微生物學(xué) 04 微生物的營(yíng)養(yǎng)

第四章微生物的營(yíng)養(yǎng)第一節(jié)微生物的營(yíng)養(yǎng)要求第二節(jié)培養(yǎng)基第三節(jié)菌種分離及保藏技術(shù)第一節(jié)微生物的營(yíng)養(yǎng)要求一、碳源除水分外，需求最大(占干細(xì)胞重50%)。

1.包括：有機(jī)碳和無(wú)機(jī)碳。

2.功能：提供C和能量。

3.優(yōu)先利用：如葡萄糖效應(yīng)（葡萄糖、乳糖）。二、氮源1.功能：提供N和部分能量。2.種類：無(wú)機(jī)和有機(jī)氮。3.優(yōu)先利用：（NH4）2SO4被認(rèn)為速效氮源。如龜列鏈霉菌（產(chǎn)土霉素），利用玉米漿＞黃豆餅粉和花生餅粉。利用混合氮源，控制菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)代謝物→提高土霉素產(chǎn)量。三、無(wú)機(jī)鹽大量元素(10-4-10-3moL/L)：P、S、K、Mg、Fe、Na等；微量元素(10-8-10-6moL/L）：Cu、Zn、Mn、Mo、Co等，須控制量。功能：酶的激活劑（Mg2+，Mn2+，Zn2+，Cu2+），維持大分子和細(xì)胞結(jié)構(gòu)(Ca,Mg,Fe等)，調(diào)節(jié)滲透壓（Na+）和無(wú)氧呼吸氫受體(NO3-,SO42-)等。四、生長(zhǎng)因子（酶的輔酶或輔基）1.種類維生素（傳統(tǒng)生長(zhǎng)因子），嘌呤、卟啉、甾醇、脂肪酸等。2.微生物對(duì)生長(zhǎng)因子的利用（1）能合成全部：占大多數(shù)（自養(yǎng)型），過(guò)量合成型（鏈霉菌→VB12）。（2）不能或只能部分合成（異養(yǎng)型）須額外添加對(duì)應(yīng)因子；如乳酸菌：添加嘌呤→核苷酸；支原體：添加甾醇。注：菌不同→需生長(zhǎng)因子的種類和數(shù)量不同;同種菌，環(huán)境不同→需生長(zhǎng)因子不同。如魯氏毛霉：在厭氧→需VB1+生物素；好氧→自身合成。五、水1.分為自由水和結(jié)合水。2.水活度(aw)微生物可實(shí)際利用的環(huán)境中自由水的量，或生長(zhǎng)環(huán)境中水的有效性。一定溫度和壓力下，溶液蒸汽壓與同條件下純水蒸汽壓的比值。幾類微生物生長(zhǎng)最適w微生物w一般細(xì)菌0.91酵母菌0.88霉菌0.80嗜鹽細(xì)菌0.70嗜鹽真菌0.65嗜高滲酵母0.60

aw=P/P0

P為溶液蒸汽壓；P0

為純水蒸汽壓

M的aw一般在0.60-0.99之間六、能量化學(xué)物質(zhì)（化能營(yíng)養(yǎng)型）有機(jī)物：化能異養(yǎng)型無(wú)機(jī)物：化能自養(yǎng)型輻射能（光能營(yíng)養(yǎng)型）：光能自養(yǎng)和光能異養(yǎng)七、微生物的營(yíng)養(yǎng)類型按碳源、能源、氫供體劃分。劃分依據(jù)營(yíng)養(yǎng)類型特點(diǎn)碳源能源氫供體自養(yǎng)型異養(yǎng)型光能營(yíng)養(yǎng)型化能營(yíng)養(yǎng)型無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)型有機(jī)營(yíng)養(yǎng)型

CO2為唯一或主要碳源有機(jī)物為碳源光為能源有(無(wú))機(jī)物為能源無(wú)機(jī)物為氫供體有機(jī)物為氫供體營(yíng)養(yǎng)類型碳源能源氫供體光能無(wú)機(jī)自養(yǎng)型光能有機(jī)異養(yǎng)型化能無(wú)機(jī)自養(yǎng)型化能有機(jī)異養(yǎng)型

