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文檔簡介

第八章微生物遺傳第一節(jié)遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)第二節(jié)質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子第三節(jié)誘發(fā)突變——Ams實(shí)驗(yàn)第四節(jié)微生物育種第八章微生物遺傳第一節(jié)遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)1一.DNA作為遺傳物質(zhì)1.Griffith的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(1928年)一.DNA作為遺傳物質(zhì)1.Griffith的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)22.2.33.3.4二.RNA作為遺傳物質(zhì)二.RNA作為遺傳物質(zhì)5一.質(zhì)粒

一種獨(dú)立于染色體外,能進(jìn)行自主復(fù)制的細(xì)胞質(zhì)遺傳因子,主要存在于各種微生物細(xì)胞中。質(zhì)粒分子的大小范圍從1kb左右到1000kb(細(xì)菌質(zhì)粒多在10kb以內(nèi))。一.質(zhì)粒一種獨(dú)立于染色體外,能進(jìn)行自主復(fù)制的細(xì)61.質(zhì)粒的分子結(jié)構(gòu)通常以共價(jià)閉合環(huán)狀(covalentlyclosedcircle,簡稱CCC)的超螺旋雙鏈DNA分子存在于細(xì)胞中,也發(fā)現(xiàn)有線型雙鏈DNA質(zhì)粒和RNA質(zhì)粒。1.質(zhì)粒的分子結(jié)構(gòu)通常以共價(jià)閉合環(huán)狀(cov72.質(zhì)粒的分離堿提取法:①菌體的培養(yǎng)和收集:一般采用豐富培養(yǎng)基對(duì)菌體進(jìn)行培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞生長到指數(shù)期后期時(shí),離心收集細(xì)胞。②溶菌:一般用溶菌酶去壁以形成原生質(zhì)體或原生質(zhì)球。③堿變性處理:在SDS等表面活性劑存在下加NaOH液使pH升至12.4,可使菌體蛋白質(zhì)、染色體DNA以及質(zhì)粒DNA變性。④質(zhì)粒復(fù)性:加入pH4.8的KAc-HAc緩沖液,將提取液調(diào)至中性,由于質(zhì)粒分子量小而容易復(fù)性,并穩(wěn)定存在于溶液中;染色體DNA分子量太大,在復(fù)性過程中形成DNA之間的交聯(lián)導(dǎo)致其形成更大分子的不溶性物質(zhì)。⑤離心分離:經(jīng)高速離心可以使細(xì)胞碎片和已變性的菌體蛋白及染色體DNA一起沉淀2.質(zhì)粒的分離堿提取法:8第八章微生物遺傳課件93.質(zhì)粒的特性(1)位于核基因組外,以cccDNA方式存在;(2)有的質(zhì)??烧系胶巳旧w上;(3)可重組(質(zhì)粒與質(zhì)粒間,質(zhì)粒與染色體間);(4)人為消除(高溫、丫叮類,UV,電離輻射,利福平等);(5)有的質(zhì)粒可在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移(F因子,R因子)(6)質(zhì)粒具有不親和性3.質(zhì)粒的特性(1)位于核基因組外,以cccDNA方式存在;10質(zhì)粒的不親和性(plasmidincompatibility),

