除了加入4種正常的脫氧核苷三磷酸dNTP外課件

核酸的序列測(cè)定第五章易發(fā)平基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室核酸的序列測(cè)定第五章易發(fā)平基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研1

DNA的測(cè)序是分子生物學(xué)研究中非常重要和關(guān)鍵的內(nèi)容。對(duì)DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究，有助于探索基因結(jié)構(gòu)與功能、基因與疾病關(guān)系，進(jìn)而推動(dòng)生命科學(xué)研究獲得質(zhì)的飛躍。測(cè)定基因組的全部核苷酸序列、閱讀和分析全部遺傳信息，正是人類基因組計(jì)劃（humangenomeproject,HGP)的最主要目標(biāo)之一。DNA的測(cè)序是分子生物學(xué)研究中非常重要和關(guān)鍵的內(nèi)容。2將DNA片段用熒光等分析儀，測(cè)出DNA序列堿基排列順序。DNA序列測(cè)定方法：1.Sanger的雙脫氧法：A/T/G/C四個(gè)反應(yīng)。2.化學(xué)降解法：G反應(yīng)；G+T反應(yīng)；T+C反應(yīng)和C反應(yīng)。3.自動(dòng)測(cè)序法。將DNA片段用熒光等分析儀，測(cè)出DNA序列堿基排列順序3DNA測(cè)序的主要方法有兩種，即雙脫氧鏈終止法（Sanger法、酶促法）和化學(xué)裂解法（Maxam-Gelbert法）。二者均依賴于高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。不管是酶促法還是化學(xué)法，都是分為4個(gè)反應(yīng)體系進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，寡核苷酸鏈分別終止于不同位置的A、T、G或C堿基。4種反應(yīng)體系的寡核苷酸鏈產(chǎn)物，進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影后，讀出待測(cè)DNA的連續(xù)序列。DNA測(cè)序的主要方法有兩種，即雙脫氧鏈終止法（Sanger4除了加入4種正常的脫氧核苷三磷酸dNTP外課件5一、Sanger雙脫氧鏈終止法（一）原理(單鏈)DNA鏈中的核苷酸是以3`，5`-磷酸二酯鍵相連接，合成DNA所用的底物是2`-脫氧核苷三磷酸（dNTP），在Sanger雙脫氧鏈終止法中被摻入了2`，3`-雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP),當(dāng)ddNTP位于鏈延伸末端時(shí),由于它沒有3`-OH，一、Sanger雙脫氧鏈終止法（一）原理(單鏈)6不能再與其它的脫氧核苷酸形成3′,5′-磷酸二酯鍵，DNA合成便在此處終止，如果此處摻入的是一個(gè)ddATP，則新生鏈的末端就是A，依次類推可以通過摻入ddTTP、ddCTP、ddGTP，則新生鏈的末端為T、C或G，根據(jù)這個(gè)原理，Sanger與1977年建立了雙脫氧鏈終止測(cè)序法。他本人也因此而獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。不能再與其它的脫氧核苷酸形成3′,5′-磷酸二酯鍵，DNA合7SangerSanger8雙脫氧核苷三磷酸互補(bǔ)鏈合成過程雙脫氧核苷三磷酸互補(bǔ)鏈合成過程9以單鏈或雙鏈DNA為模板，采用DNA引物引導(dǎo)新生DNA的合成，因此又稱為引物合成法，或酶促引物合成法。主要是基于DNA聚合酶的催化特性：①以DNA為模板，根據(jù)堿基配對(duì)的原則逐個(gè)將dNTP加到與模板結(jié)合的寡核苷酸引物的3′-OH末端，形成正確的模板DNA互補(bǔ)鏈；②能以dNTP作為底物，也能利用ddNTP作底物，將其摻入寡核苷酸鏈的3′末端而終止新生互補(bǔ)鏈的延伸。以單鏈或雙鏈DNA為模板，采用DNA引物引導(dǎo)新生10如果在DNA的合成反應(yīng)中，除了加入4種正常的脫氧核苷三磷酸（dNTP）外，再加入一種少量的2ˊ,3ˊddNTP，那么多核苷酸鏈的延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止展開競(jìng)爭(zhēng)，所以反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的長(zhǎng)短不一的核苷酸鏈。在4組獨(dú)立的DNA合成反應(yīng)中，分別加入4種不同的ddNTP，結(jié)果將生成4組核苷酸鏈，它們將分別（隨機(jī)）終止于每一個(gè)A，每一個(gè)G，每一個(gè)C，每一個(gè)T的位置上。對(duì)這4組核苷酸鏈進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，就可讀出序列。如果在DNA的合成反應(yīng)中，除了加入4種正常的11在測(cè)序反應(yīng)中通常設(shè)置4個(gè)反應(yīng)，各反應(yīng)管中同時(shí)加入一種DNA模板和引物、DNA聚合酶I（失去5′3′外切核酸酶活性）、其中一管中分別加入一種ddNTP

