封閉抗體與免疫治療的臨床意義及應(yīng)用

封閉抗體與免疫治療的臨床意義及應(yīng)用第一頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日封閉抗體與免疫治療的

臨床意義及應(yīng)用深圳博愛(ài)醫(yī)院婦科鈄妙鶯第二頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日最新情況2010年6月12、13日中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院舉辦《全國(guó)女性生殖免疫最新進(jìn)展學(xué)習(xí)班》，共有16個(gè)省100多家醫(yī)院派出醫(yī)生到場(chǎng)學(xué)習(xí)2012年12月15－16日深圳市舉辦的《婦科內(nèi)分泌學(xué)術(shù)會(huì)》，張建平及劉慶芝分別對(duì)《復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的淋巴免疫治療》進(jìn)行了精彩的演講。生殖醫(yī)學(xué)及免疫治療已經(jīng)成為時(shí)下國(guó)內(nèi)醫(yī)療界最熱門(mén)的話題。深圳各大醫(yī)院及民營(yíng)醫(yī)院在復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的免疫治療（LIT）領(lǐng)域目前已逐漸開(kāi)展，其中包括深圳博愛(ài)醫(yī)院。第三頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日概況RSA發(fā)病率：自然流產(chǎn)率5%2次自然流產(chǎn)率1%-5%，平均2.3%3次自然流產(chǎn)率0.34%隱性流產(chǎn)30%—40%總的自然流產(chǎn)率為50%—60%50%原因不明，其中80%與免疫有關(guān)復(fù)發(fā)率：隨著流產(chǎn)次數(shù)的增加而上升第四頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日流產(chǎn)的病因遺傳因素內(nèi)分泌因素解剖因素感染因素血栓前狀態(tài)精神、心理因素免疫因素第五頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日遺傳因素流產(chǎn)胚胎絨毛染色體核型分析夫婦染色體核型分析夫婦雙方珠蛋白生成障礙性貧血G6PD缺乏的篩查及基因檢測(cè)第六頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日內(nèi)分泌因素黃體功能不全多囊卵巢縮合征高泌乳血癥甲狀腺疾病糖尿病檢測(cè)項(xiàng)目有：性激素6項(xiàng)、甲狀腺功能、胰島素功能第七頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日解剖因素子宮畸形：縱膈子宮、單角子宮、鞍狀子宮、雙角子宮子宮動(dòng)脈阻抗增高宮腔粘連子宮肌瘤、子宮腺肌病宮頸機(jī)能不全檢測(cè)方法：超聲波、造影、宮腔鏡、腹腔鏡檢查第八頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日感染因素女性生殖道局部感染包括解脲支原體（UU）、衣原體（CT)、加得納菌（BV）、梅毒螺旋體（TP）、外周血病毒感染等均可造成流產(chǎn)檢測(cè)項(xiàng)目：UU、CT、BV、TORCH、TP等等第九頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日血栓前狀態(tài)多種因素引起的凝血、抗凝和纖溶系統(tǒng)功能失調(diào)或障礙的一種病理過(guò)程，有易導(dǎo)致血栓形成的多種血液學(xué)改變。常用檢沒(méi)項(xiàng)目有凝血常規(guī)四項(xiàng)：血檢前狀態(tài)分子標(biāo)志物，凝血酶原片斷（F1+2），血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM），凝血酶—抗凝血酶復(fù)合物（TAT）、抗凝血酶—Ⅲ（AT—Ⅲ）、血小板顆粒糖蛋白140（GMP140）、血栓烷B2（TXB2）、D二聚體（D—Ⅱ）、纖溶酶原激活物抑制物（PAI）第十頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日精神心理因素焦慮、緊張、恐嚇等嚴(yán)重精神刺激均可導(dǎo)致流產(chǎn)。常期腦力勞動(dòng)孕婦較強(qiáng)烈的長(zhǎng)期或反復(fù)的精神緊張、焦慮、煩躁等情緒變化，使大腦皮質(zhì)興奮抑制過(guò)程的平衡失衡，舒縮血管中樞受影響，子宮小動(dòng)脈痙攣，絨毛缺血，胎兒發(fā)育障礙。第十一頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日免疫因素一、自身免疫型

