DNA合成誤差校正

ErrorcorrectioningenesynthesistechnologyTrendsinBiotechnologyMarch2012,Vol.30,No.3

基因的合成通常是用酶組裝通過(guò)化學(xué)方法合成的寡聚合甘酸，合成的結(jié)果不可避免的出現(xiàn)缺失、插入和堿基替換等情況，基因合成的保真度是確保基因正確表達(dá)的首要條件，在自然條件下，不管原核還是真核生物其合成基因的錯(cuò)誤率一般在1/107左右，而我們?nèi)藶榈幕蚝铣善溴e(cuò)誤率一般在1/102左右.本文介紹了一些基因合成過(guò)程中校正技術(shù)。1)合成寡核苷酸過(guò)程中的錯(cuò)誤刪除。2)合成基因過(guò)程中的錯(cuò)誤刪除。2.1)用MutS錯(cuò)誤不協(xié)調(diào)綁定蛋白消除錯(cuò)誤。2.2)用不協(xié)調(diào)切斷酶校正錯(cuò)誤。目錄亞磷酰胺法示意圖合成流程1）1）主要錯(cuò)誤的形式：第一、亞磷酰胺單體沒(méi)能結(jié)合到延伸鏈上，導(dǎo)致出現(xiàn)缺失出現(xiàn)，出錯(cuò)率在1.5%~0.5%左右。第二、尚未耦合的鏈被乙?；K止反應(yīng)，導(dǎo)致提前終止合成，出錯(cuò)率在0.5%左右。第三、第二步合成過(guò)量的催化劑會(huì)導(dǎo)致DMT脫保護(hù)，然后再結(jié)合一份子亞磷酰胺而導(dǎo)致插入的出現(xiàn)，出錯(cuò)率在0.4%左右.1）錯(cuò)誤的排除方法用HPLC和PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）通過(guò)長(zhǎng)度大小的不同對(duì)其進(jìn)行純化。疏水的凈化筒可以對(duì)尚未脫去DMT保護(hù)基的Oligos進(jìn)行純化，用這兩種方法可以除掉90%的雜質(zhì)（大部分是插入、刪除和切斷）。缺點(diǎn)是：人力勞動(dòng)量太大，而且沒(méi)辦法除去堿基替換和單個(gè)堿基的插入或刪除。2)

盡管對(duì)Oligos經(jīng)過(guò)了繁瑣的純化還是有一部分錯(cuò)誤會(huì)隨著Oligos進(jìn)入下游的合成中，而且在聚合酶的延伸過(guò)程中也會(huì)引入一些新的錯(cuò)誤，例如錯(cuò)配等。選擇一個(gè)正確無(wú)誤的基因序列經(jīng)常要用到克隆測(cè)序的方法，此外表達(dá)分析和functionalscreens也經(jīng)常用于檢查基因的正確與否，但是這種方法只對(duì)蛋白的編碼區(qū)域有效，對(duì)其他不表的區(qū)域無(wú)效。2)對(duì)于長(zhǎng)鏈DNA的合成一般是通過(guò)合成長(zhǎng)度小于1kb的BB，測(cè)序正確之后再把BB連成長(zhǎng)的基因.下面介紹一大類在基因合成過(guò)程中排除錯(cuò)誤的方法：用MutS錯(cuò)誤不協(xié)調(diào)綁定蛋白消除錯(cuò)誤；