有時(shí)也稱為不相容性,是指在沒有選擇壓力的情況下,兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒,不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。在細(xì)胞的增殖過程中,其中必有一種會(huì)被逐漸地排斥(稀釋)掉。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不親和質(zhì)粒。質(zhì)粒的不親和性(plasmidincompatibilit114.質(zhì)粒的主要類型根據(jù)質(zhì)粒所編碼的功能和賦予宿主的表型效應(yīng)分類:致育因子(Fertilityfactor,F(xiàn)因子)抗性質(zhì)粒(Resistancefactor,R因子)產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒(Bacteriocinproductionplasmid)毒性質(zhì)粒(virulenceplasmid)代謝質(zhì)粒(Metabolicplasmid)隱秘質(zhì)粒(crypticplasmid)4.質(zhì)粒的主要類型根據(jù)質(zhì)粒所致育因子(Fertilityf12(1)致育因子(Fertilityfactor,F(xiàn)因子)又稱F質(zhì)粒,其大小約100kb,這是最早發(fā)現(xiàn)的一種與大腸桿菌的有性生殖現(xiàn)象(接合作用)有關(guān)的質(zhì)粒。攜帶F質(zhì)粒的菌株稱為F+菌株(相當(dāng)于雄性),無F質(zhì)粒的菌株稱為F-菌株(相當(dāng)于雌性)。F因子能以游離狀態(tài)(F+)和以與染色體相結(jié)合的狀態(tài)(Hfr)存在于細(xì)胞中,所以又稱之為附加體(episome)。在志賀氏菌屬(Shigella)、沙門氏菌屬(Salmonella)和鏈球菌屬(Streptococcus)等其他細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)了與大腸桿菌類似的致育因子。在放線菌中,天藍(lán)色鏈霉菌含有SCP1和SCP2兩種致育質(zhì)粒,這兩種質(zhì)粒在天藍(lán)色鏈霉菌的接合過程中起重要作用,帶動(dòng)染色體從供體細(xì)胞向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移。(1)致育因子(Fertilityfactor,F(xiàn)因子)13(2)抗性因子(Resistancefactor,R因子)包括抗藥性和抗重金屬二大類,簡稱R質(zhì)粒。R100質(zhì)粒(89kb)可使宿主對(duì)下列藥物及重金屬具有抗性:汞(mercuricion,mer)四環(huán)素(tetracycline,tet)鏈霉素(Streptomycin,str)、磺胺(Sulfonamide,sul)、氯霉素(Chlorampenicol,cml)夫西地酸(fusidicacid,fus)負(fù)責(zé)這些抗性的基因是成簇地存在于抗性質(zhì)粒上。抗性質(zhì)粒在細(xì)菌間的傳遞是細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一。有的質(zhì)??蓴y帶多達(dá)10種抗生素的基因??剐再|(zhì)??梢栽陉P(guān)系相近或關(guān)系疏遠(yuǎn)的菌種間轉(zhuǎn)移。(2)抗性因子(Resistancefactor,R因子)14(3)Col質(zhì)粒:產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒(Bacteriocinproductionplasmid)細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因、涉及細(xì)菌素運(yùn)輸及發(fā)揮作用(processing)的蛋白質(zhì)的基因、賦予宿主對(duì)該細(xì)菌素具有“免疫力”的相關(guān)產(chǎn)物的基因一般都位于質(zhì)?;蜣D(zhuǎn)座子上,因此,細(xì)菌素可以殺死同種但不攜帶該質(zhì)粒的菌株。細(xì)菌素:許多細(xì)菌都能產(chǎn)生某些代謝產(chǎn)物,抑制或殺死其他近緣細(xì)菌或同種不同菌株,因?yàn)檫@些代謝產(chǎn)物是由質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì),不象抗生素那樣具有很廣的殺菌譜,所以稱為細(xì)菌素(bacteriiocin)(3)Col質(zhì)粒:產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒(Bacteriocin15細(xì)菌素種類很多,一般根據(jù)產(chǎn)生菌的種類進(jìn)行命名:大腸桿菌(E.coli)產(chǎn)生的細(xì)菌素為colicins(大腸桿菌素),而質(zhì)粒被稱為Col質(zhì)粒。此外還有枯草桿菌素、乳酸菌素、根瘤菌素等。由G+細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)菌素或與細(xì)菌素類似的因子與colicins有所不同,但通常也是由質(zhì)?;蚓幋a,有些甚至有商業(yè)價(jià)值,例如一種乳酸細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)菌素NisinA能強(qiáng)烈抑制某些G+細(xì)菌的生長,而被用于食品工業(yè)的保藏。大腸桿菌素產(chǎn)自大腸桿菌的一種蛋白質(zhì),具有專一性地殺死其親緣關(guān)系很近的、不具Col質(zhì)粒的其它腸道細(xì)菌的功能。細(xì)菌素種類很多,一般根據(jù)產(chǎn)生菌的種類進(jìn)行命名:16(4)毒性質(zhì)粒(virulenceplasmid)許多致病菌的致病性是由其所攜帶的質(zhì)粒引起的,這些質(zhì)粒具有編碼毒素的基因,其產(chǎn)物對(duì)宿主(動(dòng)物、植物)造成傷害。產(chǎn)毒素大腸桿菌是引起人類和動(dòng)物腹瀉的主要病原菌之一,其中許多菌株含有為一種或多種腸毒素編碼的質(zhì)粒。蘇云金桿菌含有編碼δ內(nèi)毒素(伴孢晶體中)的質(zhì)粒根癌土壤桿菌所含Ti質(zhì)粒是引起雙子葉植物冠癭瘤的致病因子(4)毒性質(zhì)粒(virulenceplasmid)17(5)

代謝質(zhì)粒(Metabolicplasmid)

質(zhì)粒上攜帶有有利于微生物生存的基因,如能降解某些基質(zhì)的酶,進(jìn)行共生固氮,或產(chǎn)生抗生素(某些放線菌)等。降解質(zhì)粒:能將復(fù)雜的有機(jī)化合物降解成能被其作為碳源和能源利用的簡單形式,環(huán)境保護(hù)方面具有重要的意義。如TOL質(zhì)粒:含分解甲苯的基因;CAM-OCT質(zhì)粒:含分解樟腦辛烷的基因假單胞菌:具有降解一些有毒化合物,如芳香簇化合物(苯)、農(nóng)藥(二氯苯氧基乙酸)、辛烷和樟腦等的能力。(5)代謝質(zhì)粒(Metabolicplasmid)18根據(jù)拷貝數(shù)或復(fù)制特點(diǎn),質(zhì)??煞譃椋焊呖截悢?shù)(highcopynumber)質(zhì)粒(每個(gè)細(xì)胞中可以有10~100個(gè)拷貝,其復(fù)制和染色體的復(fù)制不同步)如ColE1、ColE2等

