同源重組修復(fù)和合成致死的重要研究進(jìn)展,醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)論文

同源重組修復(fù)和合成致死的重要研究進(jìn)展,醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)論文DNA雙鏈斷裂〔DNAdoublestrandsbreakage,DSB〕是細(xì)胞遭到電離輻射后生物學(xué)上最嚴(yán)重的損傷。DNA損傷激活細(xì)胞內(nèi)DNA損傷應(yīng)答〔DNAdamageresponse,DDR〕，產(chǎn)生細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯以及DNA損傷修復(fù)等一系列生物學(xué)效應(yīng)。DSB修復(fù)有同源重組〔Homologousrecombination,HR〕和非同源重組末端連接〔Non-homologousend-joining,NHEJ〕修復(fù)兩種方式。本文著重介紹HR修復(fù)分子機(jī)制、影響因素、合成致死及其與NHEJ修復(fù)的關(guān)系，并討論其臨床應(yīng)用的潛在可行性。DNA損傷啟動(dòng)多種修復(fù)機(jī)制，華而不實(shí)HR修復(fù)是保衛(wèi)基因組完好性的重要機(jī)制，介入DNA單鏈斷裂〔Singlestrandbreakage,SSB〕導(dǎo)致的復(fù)制叉斷裂和鏈間交聯(lián)以及DSB的修復(fù)，以姐妹染色單體為DNA模板，是無錯(cuò)誤修復(fù)通路，只發(fā)生在S期和G2期[1].放射生物學(xué)家們從20世紀(jì)早期已著手HR修復(fù)與DSB的關(guān)系的研究，本文僅以時(shí)間點(diǎn)為線索回首HR修復(fù)和合成致死的重要研究進(jìn)展，詳見圖1.1同源重組修復(fù)機(jī)制、影響因素及其合成致死效應(yīng)HR修復(fù)的主要成分包括MRN〔MRE11RAD50NBS1〕復(fù)合體，RAD51、RAD51同源異構(gòu)體、RAD52〔在酵母菌中〕、RAD54,牽涉BRCA1、CtIP〔CtBPinteractingprotein〕、ATM、ATR、PALB2〔PartnerandlocalizerofBRCA2〕、BRIP1〔BRCA1interactingproteinC-terminalhelicase1〕等因子[1-2].1.1HR修復(fù)機(jī)制HR修復(fù)分為3個(gè)時(shí)期：〔1〕聯(lián)會(huì)前期；〔2〕聯(lián)會(huì)期；〔3〕聯(lián)會(huì)后期[1-3].1.1.1聯(lián)會(huì)前期MRN復(fù)合體與DNA斷端結(jié)合啟動(dòng)HR修復(fù)，Mre11與CtIP啟動(dòng)5-3切除經(jīng)過[4].核酸外切酶1和具有解螺旋酶-核酸內(nèi)切酶功能的STR-Dna2復(fù)合體共同作用持續(xù)產(chǎn)生ssDNA.RPA覆蓋切除的DNA斷端，限制二級(jí)構(gòu)造構(gòu)成，促進(jìn)RAD52介導(dǎo)的重組酶RAD51裝載。RAD51在ssDNA上構(gòu)成前聯(lián)會(huì)核蛋白纖維[1,3].1.1.2聯(lián)會(huì)期RAD51-ssDNA聯(lián)會(huì)前核蛋白纖維介導(dǎo)同源序列的尋找和DNA鏈侵入，這是HR修復(fù)核心反響。靶DNA與RAD51核蛋白纖維之間的DNA鏈配對(duì)構(gòu)成D-loop,包括新異源雙鏈DNA和供體DNA移位的鏈[3].RAD54協(xié)助RAD51尋找DNA同源序列、Holliday聯(lián)合分支的遷移及RAD51取代侵入DNA和啟動(dòng)DNA修復(fù)的經(jīng)過[5].1.1.3聯(lián)會(huì)后期以3-斷端為引物進(jìn)行DNA合成，RAD51與dsDNA分離，暴露DNA合成所需的3-OH[1].第二個(gè)DSB斷端與擴(kuò)展的D-loop平行，構(gòu)成雙Holliday聯(lián)合，在解離酶作用下這些對(duì)稱構(gòu)造產(chǎn)生交換型或非交換型產(chǎn)物[3].1.2HR修復(fù)的影響因素HR修復(fù)受RAD51、BRCA1、BRCA2等因子調(diào)控。BRCA1的腫瘤抑制因子活性依靠其細(xì)胞周期檢查點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄、蛋白泛素化、凋亡和DNA修復(fù)方面的功能，受BRCT磷酸蛋白辨別區(qū)域調(diào)節(jié)。Rad50、RAD51和H2AX的募集經(jīng)過依靠BRCA1,BRCA1缺失細(xì)胞喪失使RAD51集中于DNA損傷區(qū)域的能力，導(dǎo)致HR和NHEJ修復(fù)、S期和G2-M期細(xì)胞周期檢查點(diǎn)均存在缺陷[5-6].