（如ddTTP、dTTP）以及其它三種dNTP（dATP、dCTP、dGTP），引物末端用放射性核素標(biāo)記，ddTTP的比例很?。?:10），因此摻入的位點(diǎn)是隨機(jī)的，經(jīng)過適當(dāng)?shù)臈l件下溫育，將會(huì)有不同長(zhǎng)度的DNA片段合成。它們都具有相同的5′末端，3′末端都因摻入了ddTTP而以T結(jié)尾。在其它三管中同理加入相應(yīng)的ddNTP。在測(cè)序反應(yīng)中通常設(shè)置4個(gè)反應(yīng)，各反應(yīng)管中同時(shí)加入一種DNA模12Sanger雙脫氧測(cè)序方法示意圖Sanger雙脫氧測(cè)序方法示意圖13雙脫氧法測(cè)序原理示意圖雙脫氧法測(cè)序原理示意圖14（二）DNA序列測(cè)定的策略1、測(cè)序載體和引物雙脫氧鏈終止法測(cè)定DNA序列時(shí)，通常是將待測(cè)片段先克隆到M13載體（如M13mp18和M13mp19）或質(zhì)粒載體（如pUC18和pUC19）?？寺∮贛13載體，可獲得單鏈模板?？寺∮趐UC載體，則是直接采用雙鏈DNA作為測(cè)序模板，待測(cè)DNA克隆到質(zhì)粒載體后，通過堿變性處理重組載體，使測(cè)序引物便于結(jié)合模板DNA。（二）DNA序列測(cè)定的策略雙脫氧鏈終止法測(cè)定DNA序列時(shí)，通15任何待測(cè)DNA序列的片段克隆于上述載體后，都可按克隆位點(diǎn)兩側(cè)的載體序列設(shè)計(jì)和合成寡核苷酸片段作為“通用引物”，該類引物可以與載體DNA序列互補(bǔ)結(jié)合，并以待測(cè)DNA為模板引導(dǎo)合成新生鏈，用雙脫氧終止法進(jìn)行序列測(cè)定。任何待測(cè)DNA序列的片段克隆于上述載體后，都可按克隆位點(diǎn)兩側(cè)16載體DNA片段酶切，連接設(shè)計(jì)通用引物載體DNA片段酶切，連接設(shè)計(jì)通用引物17（1）鳥槍法將長(zhǎng)鏈DNA片段隨機(jī)斷裂成適于序列測(cè)定的片段（300-600bp），斷裂方法有超聲波處理、核酸酶I法和限制酶切割法。（2）嵌套缺失法（nesteddeletion,Erase-a-base）①首先將大片段克隆到測(cè)序載體；②選用兩種限制酶從待測(cè)DNA片段與載體序列之間將DNA切斷,使切割后近載體端為3`突出的粘性末端，近待測(cè)DNA的末端為5`突出的粘性末端或平端；2、大片段DNA序列測(cè)定的策略（1）鳥槍法將長(zhǎng)鏈DNA片段隨機(jī)斷裂成適于序列測(cè)定的片18③用外切核酸酶III消化上述線性DNA（37C，250核苷酸/min），在不同時(shí)間終止反應(yīng)，可以獲得在同一端缺失并依次相差200-250bp的DNA片段。④用核酸酶S1消化末端的單鏈，使之成平端，經(jīng)T4DNA連接酶連接環(huán)化，得到一套缺失長(zhǎng)度不同的DNA片段克??；⑤將各個(gè)克隆從其缺失端開始用通用引物測(cè)序。由于引物相同，測(cè)序結(jié)果可以從子片段序列的相互重疊部分準(zhǔn)確無誤地將相鄰片段的序列拼接起來。③用外切核酸酶III消化上述線性DNA（37C，250核苷19引物EB目的片段BEBamHI引物E目的片段BEBamHI20

5`3`ExoIIIS1T4ligase

21tttgggcccaaa

atcggggctg……ggcatagttttgggcccaaa

ggcatagt……….cgatcagtttgggcccaaa

cgatacgcg…..tcagtcgtagtttgggcccaaa

tcgtagcgtagcta…..gggaa引物拼接方向測(cè)序每次測(cè)序的長(zhǎng)度是有限的tttgggcccaaaatcggggctg……ggcat22原理解析：A.該法巧妙地利用exoIII的酶學(xué)特征，它有3`5`外切酶活性，它只能從dsDNA的平端或5‘突出末端起始消化，而不能切ssDNA的3`末端（即突出末端）。B.水解速度較均勻，在37C，每分鐘可降解250個(gè)核苷酸，因此，在一定的時(shí)間間隔內(nèi)取樣終止反應(yīng)，可以得到依次相差200-250個(gè)堿基對(duì)的DNA片段。原理解析：23C.exoIII能從DNA的切口處進(jìn)行3`5`外切，因此，樣品不能有切口存在，操作時(shí)用含有50mmol/LpH4.0NaOAC（醋酸鈉）的酚代替普通的pH7.0的酚去除有切口的DNA分子。D.exoIII能被微量的NaCl強(qiáng)烈抑制，因此，樣品DNA必須用酚/氯仿抽提和酒精沉淀。C.exoIII能從DNA的切口處進(jìn)行3`5`外切，因此24（3）引物延伸法

從DNA的3′端依賴特定引物延伸測(cè)定一段DNA序列，再根據(jù)測(cè)得序列設(shè)計(jì)新的引物，如此逐步推進(jìn)。（3）引物延伸法25