1、抗心磷酯抗體（APL）

2、抗核抗體（ANA）

3、抗精子抗體（ASA）

4、抗子宮內(nèi)膜抗體（AEA）

5、抗卵巢抗體（AOA）

6、抗滋養(yǎng)細(xì)胞抗體（ATA）

7、RH血型抗體第十二頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日免疫因素二、同種免疫型

1、保護(hù)性抗體缺陷（封閉抗體陰性）

2、淋巴細(xì)胞紊亂（NK細(xì)胞增多）第十三頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日封閉抗體的概念封閉抗體：在正常孕婦的血清中，存在一種抗配偶淋巴細(xì)胞的特異性IgG抗體，它可抑制淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR），封閉母體淋巴細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)的滋養(yǎng)層的細(xì)胞毒作用，防止輔助T細(xì)胞識(shí)別胎兒抗原的抑制物，并可阻止母親免疫系統(tǒng)對(duì)胚胎的攻擊。封閉同種抗原刺激的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF），故稱(chēng)其為封閉抗體（blockingantibodies，BA），或稱(chēng)為（Antipaternallymphocyteantibody，APLA)第十四頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日淋巴細(xì)胞免疫治療的概念淋巴細(xì)胞免疫治療（LIT）：

Beer和Tayor于二十世紀(jì)七十年代創(chuàng)立，并于1978年開(kāi)始應(yīng)用于RSA的一種免疫療法。對(duì)同種免疫型RSA患者彩用丈夫或他人淋巴細(xì)胞進(jìn)行同種致敏治療，抑制母胎間的細(xì)胞性免疫性排斥反應(yīng)，減少流產(chǎn)率。對(duì)于封閉抗體和抗獨(dú)特型抗體缺乏者，主要采用配偶淋巴細(xì)胞免疫療法，等到患者體內(nèi)抗體水平升高時(shí)進(jìn)行受孕，妊娠的成功率可達(dá)到90%。第十五頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日免疫性自然流產(chǎn)分類(lèi)Ⅰ類(lèi)：同種免疫型HLA相容性升高，封閉抗體缺乏

1、正常妊娠：父源性HLA抗原刺激母體，產(chǎn)生封閉抗體。母－胎耐受，妊娠成功

2、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)夫婦HLA—DQA（DQAI）相容性過(guò)大，封閉抗體不產(chǎn)生。免疫攻擊，自然流產(chǎn)

3、特性：缺少封閉抗體，多次流產(chǎn)后可誘發(fā)Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、

Ⅴ類(lèi)免疫異常的流產(chǎn)

4、淋巴細(xì)胞免疫治療（LIT）是最理想的治療方法第十六頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日免疫性自然流產(chǎn)分類(lèi)Ⅱ類(lèi)：抗磷脂抗體APL（+）抗磷脂自身抗體包括：抗心磷脂抗體（ACL）、抗磷脂乙醇胺抗體（APEA）、狼瘡抗凝血因子（CAC）、抗磷脂酰肌醇抗體（APIL）、和抗磷酸抗體（APAA）。RSA患者APL（+）22%，每流產(chǎn)一次發(fā)生率增加15%。特征：強(qiáng)烈的凝血活性、直接造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的功能治療：阿司匹林+肝素治療第十七頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日免疫性自然流產(chǎn)分類(lèi)Ⅲ類(lèi)：抗核抗體陽(yáng)性ADA（+）和抗DNA抗體（+）。占RSA婦女的22%，在不孕或IVF失敗的婦女中占50%。有自身免疫性疾病的婦女——關(guān)節(jié)炎和器管炎癥及無(wú)自身免疫性疾病的婦女——種植時(shí)胚胎周?chē)l(fā)炎，種植后胎盤(pán)發(fā)炎。特征：對(duì)抗胎兒和胎盤(pán)DNA治療：強(qiáng)的松治療，繼發(fā)于關(guān)節(jié)炎或SLA者與風(fēng)濕免疫科一起治療。第十八頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日免疫性自然流產(chǎn)分類(lèi)Ⅳ類(lèi)：抗精子抗體ASA和/或APL等組織特異性抗體陽(yáng)性。不孕、種植失敗和RSA的病人約10%產(chǎn)生ASA。特征：受孕困難治療：肝素+阿斯匹林+強(qiáng)的松治療下列情況需要檢測(cè)ASA：