CO2有機(jī)物（或CO2）CO2有機(jī)物光能光能化學(xué)能(氧化無(wú)機(jī)物)化學(xué)能(氧化有機(jī)物)H2S、水、氫等;藻類、硫細(xì)菌有機(jī)物，如硫細(xì)菌;污水處理氫、H2S、氨等，如硝化細(xì)菌、硫化細(xì)菌等，物質(zhì)循環(huán)有機(jī)物，真菌、原生動(dòng)物，所有病原菌等注：區(qū)分是相對(duì)的。異養(yǎng)菌：有機(jī)物存在→可同化CO2

。自養(yǎng)菌也能利用有機(jī)物。條件變化→營(yíng)養(yǎng)類型改變，如紫色非硫細(xì)菌無(wú)有機(jī)物：自養(yǎng)

；有機(jī)物存在：為異養(yǎng)；厭氧光照：光能營(yíng)養(yǎng)；好氧黑暗：化能營(yíng)養(yǎng)。第二節(jié)培養(yǎng)基人工配制，適合不同微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物所用的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。一、配制培養(yǎng)基的原則二、培養(yǎng)基的類型及應(yīng)用一配制培養(yǎng)基的原則目的明確營(yíng)養(yǎng)協(xié)調(diào)

條件適宜經(jīng)濟(jì)節(jié)約1.目的明確：目的菌、營(yíng)養(yǎng)類型、什么用。2.營(yíng)養(yǎng)協(xié)調(diào)濃度合適，比例協(xié)調(diào)（如C/N）。如水＞C源＞N源＞無(wú)機(jī)鹽＞生長(zhǎng)因子。菌不同，C/N不同，細(xì)菌、酵母菌為5/1，霉菌為10/1。同一種菌，生長(zhǎng)階段不同，C/N也不同。如谷氨酸棒桿菌，菌體生長(zhǎng)C/N為4/1；谷氨酸積累為3/1。3.條件適宜滲透壓，pH，氧化還原電位和水活度。（1）pH細(xì)菌：pH7.0-8.0；放線菌：pH7.5～8.5；酵母和霉菌：pH4.5～6.0。調(diào)pH方法外源調(diào)節(jié)：1mol/L的NaOH和HCl溶液內(nèi)源調(diào)節(jié)磷酸緩沖劑（KH2PO4和K2HPO4）：產(chǎn)生少量酸、堿時(shí)（pH6.4-7.2內(nèi)起調(diào)節(jié)作用）。碳酸鈣：中和培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生大量酸。培養(yǎng)基中天然緩沖物質(zhì)：氨基酸，蛋白質(zhì)。（2）氧化-還原電位（）量度還原劑釋放電子或氧化劑接受電子趨勢(shì)。不同微生物要求值不同。好氧：0.3-0.4V→提高通氣量或加氧化劑；厭氧：+0.1V以下→加還原劑（抗壞血酸、Na2S等）；兼性厭氧：+0.1V→有氧呼吸，-0.1V→發(fā)酵。4.經(jīng)濟(jì)節(jié)約糖蜜（含蔗糖，制糖工業(yè)廢液）乳清（含乳糖，乳制品工業(yè)廢液）麩皮、米糠、豆餅粉、花生餅粉等。5.附-滅菌處理121.3℃，15-20min或115℃，35min。不耐高溫物質(zhì)：先過(guò)濾除菌或間歇滅菌→混合。長(zhǎng)時(shí)間高溫→磷酸鹽、碳酸鹽+某些陽(yáng)離子→沉淀。加EDTA，或分開(kāi)滅菌→混合。6.常見(jiàn)的四種培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，pH7.0-7.2培養(yǎng)放線菌：高氏一號(hào)培養(yǎng)基，pH7.2-7.4培養(yǎng)酵母菌：麥芽汁培養(yǎng)基，自然培養(yǎng)霉菌：查氏培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基，pH自然二、培養(yǎng)基的類型及應(yīng)用（一）按成分來(lái)源劃分（二）根據(jù)物理狀態(tài)劃分（三）按用途劃分（一）按成分來(lái)源劃分1.天然培養(yǎng)基優(yōu)點(diǎn)：配制方便、營(yíng)養(yǎng)多、經(jīng)濟(jì)。缺點(diǎn)：成分雜，不穩(wěn)定，重復(fù)性差。例：肉湯、麥芽汁培養(yǎng)基。用途：研究和生產(chǎn)。2.合成培養(yǎng)基用途：研究。優(yōu)點(diǎn)：重復(fù)性強(qiáng)。缺點(diǎn)：貴、煩瑣、生長(zhǎng)慢。例：高氏一號(hào)、察氏、葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基等。3.半合成培養(yǎng)基用途：廣泛。例：馬鈴薯-葡萄糖培養(yǎng)基。（二）根據(jù)物理狀態(tài)劃分1.固體培養(yǎng)基（1）固化培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基+瓊脂（1.5-2%）或明膠（5-12%）。用途：分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)及保藏。（2）天然固體培養(yǎng)基（3）非可逆性凝固培養(yǎng)基血清凝固或用無(wú)機(jī)硅膠做凝固劑，不能再融化，培養(yǎng)致病菌。注：凝固劑有瓊脂，明膠，硅膠。2.半固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基+瓊脂（0.2-0.7%），如明膠培養(yǎng)基。用途：觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)、噬菌體效價(jià)、厭氧菌的培養(yǎng)和保藏。3.液體培養(yǎng)基4.脫水培養(yǎng)基除水分以外，其他已配制好，如虎紅培養(yǎng)基（孟加拉紅+氯霉素）。（三）按用途劃分1.基礎(chǔ)培養(yǎng)基含所需基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。2.加富培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基+特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(酵母膏,組織液,血液，血清等)。用途：培養(yǎng)苛刻菌，分離富集菌。3.鑒別培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基+指示劑（與微生物代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)）→鑒別菌。名稱指示劑代謝產(chǎn)物特征性變化用途酪素培養(yǎng)基酪素胞外蛋白酶蛋白水解圈鑒別蛋白酶菌株H2S試驗(yàn)培養(yǎng)基醋酸鉛H2S產(chǎn)生黑色沉淀鑒別產(chǎn)H2S的菌株伊紅美藍(lán)乳糖培養(yǎng)基伊紅、美藍(lán)酸反射：綠色金屬光澤透射：紫色菌落鑒別大腸桿菌纖維素水解圈放線菌霉菌4.選擇培養(yǎng)基

