無血清培養(yǎng)基干粉的生產(chǎn)工藝優(yōu)化-翁志兵

4/4無血清培養(yǎng)基干粉的生產(chǎn)工藝優(yōu)化_翁志兵第13卷第5期2015年9月生物加工過程

ChineseJournalofBioprocessEngineeringVol.13No.5Sep.2015

doi：10.3969/j.issn.1672－3678.2015.05.011

收稿日期：2014－08－25

基金項(xiàng)目：上海市科學(xué)技術(shù)委員會科技支撐項(xiàng)目（12431901402）

簡介：翁志兵（1980—），男，江蘇泰興人，工程師，研究方向：無血清培養(yǎng)基及大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)，

E-mail：weng1980@sina．com無血清培養(yǎng)基干粉的生產(chǎn)工藝優(yōu)化

翁志兵1，邵春花1

，胡

輝

2，3

（1．上海中信國健藥業(yè)股份有限公司，上海201203；2．抗體藥物國家工程研究中心，上海201203；

3．上海生物制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海200237）

會很大程度降低培養(yǎng)基的年產(chǎn)能。目前國際上已經(jīng)有培養(yǎng)基公司采用先進(jìn)針磨工藝，其優(yōu)勢在于能實(shí)現(xiàn)無血清培養(yǎng)基的連續(xù)生產(chǎn)，一臺體量很小的針磨設(shè)備就可以與大型球磨機(jī)產(chǎn)能相當(dāng)。但針磨工藝的缺點(diǎn)是設(shè)備高速旋轉(zhuǎn)，產(chǎn)熱量大；熱交換面積小，導(dǎo)致傳熱效率低，對培養(yǎng)基的品質(zhì)也會造成不利影響。同時(shí)，不同的工作溫度對設(shè)備的產(chǎn)能影響很大［3－8］。因此，找到一個(gè)績效比最高的生產(chǎn)溫度就顯得非常重要。目前，國內(nèi)對培養(yǎng)基干粉溫度處理的研究較少，對于針磨的使用缺乏實(shí)際經(jīng)驗(yàn)。

針對針磨工藝導(dǎo)致瞬間溫度提高影響培養(yǎng)基質(zhì)量問題，筆者研究不同溫度長時(shí)間處理的培養(yǎng)基干粉對CHO細(xì)胞培養(yǎng)和蛋白表達(dá)的影響，以確定績效最高的處理溫度。

1材料與方法

1.1材料

表達(dá)抗人源化抗血管內(nèi)皮生長因子單克隆抗體的CHO細(xì)胞由上海中信國健藥業(yè)股份有限公司提供，培養(yǎng)基生產(chǎn)原料由上?？贵w藥物國家工程研究中心有限公司提供。

1.2培養(yǎng)基處理方法

設(shè)定4個(gè)溫度點(diǎn)，分別為40、60、80和100?，處理時(shí)間4h（針磨設(shè)備物料接觸極限值），以原方法處理的作為對照實(shí)驗(yàn)（ＲT）。每個(gè)溫度點(diǎn)加2個(gè)平行試驗(yàn)，以消除實(shí)驗(yàn)誤差可能帶來的影響。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)方法

將細(xì)胞以1?106個(gè)/mL的初始細(xì)胞密度接種于1L搖瓶中，載液量為400mL，培養(yǎng)時(shí)間為10d，pH低于6.8補(bǔ)堿，每天補(bǔ)糖至3g/L，溫度為37?，CO

2

體積分?jǐn)?shù)為5%，轉(zhuǎn)速為125r/min。每天取樣計(jì)數(shù)，并將培養(yǎng)液于10000r/min離心5min，保存上清液于－20?冰箱，用于理化參數(shù)分析。

1.4分析方法

1.4.1細(xì)胞計(jì)數(shù)

每天取樣利用臺盼藍(lán)拒染法染色，使用上海睿鈺生物科技有限公司的Countstar自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀讀取活細(xì)胞密度和細(xì)胞活率，每樣計(jì)數(shù)3次，取平均值。

1.4.2葡萄糖-乳酸測定方法

采用德國Labo公司全自動TＲACE葡萄糖-乳酸分析儀檢測乳酸和葡萄糖濃度，每一樣品重復(fù)檢測1次，取平均值。1.4.3蛋白表達(dá)量測定方法

色譜柱采用AB公司POＲOSA20Columns，2.1mm?30mm，系統(tǒng)采用Agilent1260HPLC。流動相A：50mmol/L磷酸緩沖液，0.1mol/LNaCl，流動相B：0.1%HCl，0.1mol/LNaCl，流動相A和流動相B的比例為3?7；流速1mL/min；檢測波長280nm；進(jìn)樣溫度（5?3）?；柱溫（25?5）?；進(jìn)樣量100μL。1.5統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS19軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與討論