間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)型〔Mesenchymalepithelialtransition,MET〕抑制劑下調(diào)MET活性，減少RAD51移入細(xì)胞核并阻斷RAD51-BRCA2復(fù)合體之間互相作用，致HR修復(fù)受損，H2AX消退延遲，細(xì)胞內(nèi)DSB持續(xù)高水平[7].CDK1、2〔Cyclindependentkinase1,2〕磷酸化BRCA2,調(diào)節(jié)其與RAD51互相作用，促進(jìn)S/G2期HR修復(fù)[8].總之，HR修復(fù)是諸多因子共同作用互相協(xié)調(diào)的經(jīng)過，這些因子失活或步驟中斷都會(huì)對(duì)HR修復(fù)的最終效應(yīng)產(chǎn)生影響。1.3合成致死合成致死〔Syntheticlethality〕指2個(gè)或以上基因同時(shí)突變的遺傳組合導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而這些基因中任意一個(gè)基因突變都不會(huì)引起細(xì)胞死亡。HR修復(fù)缺陷腫瘤細(xì)胞中常見BRCA1和BRCA2等基因突變，此背景下應(yīng)用特異性靶向藥物抑制特定基因表示出，產(chǎn)生合成致死效應(yīng)。其治療策略意義是在DNA損傷修復(fù)缺陷腫瘤細(xì)胞中抑制其他修復(fù)通路促進(jìn)合成致死效應(yīng)；可以抑制預(yù)先存在細(xì)胞周期檢查點(diǎn)缺陷或修復(fù)缺陷細(xì)胞的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，增加損傷DNA聚集和促進(jìn)細(xì)胞死亡[9].2HR修復(fù)與NHEJ修復(fù)的關(guān)系對(duì)IR所致的DSBHR與NHEJ修復(fù)具有互補(bǔ)作用。一個(gè)決定修復(fù)方式的重要因素是5-3DNA斷端切除，啟動(dòng)NHEJ修復(fù)失敗后進(jìn)行，促進(jìn)HR修復(fù)而非經(jīng)典NHEJ修復(fù)。53BP1阻斷斷端切除抑制HR修復(fù)，是關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[10].DDR因子E3泛素連接酶RNF168促進(jìn)刪除BRCA1的細(xì)胞中H2A/H2AX在K13/15單泛素化和53BP1聚集在損傷區(qū)域，抑制HR修復(fù)[11].HR修復(fù)缺陷細(xì)胞中，易產(chǎn)生錯(cuò)誤的NHEJ修復(fù)是主要修復(fù)方式，染色體易位和重組的頻率增加。G2期兩條通路均有效時(shí)，優(yōu)先選擇不易產(chǎn)生錯(cuò)誤的HR修復(fù)[12].3HR修復(fù)研究的潛在臨床意義DSB修復(fù)異常作為腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)，近年來遭到廣泛關(guān)注和研究。3.1HR修復(fù)與疾病發(fā)生和預(yù)后的關(guān)系BRCA1N端RING構(gòu)造域和C端BRCT構(gòu)造域的遺傳性變異對(duì)易導(dǎo)致遺傳性乳腺癌和卵巢癌[13].BRCA1特定位點(diǎn)錯(cuò)義突變或氨基酸置換影響HR修復(fù)和SSA〔single-strandannealing〕修復(fù)，是遺傳性乳腺癌致病因素[14].BRCA1與50%~85%乳腺癌和15%~45%卵巢癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。BRCA2是啟動(dòng)BRCA1-BRCA2-HR損傷修復(fù)的效應(yīng)器，其遺傳性缺陷與40%~60%乳腺癌和10%~20%卵巢癌終生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[15].部分HR修復(fù)通路因子如PALB、BRIP1、BARD1、MUS81、RAD51等，有抑制腫瘤活性的功能，在抑制乳腺癌和卵巢癌發(fā)病中起主要作用[16].RAD51低表示出見于乳腺癌，高表示出見于胰腺癌。MRE11〔T〕11重復(fù)序列突變見于80%以上結(jié)直腸癌患者中[2].RAD51家族成員XRCC2缺陷時(shí)細(xì)胞內(nèi)HR修復(fù)降低100倍，XRCC2rs3218408與乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，rs3218536與乳腺癌和胰腺癌不良預(yù)后相關(guān)[17].非小細(xì)胞肺癌中RAD51G135C可作為預(yù)測(cè)臨床效果的生物指標(biāo)，攜帶C等位基因患者中位生存率更高層次；且在吸煙和既往吸煙患者中，攜帶C等位基因患者總生存率較GG基因型患者高[18].3.2HR修復(fù)與腫瘤靶向治療的研究進(jìn)展3.2.1合成致死的臨床應(yīng)用HR修復(fù)應(yīng)用于腫瘤靶向治療的一個(gè)重要機(jī)制是合成致死，常見策略有2種：〔1〕以特定DNA修復(fù)通路為靶點(diǎn)；〔2〕細(xì)胞周期檢查點(diǎn)抑制劑。