掃描電子顯微鏡樣品制備

掃描電子顯微鏡樣品制備小組成員：裘英華，張國榮，薛曉波，儲鋼，金志華2010-1-6掃描電鏡相比透射電鏡的一大優(yōu)點：樣品制備簡單。但不意味著樣品制備可以隨意進行。忽視樣品制備，往往影響檢測結(jié)果。掃描電子顯微鏡的成像是靠觀察物體表面發(fā)射的電子。掃描電子顯微鏡是用聚焦電子束在樣品表面掃描。電子激發(fā)樣品表面的原子放電，釋放出微細的二次電子，用檢測裝置可以捕獲它們，然后通過類似電視機的原理將樣品圖象呈現(xiàn)出來。1.掃描電子顯微鏡原理二次電子對檢測器的作用取決于樣品表面的性質(zhì)，當電子激發(fā)樣品表面突起部位時，會有大量二次電子進入檢測器，而表面凹陷處則只有少量二次電子進入，所以可以顯出反差突出、明暗清晰的三維圖象。而且它的成像焦深較長，圖象的立體感強，和肉眼所見差別不大。制備掃描電子顯微鏡的樣品也先要經(jīng)過固定、脫水等處理，以免在真空條件下變形失真，為了獲得較多的二次電子，表面要噴涂重金屬和碳原子。2.

對樣品要求不會被電子束分解。在電子束掃描下熱穩(wěn)定性要好。能提供導(dǎo)電和導(dǎo)熱通道。大小與厚度要適于樣品臺的安裝。觀察面應(yīng)該清潔，無污染物。進行微區(qū)成分分析的表面應(yīng)平整。3.

介紹幾種樣品制備方法塊狀樣品粉末樣品生物樣品3.1

塊狀樣品制備塊狀試樣掃描電鏡的試樣制備是比較簡便的。對于塊狀導(dǎo)電材料，除了大小要適合儀器樣品座尺寸外，基本上不需要進行什么制備，用導(dǎo)電膠把試樣粘結(jié)在樣品座上，即可放在掃描電鏡中觀察。對于塊狀的非導(dǎo)電或?qū)щ娦暂^差的材料，要先進行鍍膜處理，在材料表面形成一層導(dǎo)電膜。以避免電荷積累，影響圖象質(zhì)量。并可防止試樣的熱損傷。

試樣與樣品座的粘結(jié)情況(b)合理粘結(jié)(a)

不合理粘結(jié)蒸鍍膜試樣

粘結(jié)劑試樣座對于金屬、巖礦或無機物，切割成要求的尺寸，粘在樣品臺上。如果樣品數(shù)量多，注意樣品尺寸最好一致。微區(qū)成分分析樣品表面應(yīng)該平坦或經(jīng)研磨拋光，可以保證檢測時幾何條件不變。對于樣品的斷口面，要選擇起伏不大的部位，最好是分析點附近有小的平坦區(qū)。樣品表面和底面應(yīng)該平行。3.2

粉末樣品制備1直接撒粉法

將粉末直接撒在清潔光亮的樣品臺上,滴一滴0.5%火棉膠醋酸戊脂溶液于試樣邊沿,火棉膠液立即浸潤粉末,再把試樣臺水平輕輕晃動幾下,使試樣分布平整、均勻,并用電熱風吹干,粉末固定在樣品臺上即可放入電鏡內(nèi)進行觀察。

優(yōu)點：制樣方法簡單,但均勻性差,適應(yīng)于一般要求的粗顆粒樣品的觀察。

2導(dǎo)電膠粘結(jié)法

對于150-500um粉末可采用一薄層導(dǎo)電膠將粉末粘在已拋光的銅樣品臺上,其基本做法是先在樣品臺上均勻涂上一層導(dǎo)電膠(Ag膠、石墨孔膠等),然后將粉末撒在上面,把試樣臺面朝下使不與膠層接觸的粉粒脫落,這樣,在表面留下被導(dǎo)電膠粘結(jié)的均勻一層。