2.1不同溫度處理的培養(yǎng)基對活細(xì)胞密度的影響

研究不同溫度處理的培養(yǎng)基對活細(xì)胞密度的影響，結(jié)果如圖1所示

。

圖1不同溫度處理的培養(yǎng)基對活細(xì)胞密度的影響

Fig.1Effectsofmediumtreatedwithdifferent

temperatureoncelldensity

從圖1可以發(fā)現(xiàn)，100?時(shí)的活細(xì)胞密度最低，可能是由于培養(yǎng)基中的某些成分經(jīng)過100?高溫處理后，會有部分損失，營養(yǎng)成分的減少影響了細(xì)胞的生長繁殖，造成了活細(xì)胞密度較低。在培養(yǎng)基磨制過程中，實(shí)際針磨工藝瞬時(shí)高溫可達(dá)80?以上，對熱敏感物質(zhì)有很大破壞，例如PF68（一種非離子型乙烯和環(huán)氧丙烷共聚物，被用作消泡劑和抗擊細(xì)胞培養(yǎng)中剪切力的細(xì)胞膜穩(wěn)定劑）就會熔化并結(jié)塊。針磨處理培養(yǎng)基原料時(shí)間受設(shè)備處理能力和篩網(wǎng)大小影響，一般接觸時(shí)間約為1030min，因此，控制針磨腔體內(nèi)部溫度尤為重要，一般使用干冰或液氮降溫。合理控溫點(diǎn)可在節(jié)約成本的同時(shí)提高產(chǎn)能。從活細(xì)胞密度來看，40?和對照組差異較小，基本相同，細(xì)胞活力較高。

2.2不同溫度處理的培養(yǎng)基對乳酸的影響

研究不同溫度處理的培養(yǎng)基對乳酸的影響，結(jié)果如圖2所示。

85生物加工過程第13卷

圖2不同溫度處理的培養(yǎng)基對乳酸的影響

Fig.2Effectsofmediumtreatedwithdifferent

temperaturesonlactateconcentration

從圖2可以發(fā)現(xiàn)，100、80?時(shí)的乳酸質(zhì)量濃度較高，達(dá)到1.75g/L以上，60?時(shí)的乳酸濃度居中，40?和對照組的乳酸濃度最低。乳酸濃度較高會抑制細(xì)胞的生長和表達(dá)，對比圖1和圖2可以看出，乳酸濃度較高的，活細(xì)胞密度相對較低。

培養(yǎng)基干粉處理溫度較高時(shí)會對培養(yǎng)基成分造成一定影響，比如谷氨酰胺和轉(zhuǎn)鐵蛋白等［9－10］，這些成分與細(xì)胞生長和代謝相關(guān)，有可能是影響了三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)），能量代謝進(jìn)入了糖酵解途徑或者己糖磷酸支路（HMP）途徑，乳酸濃度升高。乳酸濃度越低，說明能量代謝越徹底，釋放的ATP越多，越有利于細(xì)胞生長和代謝，乳酸濃度高影響細(xì)胞能量代謝，進(jìn)而抑制細(xì)胞生長和表達(dá)。因此，從乳酸濃度來看，40?和對照組最優(yōu)。

2.3不同溫度處理的培養(yǎng)基對目的蛋白表達(dá)量的

影響

研究不同溫度處理的培養(yǎng)基對目的蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)果如圖3所示

。

圖3不同溫度處理的培養(yǎng)基對表達(dá)量的影響

Fig.3Effectsofmediumtreatedwithdifferent

temperaturesonproteinepression

從圖3可以看出，100?處理下的蛋白表達(dá)量最低，僅有2.06g/L；40?處理后的蛋白表達(dá)量和對照組蛋白表達(dá)量最高，分別達(dá)到2.45和2.53g/L。其他溫度處理下的蛋白表達(dá)量均低于40?下的表達(dá)量。100?時(shí)的蛋白表達(dá)量最低，可能是由于培養(yǎng)基中的部分成分經(jīng)過100?高溫處理后，會有部分損耗，營養(yǎng)成分的減少影響了細(xì)胞代謝，造成了蛋白表達(dá)量較低。

2.4單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析

比較不同培養(yǎng)基培養(yǎng)10d后活細(xì)胞密度、乳酸及其目的蛋白表達(dá)量，并進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表1和2所示。

表1各組培養(yǎng)10d后的活細(xì)胞密度、乳酸及其

目的蛋白表達(dá)量的比較

Table1Comparisonoflivecelldensity，lactateconcentrateandtheepressionlevelofaimproteinindifferent

groupsafter10d'sculture（x?s）

組別

溫度/

?

活細(xì)胞密度/

（106個(gè)·mL－1）

ρ（乳酸）/

（g·mL－1）

目的蛋白

表達(dá)量/

（g·mL－1）1ＲT9.3?0.10.8?0.032.53?0.032409.14?0.13①0.84?0.07②2.45?0.05③3607.8?0.181.2?0.12.3?0.074807.2?0.091.57?0.122.1?0.0351006.4?0.081.7?0.082.06?0.09注：①P＞0.1，②P＞0.1，③P＞0.05；與空白比較，其他數(shù)據(jù)P＜0.05。

表2單因素實(shí)驗(yàn)方差分析

Table2One-wasanalysisofvariance

組別方差來源均方MSF值P值顯著性1ＲT2.540.0420.30

2405.140.0830.28

360317.845.320.08*

480461.027.740.05*

51001382.5923.150.03*

由表1和表2可知：100?處理下的活細(xì)胞密度最低，40?處理下的活細(xì)胞密度最高，其他溫度處理下的活細(xì)胞密度與對照組比較均為顯著性差異。40?時(shí)，P＞0.05，為非顯著性差異。40?和對照組的乳酸濃度最低，濃度相差較小，非顯著性差異，較為接近。從蛋白表達(dá)量來看，40?和對照組為非顯著性差異，其他組與對照組為顯著性差異，明顯高于其他處理溫度時(shí)的蛋白表達(dá)量，因此，40?和對照組最優(yōu)。

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第5期翁志兵等：無血清培養(yǎng)基干粉的生產(chǎn)工藝優(yōu)化

3結(jié)論

針對針磨工藝導(dǎo)致瞬間溫度提高影響培養(yǎng)基質(zhì)量問題，筆