（1）根據(jù)特殊營(yíng)養(yǎng)要求或理化抗性設(shè)計(jì)→分離菌種。（2）分類①加特殊營(yíng)養(yǎng)物：如纖維素、蛋白質(zhì)（氮源）或不加氮源（只加甘露醇）；②加抑制劑青霉素+鏈霉素（抑制細(xì)菌和放線菌，分離真菌）；孟加拉紅+鏈霉素+金霉素（分離真菌）；結(jié)晶紫（殺G+，分離G-）；苯酚或重鉻酸鉀（抑制細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)，低濃度對(duì)放線菌無(wú)影響）；制霉菌素（抑制霉菌和皮膚癬菌，分離細(xì)菌和放線菌）。5.其他分析培養(yǎng)基：分析化學(xué)物質(zhì)（如抗生素、維生素）的濃度，或微生物的營(yíng)養(yǎng)要求。還原性培養(yǎng)基：培養(yǎng)厭氧菌。組織培養(yǎng)物培養(yǎng)基：含宿主細(xì)胞，培養(yǎng)病毒、衣原體、立克次氏體和某些螺旋體等。第三節(jié)菌種分離及保藏技術(shù)一、純培養(yǎng)分離技術(shù)固體分離技術(shù)、液體培養(yǎng)分離、單細(xì)胞分離及其選擇培養(yǎng)基分離技術(shù)四種。注：四種技術(shù)相輔相成，互相聯(lián)系。（一）、利用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)1.稀釋倒平皿法和涂布平板法(10X稀釋法，取菌懸液+培養(yǎng)基)2.平板劃線分離法