———————松弛型質(zhì)粒(relaxedplasmid)低拷貝數(shù)(lowcopynumber)質(zhì)粒(每個(gè)細(xì)胞中只有1~2個(gè)拷貝,其復(fù)制行為與染色體的復(fù)制同步)如F因子,R100

———————嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒(stringentplasmid)窄宿主范圍質(zhì)粒(narrowhostrangeplasmid)(只能在一種特定的宿主細(xì)胞中復(fù)制)廣宿主范圍質(zhì)粒(broadhostrangeplasmid)(可以在許多種細(xì)菌中復(fù)制)根據(jù)拷貝數(shù)或復(fù)制特點(diǎn),質(zhì)??煞譃椋焊呖截悢?shù)(highcop19二.轉(zhuǎn)座因子細(xì)胞中能改變自身位置的一段DNA稱為轉(zhuǎn)座因子。原核生物的轉(zhuǎn)座因子包括插入序列、轉(zhuǎn)座子和某些特殊病毒。二.轉(zhuǎn)座因子細(xì)胞中能改變自身位置的一段DNA稱20(一)轉(zhuǎn)座因子的種類

1.插入序列(insertionsequence)IRTransposaseGeneIR①二個(gè)分離的反向末端重復(fù)序列

(invertedterminalrepeats,ITR)②一個(gè)轉(zhuǎn)座酶(transposase)編碼基因(一)轉(zhuǎn)座因子的種類

1.插入序列(insertions212.轉(zhuǎn)座子①復(fù)合轉(zhuǎn)座子——Ⅰ類轉(zhuǎn)座子由IS類轉(zhuǎn)座組件構(gòu)成的復(fù)合體。組成:兩端為IS,中間編碼抗生素物質(zhì)②復(fù)雜轉(zhuǎn)座子——Ⅱ類轉(zhuǎn)座子(TnA家族)

攜帶轉(zhuǎn)座和耐藥等基因的獨(dú)立體家族。組成:兩端為ITR,而不是IS,中間編碼區(qū)含轉(zhuǎn)座酶編碼基因,及抗生素抗性和解離酶等編碼基因。IRIRTransposaseGene有用基因2.轉(zhuǎn)座子①復(fù)合轉(zhuǎn)座子——Ⅰ類轉(zhuǎn)座子IRIRTranspo22(二)轉(zhuǎn)座因子的遺傳學(xué)效應(yīng)1.插入突變插到某一基因中,導(dǎo)致該基因突變插到操縱子前半段,引起極性突變插入抗性基因引起抗性突變2.染色體畸變3.基因的移動(dòng)和重排(二)轉(zhuǎn)座因子的遺傳學(xué)效應(yīng)1.插入突變23一.誘發(fā)突變

自發(fā)突變的頻率是很低的,一般為10-6-10-10。許多化學(xué)、物理和生物因子能夠提高其突變頻率,將這些能使突變頻率提高到自發(fā)突變水平以上的物理、化學(xué)和生物因子稱為誘變劑。一.誘發(fā)突變自發(fā)突變的頻率是很低的24

已知的化學(xué)致變劑和物理致變劑

物理致變劑

致變劑

電離輻射、紫外輻射等

化學(xué)致變劑脫氨劑、烷化劑、

大型加合物供體、堿基類似物、 插入劑、交聯(lián)劑。第八章微生物遺傳課件25誘變劑導(dǎo)致表型改變——營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)缺陷型:野生型菌株經(jīng)誘變處理后,由于發(fā)生了喪失某酶合成能力的突變,因而只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基上生長,這類突變菌株就是營養(yǎng)缺陷型?;九囵B(yǎng)基:僅能滿足野生型菌株生長需要的最低成分組合的培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基:可滿足營養(yǎng)缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)需要的培養(yǎng)基。誘變劑導(dǎo)致表型改變——營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)缺陷型:野生型菌株經(jīng)誘變26二.誘變劑與致癌物——Ames試驗(yàn)二.誘變劑與致癌物——Ames試驗(yàn)27埃姆斯實(shí)驗(yàn)1.鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型2.基本培養(yǎng)基3.鼠肝勻漿4.可疑“三致”樣品埃姆斯實(shí)驗(yàn)1.鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型28實(shí)驗(yàn)步驟1.用基本培養(yǎng)基到平板2.將鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型培養(yǎng)液涂在平板上3.將“三致”樣品和鼠肝勻漿混合吸附在濾紙片上,放在平板中央。4.培養(yǎng)2天后看結(jié)果。實(shí)驗(yàn)步驟1.用基本培養(yǎng)基到平板29陽性結(jié)果陰性結(jié)果陽性結(jié)果陰性結(jié)果30誘變育種:是用物理或化學(xué)的誘變劑使誘變對(duì)象內(nèi)的遺傳物質(zhì)(DNA)的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。