一輪隨機(jī)引物作為二輪的引物測(cè)出的序列二輪三輪一輪隨機(jī)引物作為二輪的引物測(cè)出的序列二輪三輪26幾乎與雙脫氧鏈終止法建立的同時(shí)，Maxam和Gilbert于1977年建立了一種以化學(xué)修飾為基礎(chǔ)的DNA序列分析法，稱為Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法。二、Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法（一）Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法原理幾乎與雙脫氧鏈終止法建立的同時(shí)，Maxam和Gi27基本原理：用化學(xué)試劑處理具末端放射性標(biāo)記的DNA片段，造成堿基的特異性切割，由此產(chǎn)生一組具有各種不同長(zhǎng)度的DNA鏈的反應(yīng)混和物，經(jīng)凝膠電泳按大小分離和放射自顯影，便可根據(jù)X線片底板上顯示相應(yīng)帶譜，直接讀出待測(cè)DNA片段的核苷酸順序?；驹恚河没瘜W(xué)試劑處理具末端放射性標(biāo)記的DNA片段，造成堿28化學(xué)修飾法的待測(cè)DNA片段有的是雙鏈，有的是單鏈DNA。在進(jìn)行堿基特異性化學(xué)切割反應(yīng)前，首先對(duì)待測(cè)DNA片段作末端標(biāo)記，使其末端(5′端或者是3′端)帶上放射標(biāo)記。如果待測(cè)DNA是雙鏈，必須使其形成末端標(biāo)記的單鏈?；瘜W(xué)修飾法的待測(cè)DNA片段有的是雙鏈，有的是單鏈DNA。在29對(duì)末端標(biāo)記的DNA鏈進(jìn)行化學(xué)斷裂反應(yīng)分兩步進(jìn)行：第一步是在4個(gè)反應(yīng)管中分別以肼、硫酸二甲酯(DMS)和甲酸對(duì)特定的堿基進(jìn)行化學(xué)修飾；第二步是以六氫吡啶取代被修飾的堿基并將DNA鏈斷裂。對(duì)末端標(biāo)記的DNA鏈進(jìn)行化學(xué)斷裂反應(yīng)分兩步進(jìn)行：30DNA化學(xué)裂解反應(yīng)體系反應(yīng)體系堿基修飾試劑堿基修飾反應(yīng)主鏈斷裂試劑斷裂點(diǎn)G硫酸二甲酯鳥嘌呤甲基化六氫吡啶