制樣的關(guān)鍵：導(dǎo)電膠涂敷要均勻,平整,盡可能薄一些,否則會造成視場起伏或顆粒下陷于膠體內(nèi),造成立體失真。3溶液均勻法

細粉末的分散好壞是決定測量結(jié)果準確性的重要因素。當粉末粒子為0.5-4um或小于0.5um時,其表面活性很大,常常是以互相粘附的二次粒子狀態(tài)存在。

將粉末顆粒放在酒精或乙醚等清潔且又不與粉末發(fā)生反應(yīng)的溶劑中,加入少許分散劑(偏磷酸鈉等),并均勻搖動或用超聲波振蕩器和手動攪拌器結(jié)合等分散方式,使其分散均勻。用吸管將含粉粒的溶液滴到清潔光亮的樣品臺上,再用一根小小的木棒粘上少許酒精在樣品臺表面上留下一層較均勻的粉粒,滴一滴0.5%火棉膠醋酸戊脂溶液于試樣邊沿,并用電熱風吹干即可放入電鏡內(nèi)進行觀察,這種方法特別適合于觀察單顆粒的細微粒子。3.3

生物樣品制備超薄切片實際上是樣品的二維切片，不能表達細胞的三維結(jié)構(gòu)，而且在觀察切片后所拍攝的顯微照片時，容易造成錯誤的印象，用掃描電子顯微鏡(SEM)能直接觀察標本表面的三維空間結(jié)構(gòu)，真實地反映各種細胞表面和斷裂面的形態(tài)特征。掃描電鏡細胞樣品的預(yù)處理包括取材、固定、脫水等。掃描電鏡要求完整且清潔表面，但是在許多樣品的表面常附有粘液、血液、組織液及灰塵等雜物，妨礙著觀察，以致造成對圖像的錯誤解釋，所以，在固定前都必須特別做好表面的清潔工作。葡萄球菌的細胞表面紅血球具體制備步驟1、取材

一般原則與超薄切片相似，但用于掃描電鏡觀察的樣品塊略大，通常為5mm×8mm左右。

2、清洗、固定

鋪片培養(yǎng)的細胞取出浸入磷酸鹽緩沖液（PBS）中，漂洗細胞表面。然后將細胞鋪片放入青霉素小瓶中，加4℃預(yù)冷的3%戊二醛，在4℃固定2h或過夜，吸出固定劑，用PBS浸洗2次，每次10min，再用4℃預(yù)冷的1%鋨酸。在4℃固定1h，然后用PBS浸洗2次，每次10min。3、脫水

丙酮/醋酸異戊酯(1:1)脫水10min，接下來醋酸異戊酯脫水30min，或用系列梯度酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）脫水，每種濃度酒精通過2次，每次15min。4、干燥

以臨界干燥法最理想，但必須要有專門的儀器，只需使用儀器干燥即可。一種消除了物相界面(液相／氣相)，也就是消除了表面張力來源的干燥方法。這種方法由于沒有表面張力的影響，所以樣品不易收縮和損傷。

當實驗室不具備此種儀器時，可采用乙腈干燥法。乙腈干燥法的關(guān)鍵是乙腈置換。將樣品浸入520%的乙腈溶液中，然后依次更換70%、80%、90%、95%、100%的乙腈溶液，每次浸泡15-20min，最后再換100%乙腈。然后進行真空干燥。5、樣品導(dǎo)電處理

將干燥的樣品用導(dǎo)電性好的粘合劑或其他粘合劑粘在金屬樣品臺上，用真空噴鍍法。4.鍍膜樣品不導(dǎo)電，在電子束連續(xù)掃描下，表面會積累負電荷，使樣品表面形成一個較強的負電位，這是充電現(xiàn)象。樣品的負電位抵消掉入射電子部分能量，負電位使二次電子發(fā)射和運動不穩(wěn)定，圖象畸變，亮度變化無常。導(dǎo)電樣品與樣品臺粘接不好同樣也會發(fā)生充電現(xiàn)象。鍍膜材料的要求：導(dǎo)電率好；二次電子產(chǎn)率高；常用Au，Pt或Au-Pd