,1987,328(6),496-500當(dāng)前105頁，總共151頁。融合蛋白質(zhì)－－廣義的有理設(shè)計(jì)組氨酸標(biāo)簽(Histidine-tag,his-tag)谷胱甘肽合成酶

(glutathionesynthetase,GST)麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)

(maltosebindingprotein,MBP)內(nèi)含肽(Intein)各種信號(hào)肽改善重組蛋白可溶性，便于親和層析純化。。。當(dāng)前106頁，總共151頁。PCR原理當(dāng)前107頁，總共151頁。定向突變

-PCR當(dāng)前108頁，總共151頁。StratageneMutagenesisKitSelectionGuide當(dāng)前109頁，總共151頁。兩種定點(diǎn)突變方法的比較當(dāng)前110頁，總共151頁。有理設(shè)計(jì)小結(jié)工具酶數(shù)據(jù)庫 Brenda序列聯(lián)配 ClustalW同源模建 Swissmodel分子圖像 Rasmol定點(diǎn)突變，序列重組 PCR目標(biāo)熱穩(wěn)定性，pH曲線 表面氨基酸替換催化效率需了解催化機(jī)理底物特異性 需了解催化機(jī)理當(dāng)前111頁，總共151頁。生物催化劑的定向進(jìn)化當(dāng)前112頁，總共151頁。高頻隨機(jī)突變導(dǎo)入方法DNA聚合酶 堿基錯(cuò)配率/每輪復(fù)制大腸桿菌體內(nèi) 1 X10-10-10-8Replicase 1.03 X10-4Vent(exo-) 1.9 X10-4Taq 2.0-21 X10-5KlenTaq 5.1 X10-5Vent 2.4-5.7 X10-5Pfu,PfuTurbo 1.6 X10-6

易錯(cuò)PCRerror-pronePCR(=PCRwithmanyerrors/mutations)

無校對(duì)DNA聚合酶 e.g.Taq,Mutazyme

非優(yōu)化條件 e.g.Mn2+代替Mg2+,調(diào)整4種dNTP相對(duì)濃度當(dāng)前113頁，總共151頁。RandomMutagenesiskit突變率0.1－1.6%/PCR,相當(dāng)于1－7個(gè)堿基突變/基因當(dāng)前114頁，總共151頁。高頻隨機(jī)突變導(dǎo)入方法以大腸桿菌XL1-Red作為基因復(fù)制宿主

MutantsoftheP.furioususAlkalinePhosphataseGene:MorphologyofclonesonLBplatescontainingBCIPindictorsubstrate.A:ParentPfualkalinephosphataseclone.B:Pfu5.C:Pfu5-1.D:Pfu5-2.XL1-Bluestrain:recA1endA1gyrA96thi-1hsdR17supE44relA1lac[F'proABlacIqZΔM15Tn10(Tetr)]

正常菌株XL1-Redstrain:endA1gyrA96thi-1hsdR17supE44relA1lacmutD5mutSmutTTn10(Tetr)

DNA修復(fù)缺陷

Greener,A.andCallahan,M.

(1994),Strategies.

7:32-34

培養(yǎng)到平臺(tái)期平均2Kb發(fā)生1個(gè)堿基突變當(dāng)前115頁，總共151頁。逐點(diǎn)飽和突變技術(shù)當(dāng)前116頁，總共151頁。逐點(diǎn)飽和突變技術(shù)當(dāng)前117頁，總共151頁。定向進(jìn)化提高枯草芽孢桿菌蛋白酶E在DMF水溶液的活力ChenandArnold.PNAS1993YouandArnold.ProteinEng1996當(dāng)前118頁，總共151頁。進(jìn)化

逐步過程自然進(jìn)化

自發(fā)突變

重組

自然選擇達(dá)爾文進(jìn)化理論

生命的復(fù)雜性是突變，重組和自然選擇算法的結(jié)果當(dāng)前119頁，總共151頁。人類的作物，花卉和家禽家畜育種實(shí)踐有幾千年歷史加速進(jìn)化

快速改變農(nóng)業(yè)進(jìn)化

自發(fā)突變

育種

篩選當(dāng)前120頁，總共151頁。革命

極快改變實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化

加快突變速度 分子育種

篩選實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化不同于自然進(jìn)化在于其明確的進(jìn)化目標(biāo).在此意義上它是“定向”并且更像育種。此外，它非常快。當(dāng)前121頁，總共151頁。加速進(jìn)化