GG+A甲酸脫嘌呤作用六氫吡啶

G和AC+T肼嘧啶開環(huán)六氫吡啶

C和TC肼（加鹽）胞嘧啶開環(huán)六氫吡啶

C

DMS（硫酸二甲酯）在中性pH環(huán)境中，主要作用于G，被六氫吡啶作用而造成該位點(diǎn)上DNA鏈的斷裂。

甲酸具有脫嘌呤作用。DNA鏈在脫嘌呤位點(diǎn)(G和A)發(fā)生斷裂。

肼，在堿性條件下，作用于胸腺嘧啶和胞嘧啶，在具有六氫吡啶的條件下，導(dǎo)致在這個(gè)核苷酸位置上發(fā)生DNA鏈的斷裂。如果在反應(yīng)體系中加入高濃度的鹽，同胸腺嘧啶的反應(yīng)速率便會(huì)下降，主要作用于胞嘧啶。DNA化學(xué)裂解反應(yīng)體系DMS（硫酸二甲酯）在中性pH環(huán)境中31在化學(xué)修飾反應(yīng)過程中，通過控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，只有一小部分堿基被修飾(而不是全部被修飾)，隨后進(jìn)行的斷裂反應(yīng)也是定量反應(yīng)。因此，DNA鏈并不是在所有可被修飾的堿基位點(diǎn)斷裂，而是隨機(jī)斷裂。在4個(gè)反應(yīng)中，產(chǎn)生4套帶相同標(biāo)記末端、長(zhǎng)短不一的寡聚核苷酸片段。只有帶標(biāo)記末端的片段可被識(shí)別，沒有標(biāo)記末端的片段可以忽略不計(jì)。在化學(xué)修飾反應(yīng)過程中，通過控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，只有一小部32以上4種反應(yīng)體系DNA片段混合物經(jīng)高分辨凝膠電泳與放射自顯影，便可直接讀得測(cè)定DNA片段的堿基排列順序。各DNA子片段測(cè)序工作完成后，按酶切圖譜，可順序相連完成完整的長(zhǎng)鏈DNA序列。以上4種反應(yīng)體系DNA片段混合物經(jīng)高分辨凝膠電泳與放335′—GATCACTACTG—3′標(biāo)記5′—*GATCACTACTG—3′G：DMSC：肼（加鹽）G+A：甲酸C+T：肼5′-*GATCACTACTG5′-*GG5′-*GATCACTACTG5′-*GATCACTA5′-*GATCA5′-*GA5′-*G5′-*GATCACTAC5′-*GATCACT5′-*GATCAC5′-*GATC5′-*GAT5′-*GATCACTACT-*GATCACTACTG-5′-*GATCACTAC5′-*GATCAC5′-*GATC-*GATCACTACTG-5′—GATCACTACTG—3′標(biāo)記5′—*GAT34電泳5′-*GATCACTACTG5′-*GATCACTACT5′-*GATCACTAC5′-*GATCACTA5′-*GATCACT5′-*GATCAC5′-*GATCA5′-*GATC5′-*GAT5′-*GA5′-*GC+TCGG+A5′電泳5′-*GATCACTACTG5′-*GATCAC35與雙脫氧鏈終止法相比，Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法具有一些獨(dú)到的特點(diǎn)。1.本法不需要體外進(jìn)行酶催化的延伸反應(yīng)，未經(jīng)克隆的待測(cè)DNA片段也可以直接進(jìn)行序列測(cè)定；2.對(duì)于含有稀有堿基如5-甲基腺嘌呤或G、C含量較高的DNA片段、短鏈的寡聚核苷酸的序列測(cè)定，化學(xué)修飾法較雙脫氧鏈終止法更具優(yōu)越性；（二）、Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法的特點(diǎn)與雙脫氧鏈終止法相比，Maxam-Gilbert化學(xué)361.操作比較繁瑣和費(fèi)時(shí)，未端核素標(biāo)記效率低造成放射自顯影需曝光較長(zhǎng)時(shí)間，2.對(duì)過長(zhǎng)DNA鏈的序列測(cè)定仍比較困難。3.采用化學(xué)修飾法測(cè)序時(shí)，既可以標(biāo)記5′末端，也可以標(biāo)記3′末端，因此可以從兩個(gè)相反方向測(cè)定同一條DNA鏈的核苷酸順序，測(cè)定結(jié)果可以互作參照，彼此核對(duì)。主要缺點(diǎn)1.操作比較繁瑣和費(fèi)時(shí)，未端核素標(biāo)記效率低造成放射自顯影需37三、DNA測(cè)序自動(dòng)化技術(shù)用4種不同的熒光基團(tuán)分別標(biāo)記4種ddNTP,這樣測(cè)序反應(yīng)就可以在一個(gè)試管中進(jìn)行，終止反應(yīng)的產(chǎn)物按終止位置堿基的不同，其3`末端帶有不同的熒光基團(tuán)，被激發(fā)后發(fā)出不同的熒光，因此可以上樣在一個(gè)加樣孔上，電泳結(jié)束后，用DNA測(cè)序儀識(shí)別，經(jīng)軟件處理，便得到待測(cè)的核苷酸序列。工作量和效率均大大提高。1、激光測(cè)序法（終止標(biāo)記系統(tǒng)）三、DNA測(cè)序自動(dòng)化技術(shù)用4種不同的熒光基團(tuán)38焦磷酸測(cè)序技術(shù)（pyrosequencing）是1987年發(fā)展起來的一種新型的酶聯(lián)級(jí)聯(lián)測(cè)序技術(shù)，其原理是：引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶（polymerase）、ATP硫酸化酶（sulfurylase）、熒光素酶（luciferase）和三磷酸腺苷雙磷酸酶（apyrase）4種酶的協(xié)同作用下，每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)的釋放級(jí)聯(lián)起來，以熒光信號(hào)的形式實(shí)時(shí)記錄模板DNA的核苷酸序列。它具有快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、實(shí)時(shí)檢測(cè)的特點(diǎn)，不需要凝膠電泳，也不需要對(duì)DNA樣品進(jìn)行任何特殊形式的標(biāo)記和染色，有很高的可重復(fù)性、高度的并行性和高度的自動(dòng)化。2、焦磷酸測(cè)序技術(shù)的原理焦磷酸測(cè)序技術(shù)（pyrosequencing）是1987年發(fā)39具體過程：第一步，將測(cè)序引物雜交到PCR擴(kuò)增的模板上，與DNA聚合酶（polymerase）、ATP硫酸化酶（sulfurylase）、熒光素酶（luciferase）和三磷酸腺苷雙磷酸酶（apyrase）加入反應(yīng)體系。第二步，加入4種dNTP到反應(yīng)體系中進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，當(dāng)DNA聚合酶將某一種dNTP與模板上相應(yīng)的核苷酸互補(bǔ)聚合時(shí)，會(huì)產(chǎn)生相同摩爾數(shù)的焦磷酸。需要說明的是在焦磷酸測(cè)序中，dATP不能被熒光素酶識(shí)別，故用-S-dATP代替常用的dATP。具體過程：40第三步，在5’-腺苷磷酸硫酸化酶協(xié)調(diào)作用下ATP硫酸化酶將焦磷酸（PPi）轉(zhuǎn)移到ATP上，該硫酸化的ATP驅(qū)動(dòng)熒光素酶將熒光素轉(zhuǎn)化成氧化熒光素,后者在熒光素酶催化下釋放出與ATP量成比例的熒光，發(fā)出的熒光信號(hào)被CCD攝像機(jī)拍攝下來，并以很尖的波峰形式在pyrogram軟件記錄下來。每一峰高（即熒光信號(hào)強(qiáng)度）都與參與DNA合成的核苷酸數(shù)成比例。第三步，在5’-腺苷磷酸硫酸化酶協(xié)調(diào)作用下ATP硫酸化酶將焦41第四步，沒有聚合的過剩的dNTP迅速被三磷酸腺苷雙磷酸酶降解,反應(yīng)體系得以再生，隨后加入另一種dNTP，重復(fù)以上反應(yīng)。模板序列就可以隨聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的進(jìn)行而被同步測(cè)定。整個(gè)測(cè)序過程沒有特殊的標(biāo)記、染色、電泳等煩瑣的操作。第四步，沒有聚合的過剩的dNTP迅速被三磷酸腺苷雙磷酸酶降解42焦磷酸測(cè)序法適于對(duì)已知的短序列的測(cè)序分析，目前的技術(shù)通常能滿足25-30個(gè)核苷酸的短序列測(cè)定，其重復(fù)性和精確性能與sangerDNA測(cè)序法相媲美，而速度卻大大的提高，最近開發(fā)的PQ96MA和PQ96HS系統(tǒng)能在1小時(shí)內(nèi)同時(shí)對(duì)96個(gè)樣品進(jìn)行SNPs分析和基因分析，工作效率大大提高，測(cè)序成本大大降低。特點(diǎn)：焦磷酸測(cè)序法適于對(duì)已知的短序列的測(cè)序分析，目前43了決定性的作用。了決定性的作用。44分析儀器的新發(fā)展：377型遺傳分析儀