1、抗絲氨酸中抗乙醇胺抗體陽(yáng)性的婦女

2、性交后試驗(yàn)不良的婦女（在宮頸粘液中精子死亡或不活動(dòng)）

3、配偶有ASA陽(yáng)性第十九頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日免疫性自然流產(chǎn)分類(lèi)Ⅴ類(lèi)：NK細(xì)胞數(shù)量和功能紊亂特征：CD56+、CD19+5+細(xì)胞數(shù)量或/和活性升高，分泌TNF和抗神經(jīng)轉(zhuǎn)移因子抗體兩類(lèi)NK細(xì)胞可損傷妊娠

CD56+產(chǎn)生TNF、損害蛻膜細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞

CD19+5+產(chǎn)生抗神經(jīng)轉(zhuǎn)移因子抗體，破壞滋養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的激素（如雌激素、黃體酮和HCG）不良結(jié)果：妨礙種植（多次種植失?。?、損傷胎盤(pán)細(xì)胞、損害孕囊（孕囊變形）、絨毛下出血（有時(shí)僅B起發(fā)現(xiàn)）、影響卵細(xì)胞DNA，致胚胎質(zhì)量不良治療

LIT、IVIg、代理妊娠第二十頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日免疫治療淋巴細(xì)胞免疫治療（LIT）適應(yīng)癥

1、Ⅰ類(lèi)免疫紊亂（封閉抗體缺乏）

2、不明原因RSA3、夫婦DQ—a相容性大，或夫婦間有2個(gè)或2個(gè)以上相同的HLA抗原

4、無(wú)抗父親淋巴細(xì)胞毒抗體

5、微細(xì)胞毒交叉試驗(yàn)陰性

6、全身免疫狀態(tài)正常

7、夫妻雙方均愿意接受治療第二十一頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日免疫治療淋巴細(xì)胞來(lái)源

1、丈夫淋巴細(xì)胞

2、無(wú)關(guān)個(gè)體淋巴細(xì)胞

3、血緣親屬淋巴細(xì)胞

4、自身淋巴細(xì)胞第二十二頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日免疫治療治療方法

1、配制淋巴細(xì)胞濃縮液

2、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)為：3—4×107/ml3、雙側(cè)前臂皮內(nèi)或皮下多點(diǎn)注射（通常注射6—8針）

4、每2—4周一次，每療程4次

5、封閉抗體上升，或微細(xì)胞毒交叉試驗(yàn)陽(yáng)性即可受孕，受孕后繼續(xù)LIT治療3—5周期

6、妊娠成功率達(dá)75%—85%。第二十三頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日封閉抗體檢測(cè)方法：ELISA原理：用抗原包被微量板孔，制成固相載體，加患者血清到板空中其所含的抗體特異性地與固相載體中存在的抗原相結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，除去多余的雜質(zhì)后，加入辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的IgG抗體，使之與上述免疫復(fù)合物反應(yīng)。洗板，除去多余的結(jié)合物，加入底物，與其酶結(jié)合的免疫復(fù)合物反應(yīng)，產(chǎn)生有顏色產(chǎn)物，顏色強(qiáng)度與特異性抗體含量成正比。第二十四頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日封閉抗體檢測(cè)操作步驟：

1、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1.1實(shí)驗(yàn)記錄表上填寫(xiě)待檢病人的詳細(xì)資料，包括姓名和編號(hào)。

1.2一塊干板可同時(shí)人測(cè)十個(gè)樣本，如不需檢測(cè)十個(gè)樣本，可用封板膜將無(wú)需使和的實(shí)難孔及對(duì)照孔封實(shí)

2、實(shí)驗(yàn)操作

第二十五頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日封閉抗體檢測(cè)2.190ulAntibodyDiluent加入10AntibodyDiluent,搖勻，加入第一行C—H孔，第二行以C—E孔，每孔0ul.