(連續(xù)劃線,目的是使cell分散)3.稀釋搖管法每只9ml無(wú)菌水涂布平板法稀釋倒平皿法樣品液取1mL樣品1.稀釋倒平皿法和涂布平板法注：無(wú)菌條件下操作；稀釋倒平皿法：溫度45-50℃，長(zhǎng)在培養(yǎng)基表面和內(nèi)部。涂布平板法：長(zhǎng)在培養(yǎng)基表面。玻璃刮棒(涂布器)2.平板劃線法3.稀釋搖管法分離厭氧菌，稀釋倒平板法的變通形式。過(guò)程含培養(yǎng)基的試管（50℃左右）；梯度稀釋樣品，搖勻冷凝。倒滅菌液體石蠟-固體石蠟混合物，培養(yǎng)。挑單菌落。（二）、液體培養(yǎng)基分離法挑較大細(xì)菌、原生動(dòng)物和藻類。用液體培養(yǎng)基梯度稀釋→培養(yǎng)。同一稀釋度，若大多數(shù)試管沒(méi)有菌生長(zhǎng)（＞95%）→有菌生長(zhǎng)的試管→純培養(yǎng)物。（三）、單細(xì)胞分離法顯微鏡下直接挑取。難度與個(gè)體的大小成反比，藻類、原生動(dòng)物易分離，細(xì)菌難分離。（四）、選擇培養(yǎng)基分離法1.直接分離：樣品中目的菌含量多時(shí)。2.加富分離：樣品中目的菌含量少。樣品液直接分離涂布平板法對(duì)氨基苯甲酸為唯一碳源9ml無(wú)菌水取1mL樣品富集分離對(duì)氨基苯甲酸為唯一碳源的液體培養(yǎng)基對(duì)氨基苯甲酸為唯一碳源無(wú)對(duì)氨基苯甲酸，不生長(zhǎng)有對(duì)氨基苯甲酸，生長(zhǎng)二、菌種保藏技術(shù)根據(jù)菌種特性和保藏目的進(jìn)行保存。1.原則（1）選良種，最好是休眠體（分生孢子、芽孢）（2）創(chuàng)造休眠環(huán)境如低溫、干燥、缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)、添加保護(hù)劑等。2.幾種常用保藏方法方法名稱主要措施適宜菌種保藏期評(píng)價(jià)冰箱保藏法(斜面)冰箱保藏法（半固體）石蠟油封藏法*沙土保藏法冷凍干燥法低溫低溫低溫、缺氧干燥、無(wú)營(yíng)養(yǎng)干燥、無(wú)氧、低溫、有保護(hù)劑各大類細(xì)菌、酵母菌各大類**產(chǎn)孢子微生物各大類3~6月6~12月1~2年1~10年5~15年以上簡(jiǎn)便簡(jiǎn)便簡(jiǎn)便簡(jiǎn)便有效簡(jiǎn)便有效3.菌種衰退、復(fù)壯（1）衰退自發(fā)突變→丟失優(yōu)良生產(chǎn)性狀、遺傳標(biāo)記。①原因：基因突變，傳代過(guò)多。②衰退表現(xiàn)菌落和細(xì)胞形態(tài)改變；生長(zhǎng)慢，產(chǎn)孢少；抵抗力減弱；代謝物產(chǎn)量或寄生力下降。③防衰退方法控制傳代次數(shù)；用不易衰退的細(xì)胞傳代（如單核孢子）；選合適培養(yǎng)條件及保藏方法；（2）復(fù)壯①

狹義復(fù)壯:已衰退，找出未衰退個(gè)體。②

廣義復(fù)壯:未衰退前，進(jìn)行純種分離、生產(chǎn)性能測(cè)定→提高性能。③復(fù)壯措施純種分離：平板劃線、涂布、單細(xì)胞挑取等。接入寄主內(nèi)復(fù)壯；淘汰已衰退的個(gè)體（理化條件處理→殺死衰退個(gè)體）。4.國(guó)內(nèi)外菌種保藏機(jī)構(gòu)（1）任務(wù)：收集、保管→不死、不衰、不亂→研究、交換和使用。（2）菌種保藏機(jī)構(gòu)：中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)(CCCCM)

美國(guó)的典型菌種保藏中心(ATCC)

英國(guó)國(guó)家典型菌種保藏所（NCTC）法國(guó)里昂巴斯德研究所（IPL）練習(xí)題1.名詞：生長(zhǎng)因子、培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、水活度、加富培養(yǎng)基、