377型DNA全自動(dòng)測(cè)序儀采用經(jīng)典的聚丙烯酰胺凝膠的電泳方式,結(jié)合美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司專利的四色熒光標(biāo)記,激光檢測(cè),一個(gè)泳道檢測(cè)的方法,具有測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確性好,精度高,操作簡(jiǎn)便快速等特點(diǎn),已成為全球應(yīng)用最多最廣泛的全自動(dòng)DNA測(cè)序儀之一。分析儀器的新發(fā)展：377型遺傳分析儀3745310型全自動(dòng)遺傳分析儀其他DNA全自動(dòng)分析儀：ABIPrism?3100遺傳分析儀

3700型全自動(dòng)遺傳分析儀安瑪西亞DNA序列分析系統(tǒng)型號(hào)：MegaBACE500/1000/4000

310型全自動(dòng)遺傳分析儀其他DNA全自動(dòng)分析儀：ABIPr46電泳檢測(cè)--310電泳檢測(cè)--31047電泳檢測(cè)--3100電泳檢測(cè)--310048步驟１：毛細(xì)管灌膠步驟１：毛細(xì)管灌膠49步驟２：樣品盤移動(dòng)步驟２：樣品盤移動(dòng)50步驟３：電進(jìn)樣及電泳步驟３：電進(jìn)樣及電泳51步驟４：熒光激發(fā)及檢測(cè)步驟４：熒光激發(fā)及檢測(cè)52補(bǔ)充：測(cè)序及連接方法的遴選對(duì)文庫(kù)中的各片段逐一測(cè)序，測(cè)序后的連接則是一個(gè)巨大的任務(wù)（生物信息學(xué)）。目前有兩種思路：1.第一種是全基因組散彈法（wholegenomeshut-gun)：即從文庫(kù)中隨機(jī)取，然后分析，分析后再根據(jù)堿基序列進(jìn)行拼接，由Celera提出。補(bǔ)充：測(cè)序及連接方法的遴選對(duì)文庫(kù)中的各片段逐一測(cè)序，測(cè)序53步驟：取全基因組DNA→純化酶切或超聲波打斷→電泳→回收DNA片段→構(gòu)建質(zhì)粒文庫(kù)→轉(zhuǎn)化宿主菌→擴(kuò)增培養(yǎng)→提質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR測(cè)序→上測(cè)序儀→處理測(cè)序數(shù)據(jù)→補(bǔ)缺→完整基因組序列。步驟：54⑴.shutgun法全基因組DNA隨機(jī)酶切成小片段拼接補(bǔ)缺完整基因組序列⑴.shutgun法全基因組DNA隨機(jī)酶切成小片段拼接補(bǔ)缺552.層次散彈（hierarchicalshutgun）第二種是層次散彈（hierarchicalshutgun）。即把大的基因組先進(jìn)行分層，如染色體編號(hào)、染色體下片段編號(hào)、小片段上作物理標(biāo)記，然后再對(duì)小片段測(cè)序，這樣使最后“拼接”變得容易得多。2.層次散彈（hierarchicalshutgun）第56除了加入4種正常的脫氧核苷三磷酸dNTP外課件57除了加入4種正常的脫氧核苷三磷酸dNTP外課件58核酸的序列測(cè)定第五章易發(fā)平基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室核酸的序列測(cè)定第五章易發(fā)平基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研59