誘變育種的實(shí)踐意義:當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門所使用的高產(chǎn)菌株,幾乎毫無例外地都是通過誘變育種而明顯提高其生產(chǎn)性能的。

誘變育種:是用物理或化學(xué)的誘變劑使誘變對(duì)象內(nèi)的遺傳物質(zhì)(DN311.選擇選擇合適的出發(fā)菌株2.制備待處理的菌懸液3.誘變處理4.篩選5.保藏和擴(kuò)大試驗(yàn)誘變育種的基本過程1.選擇選擇合適的出發(fā)菌株誘變育種的基本過程32出發(fā)菌株———用來育種處理的起始菌株

出發(fā)菌株應(yīng)具備:

①對(duì)誘變劑的敏感性高;

②具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力;

出發(fā)菌株的來源;

①自然界直接分離到的野生型菌株:

②歷經(jīng)生產(chǎn)考驗(yàn)的菌株:

③已經(jīng)歷多次育種處理的菌株。1.出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株———用來育種處理的起始菌株

出發(fā)菌株應(yīng)具備:

33要求:

①菌體處于對(duì)數(shù)生長期

②細(xì)胞分散且為單細(xì)胞

方法:

①玻璃珠打散10-15min;

②加0.3%吐溫80(表面活性劑)

③用無菌脫脂棉過濾。

制備:

物理誘變劑——生理鹽水(0.85%NaCl)

化學(xué)誘變劑——緩沖液

濃度:

細(xì)菌、放線菌108個(gè)/ml,霉菌、酵母菌106個(gè)/ml2.制備細(xì)胞懸液要求:

①菌體處于對(duì)數(shù)生長期

②細(xì)胞分散且為單細(xì)胞

方法:

34選擇合適的誘變劑量:

不同種類和不同生長階段的微生物對(duì)誘變劑的敏感程度不同,所以在誘變處理前,一般應(yīng)預(yù)先作誘變劑用量對(duì)菌體死亡數(shù)量的致死曲線,選擇合適的處理劑量。—致死率是最好的誘變劑相對(duì)劑量的表示方法。最適劑量的選擇:

產(chǎn)量性狀的育種中多傾向于低劑量(致死率在70~80%)。3.誘變處理選擇合適的誘變劑量:3.誘變處理35選擇誘變劑的種類:在同樣效果下,應(yīng)選用最方便的因素;在同樣方便的情況下,則應(yīng)選擇最高效的因素。在物理誘變劑中,尤以紫外線為最方便,在化學(xué)誘變劑中,一般可選用誘變效果最為顯著的“超誘變劑”,如NTG。。一種較有效的簡易處理方法的大致操作步驟是:先在平板上涂上出發(fā)菌株細(xì)胞,然后在平板上均勻地放上幾顆很小的誘變劑顆粒(也可放吸有誘變劑溶液的濾紙片),經(jīng)培養(yǎng)后,在制菌圈的邊緣挑取若干突變菌落,分別制成懸浮液,然后將其涂在一般平板表面使長出許多單菌落,最后可用影印培養(yǎng)法或逐個(gè)檢出法選出突變種。選擇誘變劑的種類:36(1)篩選方案:初篩:刪去明確不符合要求的大部分菌株,把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來,使優(yōu)良性狀的菌株不至于漏網(wǎng);——因此,初篩工作以量為主,測定的精確性還在其次;初篩手段應(yīng)盡可能快速、簡單。復(fù)篩:確認(rèn)符合要求的菌株;——復(fù)篩以質(zhì)為主,應(yīng)精確測定每個(gè)菌株的生產(chǎn)指標(biāo)。篩選是最為艱難的也是最為重要的步驟.4.菌種篩選(1)篩選方案:篩選是最為艱難的也是最為重要的步驟.4.菌37①溫度敏感突變株篩選方法:影印法用途:常用于提高代謝物產(chǎn)量原因:是由于某一酶蛋白結(jié)構(gòu)改變后,在高溫下活力喪失(2)突變株篩選舉例①溫度敏感突變株(2)突變株篩選舉例38由谷氨酸產(chǎn)生菌乳糖發(fā)酵短桿菌2256,經(jīng)誘變處理得到溫度敏感變異株Ts88:30℃培養(yǎng)時(shí)能正常生長40℃是死亡,但能在富含生物素的培養(yǎng)基中積累谷氨酸(而野生型卻受生物素的反饋抑制)。在富含生物素的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵時(shí):先在30℃(允許條件)中進(jìn)行培養(yǎng)以得到大量菌細(xì)胞,適當(dāng)時(shí)間后提高溫度(40℃,非允許條件),即能獲得谷氨酸的過量生產(chǎn)。由谷氨酸產(chǎn)生菌乳糖發(fā)酵短桿菌2256,經(jīng)誘變處理得到溫度敏感39②抗藥性突變株的篩選抗藥性突變株的應(yīng)用:作為菌株的遺傳標(biāo)記作為生產(chǎn)菌種(結(jié)構(gòu)類似物抗性變異株)②抗藥性突變株的篩選抗藥性突變株的應(yīng)用:40第八章微生物遺傳課件41