2.2每份待檢血清取20ul加入AntibodyDiluent搖勻，分別加入3—12行A—D孔（每人一人）每孔10ul.2.337℃孵育45分鐘。

2.4配備1×Washbuffer：取27ml蒸餾水加入

3ml10×Washbuffer，搖勻。第二十六頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日封閉抗體檢測(cè)操作步聚：

2.5孵育45分鐘后將反應(yīng)板扣干，用1×Washbuffer洗板兩次，扣干。

2.6稀釋酶標(biāo)抗體：取594ulAntibodyDiluent加入

6ulAlkalinePhosphataseConjugated(此為10人次所需試劑），搖勻。

2.7實(shí)驗(yàn)孔及對(duì)照孔均加入已稀釋本科標(biāo)抗體10ul，

37℃孵育30分鐘。第二十七頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日封閉抗體檢測(cè)2.8扣干，用1×Washbuffer洗板三次，扣干。

2.9各取SubstrateA、B300ul，混勻，加入各孔10ul.2.10避光孵育10分鐘（37℃）。加入5ulStopReagent終止反應(yīng)。

2.11在已經(jīng)設(shè)置好的酶標(biāo)儀上進(jìn)行讀數(shù)，觀察記錄結(jié)果蘭色為陽(yáng)性，無(wú)色為陰性。（或都采用酶標(biāo)儀讀板）。第二十八頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日小結(jié)在反復(fù)性流產(chǎn)患者中，在排除如染色體遺傳、內(nèi)分泌、生理解剖、感染、血栓等多種因素外，免疫因素是反復(fù)流產(chǎn)發(fā)病的重要病因。免疫困素分為自身免疫型和同種免疫型，封閉抗體缺乏是導(dǎo)致免疫性反復(fù)流產(chǎn)的主要原因。淋巴細(xì)胞免疫治療在臨床應(yīng)用方面治療反復(fù)性流產(chǎn)取得顯著成效。第二十九頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日我院淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療的介紹和體會(huì)信息資料：取我院2010年12月-2012年12月不明原因早期自然流產(chǎn)（包括生化妊娠，IVF-ET種植失?。┘芭咛ネＳ?次或2次以上，且臨床篩查確診為封閉抗體缺乏所致的RSA患者共80例，愿意接受淋巴細(xì)胞免疫治療者40例列為治療組，采用淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫進(jìn)行治療(LIT)。另40例作為對(duì)照組，對(duì)照組采用傳統(tǒng)保胎治療（黃體酮加HCG）。第三十頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日我院淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療的介紹和體會(huì)本研究淋巴細(xì)胞免疫治療應(yīng)符合下列條件：（1）封閉抗體檢查陰性；（2）生化妊娠及早期（12W前）自然流產(chǎn)史≥2次，或胚胎停育≥2次，或自然流產(chǎn)+胚胎停育≥2次；（3）夫婦雙方染色體檢查正常，無(wú)家族遺傳病史第三十一頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日我院淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療的介紹和體會(huì)（4）雙方行TORCH（包括巨細(xì)胞病毒、風(fēng)疹病毒、單純皰疹病毒和弓形體）、梅毒、HIV、乙型肝炎、丙型肝炎檢查均為陰性；（5）生殖道衣原體、支原體、淋球菌等檢查均為陰性；（6）內(nèi)分泌檢查、甲狀腺功能及空腹血糖正常第三十二頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日我院淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療的介紹和體會(huì)（7）抗精子抗體、抗子宮內(nèi)膜抗體、抗卵巢抗體、抗心磷脂抗體均為陰性；（8）排除生殖道畸形和形態(tài)學(xué)異常；（9）男方精液分析正常；（10）治療前3個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)調(diào)節(jié)免疫功能藥物，未經(jīng)任何免疫治療。第三十三頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日我院淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療的介紹和體會(huì)淋巴免疫的治療方法：無(wú)菌下抽取患者丈夫或血緣親屬或無(wú)關(guān)自愿健康個(gè)體靜脈血20ml，肝素抗凝；在無(wú)菌條件下分離淋巴細(xì)胞；將淋巴細(xì)胞懸液裝于注射器中，給予患者兩前臂內(nèi)側(cè)行多點(diǎn)皮下或皮內(nèi)注射，每側(cè)注射3-4點(diǎn)，共6－8點(diǎn)。第三十四頁(yè)，共三十