DNA的測(cè)序是分子生物學(xué)研究中非常重要和關(guān)鍵的內(nèi)容。對(duì)DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究，有助于探索基因結(jié)構(gòu)與功能、基因與疾病關(guān)系，進(jìn)而推動(dòng)生命科學(xué)研究獲得質(zhì)的飛躍。測(cè)定基因組的全部核苷酸序列、閱讀和分析全部遺傳信息，正是人類基因組計(jì)劃（humangenomeproject,HGP)的最主要目標(biāo)之一。DNA的測(cè)序是分子生物學(xué)研究中非常重要和關(guān)鍵的內(nèi)容。60將DNA片段用熒光等分析儀，測(cè)出DNA序列堿基排列順序。DNA序列測(cè)定方法：1.Sanger的雙脫氧法：A/T/G/C四個(gè)反應(yīng)。2.化學(xué)降解法：G反應(yīng)；G+T反應(yīng)；T+C反應(yīng)和C反應(yīng)。3.自動(dòng)測(cè)序法。將DNA片段用熒光等分析儀，測(cè)出DNA序列堿基排列順序61DNA測(cè)序的主要方法有兩種，即雙脫氧鏈終止法（Sanger法、酶促法）和化學(xué)裂解法（Maxam-Gelbert法）。二者均依賴于高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。不管是酶促法還是化學(xué)法，都是分為4個(gè)反應(yīng)體系進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，寡核苷酸鏈分別終止于不同位置的A、T、G或C堿基。4種反應(yīng)體系的寡核苷酸鏈產(chǎn)物，進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影后，讀出待測(cè)DNA的連續(xù)序列。DNA測(cè)序的主要方法有兩種，即雙脫氧鏈終止法（Sanger62除了加入4種正常的脫氧核苷三磷酸dNTP外課件63一、Sanger雙脫氧鏈終止法（一）原理(單鏈)DNA鏈中的核苷酸是以3`，5`-磷酸二酯鍵相連接，合成DNA所用的底物是2`-脫氧核苷三磷酸（dNTP），在Sanger雙脫氧鏈終止法中被摻入了2`，3`-雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP),當(dāng)ddNTP位于鏈延伸末端時(shí),由于它沒有3`-OH，一、Sanger雙脫氧鏈終止法（一）原理(單鏈)64不能再與其它的脫氧核苷酸形成3′,5′-磷酸二酯鍵，DNA合成便在此處終止，如果此處摻入的是一個(gè)ddATP，則新生鏈的末端就是A，依次類推可以通過摻入ddTTP、ddCTP、ddGTP，則新生鏈的末端為T、C或G，根據(jù)這個(gè)原理，Sanger與1977年建立了雙脫氧鏈終止測(cè)序法。他本人也因此而獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。不能再與其它的脫氧核苷酸形成3′,5′-磷酸二酯鍵，DNA合65SangerSanger66雙脫氧核苷三磷酸互補(bǔ)鏈合成過程雙脫氧核苷三磷酸互補(bǔ)鏈合成過程67以單鏈或雙鏈DNA為模板，采用DNA引物引導(dǎo)新生DNA的合成，因此又稱為引物合成法，或酶促引物合成法。主要是基于DNA聚合酶的催化特性：①以DNA為模板，根據(jù)堿基配對(duì)的原則逐個(gè)將dNTP加到與模板結(jié)合的寡核苷酸引物的3′-OH末端，形成正確的模板DNA互補(bǔ)鏈；②能以dNTP作為底物，也能利用ddNTP作底物，將其摻入寡核苷酸鏈的3′末端而終止新生互補(bǔ)鏈的延伸。以單鏈或雙鏈DNA為模板，采用DNA引物引導(dǎo)新生68如果在DNA的合成反應(yīng)中，除了加入4種正常的脫氧核苷三磷酸（dNTP）外，再加入一種少量的2ˊ,3ˊddNTP，那么多核苷酸鏈的延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止展開競(jìng)爭(zhēng)，所以反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的長(zhǎng)短不一的核苷酸鏈。在4組獨(dú)立的DNA合成反應(yīng)中，分別加入4種不同的ddNTP，結(jié)果將生成4組核苷酸鏈，它們將分別（隨機(jī)）終止于每一個(gè)A，每一個(gè)G，每一個(gè)C，每一個(gè)T的位置上。對(duì)這4組核苷酸鏈進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，就可讀出序列。如果在DNA的合成反應(yīng)中，除了加入4種正常的69在測(cè)序反應(yīng)中通常設(shè)置4個(gè)反應(yīng)，各反應(yīng)管中同時(shí)加入一種DNA模板和引物、DNA聚合酶I（失去5′3′外切核酸酶活性）、其中一管中分別加入一種ddNTP

（如ddTTP、dTTP）以及其它三種dNTP（dATP、dCTP、dGTP），引物末端用放射性核素標(biāo)記，ddTTP的比例很?。?:10），因此摻入的位點(diǎn)是隨機(jī)的，經(jīng)過適當(dāng)?shù)臈l件下溫育，將會(huì)有不同長(zhǎng)度的DNA片段合成。它們都具有相同的5′末端，3′末端都因摻入了ddTTP而以T結(jié)尾。在其它三管中同理加入相應(yīng)的ddNTP。在測(cè)序反應(yīng)中通常設(shè)置4個(gè)反應(yīng)，各反應(yīng)管中同時(shí)加入一種DNA模70Sanger雙脫氧測(cè)序方法示意圖Sanger雙脫氧測(cè)序方法示意圖71雙脫氧法測(cè)序原理示意圖雙脫氧法測(cè)序原理示意圖72（二）DNA序列測(cè)定的策略1、測(cè)序載體和引物雙脫氧鏈終止法測(cè)定DNA序列時(shí)，通常是將待測(cè)片段先克隆到M13載體（如M13mp18和M13mp19）或質(zhì)粒載體（如pUC18和pUC19）?？寺∮贛13載體，可獲得單鏈模板?？寺∮趐UC載體，則是直接采用雙鏈DNA作為測(cè)序模板，待測(cè)DNA克隆到質(zhì)粒載體后，通過堿變性處理重組載體，使測(cè)序引物便于結(jié)合模板DNA。（二）DNA序列測(cè)定的策略雙脫氧鏈終止法測(cè)定DNA序列時(shí)，通73任何待測(cè)DNA序列的片段克隆于上述載體后，都可按克隆位點(diǎn)兩側(cè)的載體序列設(shè)計(jì)和合成寡核苷酸片段作為“通用引物”，該類引物可以與載體DNA序列互補(bǔ)結(jié)合，并以待測(cè)DNA為模板引導(dǎo)合成新生鏈，用雙脫氧終止法進(jìn)行序列測(cè)定。任何待測(cè)DNA序列的片段克隆于上述載體后，都可按克隆位點(diǎn)兩側(cè)74載體DNA片段酶切，連接設(shè)計(jì)通用引物載體DNA片段酶切，連接設(shè)計(jì)通用引物75（1）鳥槍法將長(zhǎng)鏈DNA片段隨機(jī)斷裂成適于序列測(cè)定的片段（300-600bp），斷裂方法有超聲波處理、核酸酶I法和限制酶切割法。（2）嵌套缺失法（nesteddeletion,Erase-a-base）①首先將大片段克隆到測(cè)序載體；②選用兩種限制酶從待測(cè)DNA片段與載體序列之間將DNA切斷,使切割后近載體端為3`突出的粘性末端，近待測(cè)DNA的末端為5`突出的粘性末端或平端；2、大片段DNA序列測(cè)定的策略（1）鳥槍法將長(zhǎng)鏈DNA片段隨機(jī)斷裂成適于序列測(cè)定的片76③用外切核酸酶III消化上述線性DNA（37C，250核苷酸/min），在不同時(shí)間終止反應(yīng)，可以獲得在同一端缺失并依次相差200-250bp的DNA片段。④用核酸酶S1消化末端的單鏈，使之成平端，經(jīng)T4DNA連接酶連接環(huán)化，得到一套缺失長(zhǎng)度不同的DNA片段克??；⑤將各個(gè)克隆從其缺失端開始用通用引物測(cè)序。由于引物相同，測(cè)序結(jié)果可以從子片段序列的相互重疊部分準(zhǔn)確無誤地將相鄰片段的序列拼接起來。③用外切核酸酶III消化上述線性DNA（37C，250核苷77引物EB目的片段BEBamHI引物E目的片段BEBamHI78