③營養(yǎng)缺陷型的篩選抗生素濃縮原理:青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生長著的微生物細(xì)胞,對(duì)休止態(tài)細(xì)胞無作用。方法:將菌培養(yǎng)在含抗生素的基本培養(yǎng)基中。③營養(yǎng)缺陷型的篩選抗生素濃縮42適用于:絲狀(放線菌、霉菌)原理:野生型在基本培養(yǎng)基上發(fā)育成菌絲;缺陷型孢子可通過濾膜,野生型菌絲不能通過。菌絲過濾法濃縮適用于:絲狀(放線菌、霉菌)菌絲過濾法濃縮43①逐個(gè)檢出法營養(yǎng)缺陷型的檢出①逐個(gè)檢出法營養(yǎng)缺陷型的檢出44

②影印平板培養(yǎng)法②影印平板培養(yǎng)法45生長譜法方法簡便;回變和污染不影響結(jié)果測定物質(zhì)可為粉末或紙片缺陷型的鑒定生長譜法缺陷型的鑒定46作為菌株的遺傳標(biāo)記:進(jìn)行基因工程、誘變育種;研究代謝過程時(shí)用作親本標(biāo)記;作為生產(chǎn)菌種:aa、核苷酸等生產(chǎn)菌種;作為aa、維生素、堿基的測定菌株。缺陷型的應(yīng)用作為菌株的遺傳標(biāo)記:進(jìn)行基因工程、誘變育種;缺陷型的應(yīng)用47總結(jié)1.基本概念:質(zhì)粒,轉(zhuǎn)座因子,營養(yǎng)缺陷型,接合,轉(zhuǎn)導(dǎo),轉(zhuǎn)化,誘變育種2.基本理論:(1)遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)(2)Ames實(shí)驗(yàn)3.基本技能:突變株的篩選總結(jié)1.基本概念:質(zhì)粒,轉(zhuǎn)座因子,營養(yǎng)缺陷型,接合,轉(zhuǎn)導(dǎo),轉(zhuǎn)48第八章微生物遺傳第一節(jié)遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)第二節(jié)質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子第三節(jié)誘發(fā)突變——Ams實(shí)驗(yàn)第四節(jié)微生物育種第八章微生物遺傳第一節(jié)遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)49一.DNA作為遺傳物質(zhì)1.Griffith的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(1928年)一.DNA作為遺傳物質(zhì)1.Griffith的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)502.2.513.3.52二.RNA作為遺傳物質(zhì)二.RNA作為遺傳物質(zhì)53一.質(zhì)粒

一種獨(dú)立于染色體外,能進(jìn)行自主復(fù)制的細(xì)胞質(zhì)遺傳因子,主要存在于各種微生物細(xì)胞中。質(zhì)粒分子的大小范圍從1kb左右到1000kb(細(xì)菌質(zhì)粒多在10kb以內(nèi))。一.質(zhì)粒一種獨(dú)立于染色體外,能進(jìn)行自主復(fù)制的細(xì)541.質(zhì)粒的分子結(jié)構(gòu)通常以共價(jià)閉合環(huán)狀(covalentlyclosedcircle,簡稱CCC)的超螺旋雙鏈DNA分子存在于細(xì)胞中,也發(fā)現(xiàn)有線型雙鏈DNA質(zhì)粒和RNA質(zhì)粒。1.質(zhì)粒的分子結(jié)構(gòu)通常以共價(jià)閉合環(huán)狀(cov552.質(zhì)粒的分離堿提取法:①菌體的培養(yǎng)和收集:一般采用豐富培養(yǎng)基對(duì)菌體進(jìn)行培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞生長到指數(shù)期后期時(shí),離心收集細(xì)胞。②溶菌:一般用溶菌酶去壁以形成原生質(zhì)體或原生質(zhì)球。③堿變性處理:在SDS等表面活性劑存在下加NaOH液使pH升至12.4,可使菌體蛋白質(zhì)、染色體DNA以及質(zhì)粒DNA變性。④質(zhì)粒復(fù)性:加入pH4.8的KAc-HAc緩沖液,將提取液調(diào)至中性,由于質(zhì)粒分子量小而容易復(fù)性,并穩(wěn)定存在于溶液中;染色體DNA分子量太大,在復(fù)性過程中形成DNA之間的交聯(lián)導(dǎo)致其形成更大分子的不溶性物質(zhì)。⑤離心分離:經(jīng)高速離心可以使細(xì)胞碎片和已變性的菌體蛋白及染色體DNA一起沉淀2.質(zhì)粒的分離堿提取法:56第八章微生物遺傳課件573.質(zhì)粒的特性(1)位于核基因組外,以cccDNA方式存在;(2)有的質(zhì)??烧系胶巳旧w上;(3)可重組(質(zhì)粒與質(zhì)粒間,質(zhì)粒與染色體間);(4)人為消除(高溫、丫叮類,UV,電離輻射,利福平等);(5)有的質(zhì)??稍诩?xì)胞間轉(zhuǎn)移(F因子,R因子)(6)質(zhì)粒具有不親和性3.質(zhì)粒的特性(1)位于核基因組外,以cccDNA方式存在;58質(zhì)粒的不親和性(plasmidincompatibility),