用不協(xié)調(diào)切斷酶校正錯(cuò)誤。作用機(jī)理如圖所示2)2.1）

MutS蛋白是一種細(xì)菌的MutHLS錯(cuò)配修復(fù)器的一部分，它能夠識(shí)別并綁定各種錯(cuò)配堿基。在變性和再次退火之后，錯(cuò)誤包含在異源雙鏈核酸分子中，用MutS蛋白把含有錯(cuò)誤的鏈給綁定，通過(guò)凝膠電泳來(lái)分離。這種方法經(jīng)一次處理能使錯(cuò)誤減小到1/3.5kb，其缺陷是需要其自身大量雙聯(lián)是正確無(wú)誤的。對(duì)于錯(cuò)誤多的可以采用以下方法，這種方法叫consensusshuffling,DNA經(jīng)過(guò)退火后，加入限制性內(nèi)切酶的混合物，然后加入到固載有MutS蛋白的筒形過(guò)濾器中，洗脫再做一個(gè)菌落PCR即可消除錯(cuò)誤。MutS錯(cuò)誤不協(xié)調(diào)綁定蛋白消除錯(cuò)誤核酸內(nèi)切酶2.1）2.2）用不協(xié)調(diào)切斷酶校正錯(cuò)誤

不協(xié)調(diào)切斷酶是說(shuō)一類能夠在異源雙鏈核酸分子中識(shí)別和切斷錯(cuò)配序列的限制性內(nèi)切酶，它可以分為三類：第一類是游離酶，例如：噬菌體T4內(nèi)切酶VII，T7內(nèi)切酶I，大腸桿菌核酸內(nèi)切酶V；第二類是錯(cuò)配修復(fù)核酸內(nèi)切酶MutH；第三類是單鏈特異性核酸酶，例如：S1核酸酶，P1核酸酶，綠豆核酸酶，CEL核酸酶。

游離酶的作用機(jī)制：

Thereannealedheteroduplexesarecleavedinbothstrandsbymismatch-specificenzymes2–5bpdownstreamofthemismatches,generatingstaggerendsthatareimmediatelydissociatedatthereactiontemperature.Thesingle-strandedoverhangsthatcontainmismatchbasesaredegradedbyanexonucleaseinthereactionmixture.Full-lengthgeneswithfewererrorsarerecoveredbyoverlapassemblyPCR錯(cuò)配修復(fù)核酸內(nèi)切酶MutH大腸桿菌的MutH,MutL和MutS蛋白構(gòu)成的細(xì)菌錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制：首先是MutS檢出并綁定錯(cuò)配堿基和single-strandloops，然后MutH和MutL一起作用于MutS綁定的突變體，在兩股鏈不匹配的地方產(chǎn)生切口，再通過(guò)解旋酶和外切酶的作用是錯(cuò)配位點(diǎn)形成平末端。形成的缺口可以用聚合酶和連接酶補(bǔ)齊。單鏈特異性核酸酶單鏈特異性的核酸酶在一定程度上非常專一性的作用特定的錯(cuò)誤為類型，例如：SI和P1核酸酶能夠更有效作用于富含AT的區(qū)域，S1不能夠識(shí)別單個(gè)不匹配的堿基，而綠豆核酸酶在pH6–6.5的條件下能夠切除一定量單個(gè)堿基的突變。CEL核酸內(nèi)切酶是第一個(gè)從真核生物中發(fā)現(xiàn)的核酸內(nèi)切酶，它能夠作用于各種類型的堿基的錯(cuò)配和DNA的畸變。

CEL核酸內(nèi)切酶作用機(jī)制：錯(cuò)配的堿基先通過(guò)CEL核酸內(nèi)切酶切開(kāi)和再用PhusionDNApolymerase校正，這種方法非常適合于錯(cuò)誤較多的合成序列。低質(zhì)量的合成序列經(jīng)過(guò)退火一般都會(huì)產(chǎn)生少量的無(wú)誤的雙鏈DNA，CEL核酸內(nèi)切酶在異源雙鏈核酸分子中緊挨著錯(cuò)誤位點(diǎn)切開(kāi)，PhusionDNApolymerase切掉錯(cuò)誤的位點(diǎn)，最后無(wú)誤的DNA片段通過(guò)PCR組裝成全長(zhǎng)的基因。steps:(i)reannealingofassembledgeneconstructstopresenterroneousbasesasmismatches;(ii)CELnucleasecleavageonbothstrandsatthe3`sideofthemismatches;(iii)exonucleasetrimmingofsingle-strandedmismatchoverhangsbyaddedexonucleaseorthe3-5exonucleaseactivityoftheproofreadingPCRenzyme;and(iv)reasse