5`3`ExoIIIS1T4ligase

79tttgggcccaaa

atcggggctg……ggcatagttttgggcccaaa

ggcatagt……….cgatcagtttgggcccaaa

cgatacgcg…..tcagtcgtagtttgggcccaaa

tcgtagcgtagcta…..gggaa引物拼接方向測(cè)序每次測(cè)序的長(zhǎng)度是有限的tttgggcccaaaatcggggctg……ggcat80原理解析：A.該法巧妙地利用exoIII的酶學(xué)特征，它有3`5`外切酶活性，它只能從dsDNA的平端或5‘突出末端起始消化，而不能切ssDNA的3`末端（即突出末端）。B.水解速度較均勻，在37C，每分鐘可降解250個(gè)核苷酸，因此，在一定的時(shí)間間隔內(nèi)取樣終止反應(yīng)，可以得到依次相差200-250個(gè)堿基對(duì)的DNA片段。原理解析：81C.exoIII能從DNA的切口處進(jìn)行3`5`外切，因此，樣品不能有切口存在，操作時(shí)用含有50mmol/LpH4.0NaOAC（醋酸鈉）的酚代替普通的pH7.0的酚去除有切口的DNA分子。D.exoIII能被微量的NaCl強(qiáng)烈抑制，因此，樣品DNA必須用酚/氯仿抽提和酒精沉淀。C.exoIII能從DNA的切口處進(jìn)行3`5`外切，因此82（3）引物延伸法

從DNA的3′端依賴特定引物延伸測(cè)定一段DNA序列，再根據(jù)測(cè)得序列設(shè)計(jì)新的引物，如此逐步推進(jìn)。（3）引物延伸法83

一輪隨機(jī)引物作為二輪的引物測(cè)出的序列二輪三輪一輪隨機(jī)引物作為二輪的引物測(cè)出的序列二輪三輪84幾乎與雙脫氧鏈終止法建立的同時(shí)，Maxam和Gilbert于1977年建立了一種以化學(xué)修飾為基礎(chǔ)的DNA序列分析法，稱為Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法。二、Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法（一）Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法原理幾乎與雙脫氧鏈終止法建立的同時(shí)，Maxam和Gi85基本原理：用化學(xué)試劑處理具末端放射性標(biāo)記的DNA片段，造成堿基的特異性切割，由此產(chǎn)生一組具有各種不同長(zhǎng)度的DNA鏈的反應(yīng)混和物，經(jīng)凝膠電泳按大小分離和放射自顯影，便可根據(jù)X線片底板上顯示相應(yīng)帶譜，直接讀出待測(cè)DNA片段的核苷酸順序?；驹恚河没瘜W(xué)試劑處理具末端放射性標(biāo)記的DNA片段，造成堿86化學(xué)修飾法的待測(cè)DNA片段有的是雙鏈，有的是單鏈DNA。在進(jìn)行堿基特異性化學(xué)切割反應(yīng)前，首先對(duì)待測(cè)DNA片段作末端標(biāo)記，使其末端(5′端或者是3′端)帶上放射標(biāo)記。如果待測(cè)DNA是雙鏈，必須使其形成末端標(biāo)記的單鏈?；瘜W(xué)修飾法的待測(cè)DNA片段有的是雙鏈，有的是單鏈DNA。在87對(duì)末端標(biāo)記的DNA鏈進(jìn)行化學(xué)斷裂反應(yīng)分兩步進(jìn)行：第一步是在4個(gè)反應(yīng)管中分別以肼、硫酸二甲酯(DMS)和甲酸對(duì)特定的堿基進(jìn)行化學(xué)修飾；第二步是以六氫吡啶取代被修飾的堿基并將DNA鏈斷裂。對(duì)末端標(biāo)記的DNA鏈進(jìn)行化學(xué)斷裂反應(yīng)分兩步進(jìn)行：88DNA化學(xué)裂解反應(yīng)體系反應(yīng)體系堿基修飾試劑堿基修飾反應(yīng)主鏈斷裂試劑斷裂點(diǎn)G硫酸二甲酯鳥嘌呤甲基化六氫吡啶