有時(shí)也稱為不相容性,是指在沒有選擇壓力的情況下,兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒,不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。在細(xì)胞的增殖過程中,其中必有一種會(huì)被逐漸地排斥(稀釋)掉。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不親和質(zhì)粒。質(zhì)粒的不親和性(plasmidincompatibilit594.質(zhì)粒的主要類型根據(jù)質(zhì)粒所編碼的功能和賦予宿主的表型效應(yīng)分類:致育因子(Fertilityfactor,F(xiàn)因子)抗性質(zhì)粒(Resistancefactor,R因子)產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒(Bacteriocinproductionplasmid)毒性質(zhì)粒(virulenceplasmid)代謝質(zhì)粒(Metabolicplasmid)隱秘質(zhì)粒(crypticplasmid)4.質(zhì)粒的主要類型根據(jù)質(zhì)粒所致育因子(Fertilityf60(1)致育因子(Fertilityfactor,F(xiàn)因子)又稱F質(zhì)粒,其大小約100kb,這是最早發(fā)現(xiàn)的一種與大腸桿菌的有性生殖現(xiàn)象(接合作用)有關(guān)的質(zhì)粒。攜帶F質(zhì)粒的菌株稱為F+菌株(相當(dāng)于雄性),無F質(zhì)粒的菌株稱為F-菌株(相當(dāng)于雌性)。F因子能以游離狀態(tài)(F+)和以與染色體相結(jié)合的狀態(tài)(Hfr)存在于細(xì)胞中,所以又稱之為附加體(episome)。在志賀氏菌屬(Shigella)、沙門氏菌屬(Salmonella)和鏈球菌屬(Streptococcus)等其他細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)了與大腸桿菌類似的致育因子。在放線菌中,天藍(lán)色鏈霉菌含有SCP1和SCP2兩種致育質(zhì)粒,這兩種質(zhì)粒在天藍(lán)色鏈霉菌的接合過程中起重要作用,帶動(dòng)染色體從供體細(xì)胞向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移。(1)致育因子(Fertilityfactor,F(xiàn)因子)61(2)抗性因子(Resistancefactor,R因子)包括抗藥性和抗重金屬二大類,簡稱R質(zhì)粒。R100質(zhì)粒(89kb)可使宿主對(duì)下列藥物及重金屬具有抗性:汞(mercuricion,mer)四環(huán)素(tetracycline,tet)鏈霉素(Streptomycin,str)、磺胺(Sulfonamide,sul)、氯霉素(Chlorampenicol,cml)夫西地酸(fusidicacid,fus)負(fù)責(zé)這些抗性的基因是成簇地存在于抗性質(zhì)粒上??剐再|(zhì)粒在細(xì)菌間的傳遞是細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一。有的質(zhì)粒可攜帶多達(dá)10種抗生素的基因??剐再|(zhì)??梢栽陉P(guān)系相近或關(guān)系疏遠(yuǎn)的菌種間轉(zhuǎn)移。(2)抗性因子(Resistancefactor,R因子)62(3)Col質(zhì)粒:產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒(Bacteriocinproductionplasmid)細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因、涉及細(xì)菌素運(yùn)輸及發(fā)揮作用(processing)的蛋白質(zhì)的基因、賦予宿主對(duì)該細(xì)菌素具有“免疫力”的相關(guān)產(chǎn)物的基因一般都位于質(zhì)?;蜣D(zhuǎn)座子上,因此,細(xì)菌素可以殺死同種但不攜帶該質(zhì)粒的菌株。細(xì)菌素:許多細(xì)菌都能產(chǎn)生某些代謝產(chǎn)物,抑制或殺死其他近緣細(xì)菌或同種不同菌株,因?yàn)檫@些代謝產(chǎn)物是由質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì),不象抗生素那樣具有很廣的殺菌譜,所以稱為細(xì)菌素(bacteriiocin)(3)Col質(zhì)粒:產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒(Bacteriocin63細(xì)菌素種類很多,一般根據(jù)產(chǎn)生菌的種類進(jìn)行命名:大腸桿菌(E.coli)產(chǎn)生的細(xì)菌素為colicins(大腸桿菌素),而質(zhì)粒被稱為Col質(zhì)粒。此外還有枯草桿菌素、乳酸菌素、根瘤菌素等。由G+細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)菌素或與細(xì)菌素類似的因子與colicins有所不同,但通常也是由質(zhì)?;蚓幋a,有些甚至有商業(yè)價(jià)值,例如一種乳酸細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)菌素NisinA能強(qiáng)烈抑制某些G+細(xì)菌的生長,而被用于食品工業(yè)的保藏。大腸桿菌素產(chǎn)自大腸桿菌的一種蛋白質(zhì),具有專一性地殺死其親緣關(guān)系很近的、不具Col質(zhì)粒的其它腸道細(xì)菌的功能。細(xì)菌素種類很多,一般根據(jù)產(chǎn)生菌的種類進(jìn)行命名:64(4)毒性質(zhì)粒(virulenceplasmid)許多致病菌的致病性是由其所攜帶的質(zhì)粒引起的,這些質(zhì)粒具有編碼毒素的基因,其產(chǎn)物對(duì)宿主(動(dòng)物、植物)造成傷害。產(chǎn)毒素大腸桿菌是引起人類和動(dòng)物腹瀉的主要病原菌之一,其中許多菌株含有為一種或多種腸毒素編碼的質(zhì)粒。蘇云金桿菌含有編碼δ內(nèi)毒素(伴孢晶體中)的質(zhì)粒根癌土壤桿菌所含Ti質(zhì)粒是引起雙子葉植物冠癭瘤的致病因子(4)毒性質(zhì)粒(virulenceplasmid)65(5)