快速改變農(nóng)業(yè)進(jìn)化

自發(fā)突變

育種

篩選革命

極快改變實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化

加快突變速度

分子育種

篩選進(jìn)化

逐步過程自然進(jìn)化

自發(fā)突變

重組

自然選擇當(dāng)前122頁，總共151頁。DNAshufflingscreenandselect*

**

*

**

PCRDNaseI*

**

*

PCR*

**

**

libraryDenature&anneal5’5’***Homo-duplexformation5’5’**5’5’**5’3’3’5’**fillin&lify**Error-pronePCR當(dāng)前123頁，總共151頁。DNAShuffling當(dāng)前124頁，總共151頁。DNAshuffling–β-lactamasecaseβ-Lactamase:hydrolysisofbeta-lactamantibioticsβ-lactamaseAmpicillinCefotaximedegrade(Stemmer,W.P.C.Nature1994370:389-391)TEM-1W.T.shuffling-3cycleBackcrossover-2cycleX16,000X32,000MIC=0.02ug/mlMIC=640ug/mlperiplasm當(dāng)前125頁，總共151頁。定向進(jìn)化方法比較當(dāng)前126頁，總共151頁。Accumulationofmutationsbysequentialmutagenesis,

pairwiserecombinationandpoolwiserecombination

當(dāng)前127頁，總共151頁。單基因Shuffling和多基因Shuffling獲得的突變庫當(dāng)前128頁，總共151頁。DNAFamilyshufflingParentalSequencesRandomFragmentationDenaturizationAnnealingExtentionFinalLibrarycrossoverRepeatedCyclesofPrimerlessPCR

當(dāng)前129頁，總共151頁。定向進(jìn)化的基本過程SinglegeneDNAshufflingMultiplegenesDNAfamilyshufflingExpressionandscreenRepeatedasneeded當(dāng)前130頁，總共151頁。Comparisonofsinglesequenceshufflingversussequencefamilyshuffling當(dāng)前131頁，總共151頁。StaggeredExtensionProcess(StEP)DenaturationAnnealing,

ExtensionDNADNADenaturationAnnealing,

Extension當(dāng)前132頁，總共151頁。RACHITT示意圖兩種野生型基因A和B雙鏈DNA處理成單鏈DNA。DNaseI處理單鏈DNA，形成許多的隨機(jī)大小的片段。隨機(jī)片段與單鏈模板雜交。通過兩端引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到具有目的片段大小的雜合基因。14crossovervs1-4crossover當(dāng)前133頁，總共151頁。DNAshuffling-efficiencydependsonhomologyHomo-duplexformation5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’Hetero-duplexformation5’3’3’5’PCRPCRResemblessynthesisofsyntheticgene(DirectedMutagenesis)Resemblessynthesisofgenefusions(DirectedMutagenesis)當(dāng)前134頁，總共151頁。IncrementalTruncationfortheCreationofHYbridenzymes

(ITCHY)

對(duì)隨機(jī)挑選的混組酶進(jìn)行測(cè)序證明ITCHY比普通混組方法在兩個(gè)基因的非同源區(qū)發(fā)生了更多的交叉。而且通過ITCHY發(fā)現(xiàn)的嵌合酶比普通DNA混組方法獲得雜合酶的活性相同或更高。

當(dāng)前135頁，總共151頁。SequenceHomology-Independent

ProteinRecombination(SHIPREC)應(yīng)用于膜結(jié)合人細(xì)胞色素P450和可溶性細(xì)菌P450亞鐵血紅素結(jié)構(gòu)域的混組，將混組基因庫和氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶基因融合，篩選到2個(gè)在細(xì)菌中可溶性比人P450高的P450雜合酶。當(dāng)前136頁，總共151頁。

error-pronePCR2-6nucleotidemutations/DNAmolecule1-3aminoacidsubstitutions/proteinmoleculeDNAshufflinghighhomologyatDNAlevel(>60%identity)

-fragmentationbyDNase(multiplerecombination) -restrictionenzymes(multiplerecombination)lowhomologyatDNAlevel

-domainswapping(single-siterecombination;ITCHY) -shufflingof“syntheticgenes”(multiplerecombination)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化