多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶[Poly〔adenosinediphosphate〔ADP〕-ribose〕polymerase,PARP]抑制劑是重要的合成致死靶向藥物。PARP在修復(fù)SSB中的作用是合成致死的基礎(chǔ)。復(fù)制叉碰到SSB,該損傷轉(zhuǎn)換為DSB,NHEJ不能修復(fù)此類只要一個(gè)斷端的DSB,需啟動(dòng)HR修復(fù)；若HR缺陷，則無法修復(fù)。PARP抑制劑〔PARPinhibitor,PARPi〕增加開放型SSB,致復(fù)制相關(guān)DSB數(shù)量增加，最終引起染色單體斷裂和細(xì)胞死亡[9].BRCA變異細(xì)胞對(duì)PARPi敏感性是野生型細(xì)胞的1000倍，PARPi奧拉帕尼治療乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌顯示出顯著療效[5].但50%上皮性卵巢癌HR修復(fù)完好，限制PARPi的應(yīng)用。17-AAG將HR修復(fù)完好腫瘤轉(zhuǎn)變?yōu)镠R修復(fù)缺陷腫瘤，增加上皮性卵巢癌細(xì)胞對(duì)奧拉帕尼的敏感性[19].PARPiVeliparib在三陰乳腺癌和化療抗拒的卵巢癌前臨床試驗(yàn)中顯示單藥活性[2].Rad52促進(jìn)Rad51介導(dǎo)的HR修復(fù)，BRCA1、PALB2、BRCA2缺陷人腫瘤細(xì)胞中刪除RAD52HR修復(fù)速度減緩，染色體異常增加，克隆存活率降低，它們之間存在合成致死關(guān)系。以Rad52為靶點(diǎn)的藥物研發(fā)處于前臨床試驗(yàn)階段[20].應(yīng)用細(xì)胞周期檢查點(diǎn)抑制劑于DNA修復(fù)缺陷細(xì)胞是另一種治療策略。抑癌基因p53為調(diào)控G1/S期檢查點(diǎn)所必需，多種腫瘤細(xì)胞中失活，尤其是BRCA1或BRCA2突變腫瘤細(xì)胞中。ATM-ATR-CHK1通路介入DNA損傷后S和G2期檢查點(diǎn)調(diào)控，CHK1抑制劑增加p53突變細(xì)胞對(duì)放射治療或化學(xué)治療敏感性[9].3.2.2以HR修復(fù)通路因子為靶點(diǎn)的腫瘤治療HR修復(fù)通路主要因子作為腫瘤靶向治療的潛在靶點(diǎn)已被廣泛研究。近年來出現(xiàn)部分以HR修復(fù)為靶點(diǎn)的抗腫瘤新藥，如：〔1〕蛋白酶抑制劑；〔2〕Bcl-abl抑制劑伊馬替尼；〔3〕組蛋白乙酰化酶抑制劑〔Histonedeacetylaseinhibitors,HDACi〕；〔4〕熱休克蛋白HSP90抑制劑17-AAG.特異性抑制劑改變或降低HR修復(fù)通路主要因子功能或活性，抑制其修復(fù)能力以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)導(dǎo)致DSB敏感性的目的，此種治療策略已見于前臨床試驗(yàn)。地西他濱處理多發(fā)性骨髓細(xì)胞激活DDR,促進(jìn)RAD51和53BP1構(gòu)成，聯(lián)合RAD51抑制劑B02增加其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；小劑量HDACiJNJ-26481585干擾DNA損傷修復(fù)通路，提高地西他濱介導(dǎo)的細(xì)胞毒性[21].MRN抑制劑Mirin阻止G2/M期檢查點(diǎn)激活和HR修復(fù)[2].ATM屬于PIKK超家族，G1-S期ATMS367,S1893,和S1981位點(diǎn)脫磷酸化下調(diào)ATM水平，抑制HR修復(fù)[22],其高度特異性小分子ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑KU-55933提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線和致DSB藥物的敏感性，提示該藥的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值[2].刪除特定基因抑制HR修復(fù)，增加腫瘤細(xì)胞放射敏感性，這是具有應(yīng)用前景的增加放射治療敏感性的靶點(diǎn)。研究顯示敲除IGF-1R致HR修復(fù)缺陷，H2AX消除延遲，G1期細(xì)胞放射敏感性增加[23].黏連蛋白〔Cohesin〕由SMC1、SMC3和Rad21組成，磷酸化后激活，DSB構(gòu)成時(shí)聚集并促進(jìn)修復(fù)。敲除53BP1、H2AX和MDC基因后，SMC1、SMC3的磷酸化減少；敲除Rad21引起細(xì)胞周期分布改變，G1期細(xì)胞較S期、G2期、M期多[24].總之，DSB是細(xì)胞遭到電離輻射后發(fā)生的最嚴(yán)重DNA損傷，其修復(fù)機(jī)制復(fù)雜且與腫瘤發(fā)病和治療密切相關(guān)。近年來關(guān)于其修復(fù)機(jī)制研究一直是腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的熱門，華而不實(shí)HR修復(fù)作為保衛(wèi)基因組完好性的重要機(jī)制遭到越