代謝質(zhì)粒(Metabolicplasmid)

質(zhì)粒上攜帶有有利于微生物生存的基因,如能降解某些基質(zhì)的酶,進(jìn)行共生固氮,或產(chǎn)生抗生素(某些放線菌)等。降解質(zhì)粒:能將復(fù)雜的有機(jī)化合物降解成能被其作為碳源和能源利用的簡單形式,環(huán)境保護(hù)方面具有重要的意義。如TOL質(zhì)粒:含分解甲苯的基因;CAM-OCT質(zhì)粒:含分解樟腦辛烷的基因假單胞菌:具有降解一些有毒化合物,如芳香簇化合物(苯)、農(nóng)藥(二氯苯氧基乙酸)、辛烷和樟腦等的能力。(5)代謝質(zhì)粒(Metabolicplasmid)66根據(jù)拷貝數(shù)或復(fù)制特點(diǎn),質(zhì)??煞譃椋焊呖截悢?shù)(highcopynumber)質(zhì)粒(每個(gè)細(xì)胞中可以有10~100個(gè)拷貝,其復(fù)制和染色體的復(fù)制不同步)如ColE1、ColE2等

———————松弛型質(zhì)粒(relaxedplasmid)低拷貝數(shù)(lowcopynumber)質(zhì)粒(每個(gè)細(xì)胞中只有1~2個(gè)拷貝,其復(fù)制行為與染色體的復(fù)制同步)如F因子,R100

———————嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒(stringentplasmid)窄宿主范圍質(zhì)粒(narrowhostrangeplasmid)(只能在一種特定的宿主細(xì)胞中復(fù)制)廣宿主范圍質(zhì)粒(broadhostrangeplasmid)(可以在許多種細(xì)菌中復(fù)制)根據(jù)拷貝數(shù)或復(fù)制特點(diǎn),質(zhì)粒可分為:高拷貝數(shù)(highcop67二.轉(zhuǎn)座因子細(xì)胞中能改變自身位置的一段DNA稱為轉(zhuǎn)座因子。原核生物的轉(zhuǎn)座因子包括插入序列、轉(zhuǎn)座子和某些特殊病毒。二.轉(zhuǎn)座因子細(xì)胞中能改變自身位置的一段DNA稱68(一)轉(zhuǎn)座因子的種類

1.插入序列(insertionsequence)IRTransposaseGeneIR①二個(gè)分離的反向末端重復(fù)序列

(invertedterminalrepeats,ITR)②一個(gè)轉(zhuǎn)座酶(transposase)編碼基因(一)轉(zhuǎn)座因子的種類

1.插入序列(insertions692.轉(zhuǎn)座子①復(fù)合轉(zhuǎn)座子——Ⅰ類轉(zhuǎn)座子由IS類轉(zhuǎn)座組件構(gòu)成的復(fù)合體。組成:兩端為IS,中間編碼抗生素物質(zhì)②復(fù)雜轉(zhuǎn)座子——Ⅱ類轉(zhuǎn)座子(TnA家族)

攜帶轉(zhuǎn)座和耐藥等基因的獨(dú)立體家族。組成:兩端為ITR,而不是IS,中間編碼區(qū)含轉(zhuǎn)座酶編碼基因,及抗生素抗性和解離酶等編碼基因。IRIRTransposaseGene有用基因2.轉(zhuǎn)座子①復(fù)合轉(zhuǎn)座子——Ⅰ類轉(zhuǎn)座子IRIRTranspo70(二)轉(zhuǎn)座因子的遺傳學(xué)效應(yīng)1.插入突變插到某一基因中,導(dǎo)致該基因突變插到操縱子前半段,引起極性突變插入抗性基因引起抗性突變2.染色體畸變3.基因的移動(dòng)和重排(二)轉(zhuǎn)座因子的遺傳學(xué)效應(yīng)1.插入突變71一.誘發(fā)突變

自發(fā)突變的頻率是很低的,一般為10-6-10-10。許多化學(xué)、物理和生物因子能夠提高其突變頻率,將這些能使突變頻率提高到自發(fā)突變水平以上的物理、化學(xué)和生物因子稱為誘變劑。一.誘發(fā)突變自發(fā)突變的頻率是很低的72

已知的化學(xué)致變劑和物理致變劑

物理致變劑

致變劑

電離輻射、紫外輻射等

化學(xué)致變劑脫氨劑、烷化劑、

大型加合物供體、堿基類似物、 插入劑、交聯(lián)劑。第八章微生物遺傳課件73誘變劑導(dǎo)致表型改變——營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)缺陷型:野生型菌株經(jīng)誘變處理后,由于發(fā)生了喪失某酶合成能力的突變,因而只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基上生長,這類突變菌株就是營養(yǎng)缺陷型?;九囵B(yǎng)基:僅能滿足野生型菌株生長需要的最低成分組合的培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基:可滿足營養(yǎng)缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)需要的培養(yǎng)基。誘變劑導(dǎo)致表型改變——營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)缺陷型:野生型菌株經(jīng)誘變74二.誘變劑與致癌物——Ames試驗(yàn)二.誘變劑與致癌物——Ames試驗(yàn)75埃姆斯實(shí)驗(yàn)1.鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型2.基本培養(yǎng)基3.鼠肝勻漿4.可疑“三致”樣品埃姆斯實(shí)驗(yàn)1.鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型76實(shí)驗(yàn)步驟1.用基本培養(yǎng)基到平板2.將鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型培養(yǎng)液涂在平板上3.將“三致”樣品和鼠肝勻漿混合吸附在濾紙片上,放在平板中央。4.培養(yǎng)2天后看結(jié)果。實(shí)驗(yàn)步驟1.用基本培養(yǎng)基到平板77陽性結(jié)果陰性結(jié)果陽性結(jié)果陰性結(jié)果78誘變育種:是用物理或化學(xué)的誘變劑使誘變對(duì)象內(nèi)的遺傳物質(zhì)(DNA)的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。

誘變育種的實(shí)踐意義:當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門所使用的高產(chǎn)菌株,幾乎毫無例外地都是通過誘變育種而明顯提高其生產(chǎn)性能的。

誘變育種:是用物理或化學(xué)的誘變劑使誘變對(duì)象內(nèi)的遺傳物質(zhì)(DN791.選擇選擇合適的出發(fā)菌株2.制備待處理的菌懸液3.誘變處理4.篩選5.保藏和擴(kuò)大試驗(yàn)誘變育種的基本過程1.選擇選擇合適的出發(fā)菌株誘變育種的基本過程80出發(fā)菌株———用來育種處理的起始菌株

出發(fā)菌株應(yīng)具備:

①對(duì)誘變劑的敏感性高;

②具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力;

出發(fā)菌株的來源;

①自然界直接分離到的野生型菌株:

②歷經(jīng)生產(chǎn)考驗(yàn)的菌株:

③已經(jīng)歷多次育種處理的菌株。1.出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株———用來育種處理的起始菌株

出發(fā)菌株應(yīng)具備:

81要求:

①菌體處于對(duì)數(shù)生長期

②細(xì)胞分散且為單細(xì)胞

方法:

①玻璃珠打散10-15min;

②加0.3%吐溫80(表面活性劑)

③用無菌脫脂棉過濾。

制備:

物理誘變劑——生理鹽水(0.85%NaCl)

化學(xué)誘變劑——緩沖液

濃度:

細(xì)菌、放線菌108個(gè)/ml,霉菌、酵母菌106個(gè)/ml2.制備細(xì)胞懸液要求:

①菌體處于對(duì)數(shù)生長期

②細(xì)胞分散且為單細(xì)胞

方法:

82選擇合適的誘變劑量:

不同種類和不同生長階段的微生物對(duì)誘變劑的敏感程度不同,所以在誘變處理前,一般應(yīng)預(yù)先作誘變劑用量對(duì)菌體死亡數(shù)量的致死曲線,選擇合適的處理劑量?!滤缆适亲詈玫恼T變劑相對(duì)劑量的表示方法。最適劑量的選擇:

產(chǎn)量性狀的育種中多傾向

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