GG+A甲酸脫嘌呤作用六氫吡啶

G和AC+T肼嘧啶開環(huán)六氫吡啶

C和TC肼（加鹽）胞嘧啶開環(huán)六氫吡啶

C

DMS（硫酸二甲酯）在中性pH環(huán)境中，主要作用于G，被六氫吡啶作用而造成該位點(diǎn)上DNA鏈的斷裂。

甲酸具有脫嘌呤作用。DNA鏈在脫嘌呤位點(diǎn)(G和A)發(fā)生斷裂。

肼，在堿性條件下，作用于胸腺嘧啶和胞嘧啶，在具有六氫吡啶的條件下，導(dǎo)致在這個(gè)核苷酸位置上發(fā)生DNA鏈的斷裂。如果在反應(yīng)體系中加入高濃度的鹽，同胸腺嘧啶的反應(yīng)速率便會(huì)下降，主要作用于胞嘧啶。DNA化學(xué)裂解反應(yīng)體系DMS（硫酸二甲酯）在中性pH環(huán)境中89在化學(xué)修飾反應(yīng)過程中，通過控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，只有一小部分堿基被修飾(而不是全部被修飾)，隨后進(jìn)行的斷裂反應(yīng)也是定量反應(yīng)。因此，DNA鏈并不是在所有可被修飾的堿基位點(diǎn)斷裂，而是隨機(jī)斷裂。在4個(gè)反應(yīng)中，產(chǎn)生4套帶相同標(biāo)記末端、長(zhǎng)短不一的寡聚核苷酸片段。只有帶標(biāo)記末端的片段可被識(shí)別，沒有標(biāo)記末端的片段可以忽略不計(jì)。在化學(xué)修飾反應(yīng)過程中，通過控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，只有一小部90以上4種反應(yīng)體系DNA片段混合物經(jīng)高分辨凝膠電泳與放射自顯影，便可直接讀得測(cè)定DNA片段的堿基排列順序。各DNA子片段測(cè)序工作完成后，按酶切圖譜，可順序相連完成完整的長(zhǎng)鏈DNA序列。以上4種反應(yīng)體系DNA片段混合物經(jīng)高分辨凝膠電泳與放915′—GATCACTACTG—3′標(biāo)記5′—*GATCACTACTG—3′G：DMSC：肼（加鹽）G+A：甲酸C+T：肼5′-*GATCACTACTG5′-*GG5′-*GATCACTACTG5′-*GATCACTA5′-*GATCA5′-*GA5′-*G5′-*GATCACTAC5′-*GATCACT5′-*GATCAC5′-*GATC5′-*GAT5′-*GATCACTACT-*GATCACTACTG-5′-*GATCACTAC5′-*GATCAC5′-*GATC-*GATCACTACTG-5′—GATCACTACTG—3′標(biāo)記5′—*GAT92電泳5′-*GATCACTACTG5′-*GATCACTACT5′-*GATCACTAC5′-*GATCACTA5′-*GATCACT5′-*GATCAC5′-*GATCA5′-*GATC5′-*GAT5′-*GA5′-*GC+TCGG+A5′電泳5′-*GATCACTACTG5′-*GATCAC93與雙脫氧鏈終止法相比，Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法具有一些獨(dú)到的特點(diǎn)。1.本法不需要體外進(jìn)行酶催化的延伸反應(yīng)，未經(jīng)克隆的待測(cè)DNA片段也可以直接進(jìn)行序列測(cè)定；2.對(duì)于含有稀有堿基如5-甲基腺嘌呤或G、C含量較高的DNA片段、短鏈的寡聚核苷酸的序列測(cè)定，化學(xué)修飾法較雙脫氧鏈終止法更具優(yōu)越性；（二）、Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法的特點(diǎn)與雙脫氧鏈終止法相比，Maxam-Gilbert化學(xué)941.操作比較繁瑣和費(fèi)時(shí)，未端核素標(biāo)記效率低造成放射自顯影需曝光較長(zhǎng)時(shí)間，2.對(duì)過長(zhǎng)DNA鏈的序列測(cè)定仍比較困難。3.采用化學(xué)修飾法測(cè)序時(shí)，既可以標(biāo)記5′末端，也可以標(biāo)記3′末端，因此可以從兩個(gè)相反方向測(cè)定同一條DNA鏈的核苷酸順序，測(cè)定結(jié)果可以互作參照，彼此核對(duì)。主要缺點(diǎn)1.操作比較繁瑣和費(fèi)時(shí)，未端核素標(biāo)記效率低造成放射自顯影需95三、DNA測(cè)序自動(dòng)化技術(shù)用4種不同的熒光基團(tuán)分別標(biāo)記4種ddNTP,這樣測(cè)序反應(yīng)就可以在一個(gè)試管中進(jìn)行，終止反應(yīng)的產(chǎn)物按終止位置堿基的不同，其3`末端帶有不同的熒光基團(tuán)，被激發(fā)后發(fā)出不同的熒光，因此可以上樣在一個(gè)加樣孔上，電泳結(jié)束后，用DNA測(cè)序儀識(shí)別，經(jīng)軟件處理，便得到待測(cè)的核苷酸序列。工作量和效率均大大提高。1、激光測(cè)序法（終止標(biāo)記系統(tǒng)）三、DNA測(cè)序自動(dòng)化技術(shù)用4種不同的熒光基團(tuán)96焦磷酸測(cè)序技術(shù)（pyrosequencing）是1987年發(fā)展起來的一種新型的酶聯(lián)級(jí)聯(lián)測(cè)序技術(shù)，其原理是：引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶（polymerase）、ATP硫酸化酶（sulfurylase）、熒光素酶（luciferase）和三磷酸腺苷雙磷酸酶（apyrase）4種酶的協(xié)同作用下，每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)的釋放級(jí)聯(lián)起來，以熒光信號(hào)的形式實(shí)時(shí)記錄模板DNA的核苷酸序列。它具有快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、實(shí)時(shí)檢測(cè)的特點(diǎn)，不需要凝膠電泳，也不需要對(duì)DNA樣品進(jìn)行任何特殊形式的標(biāo)記和染色，有很高的可重復(fù)性、高度的并行性和高度的自動(dòng)化。2、焦磷酸測(cè)序技術(shù)的原理焦磷酸測(cè)序技術(shù)（pyrosequencing）是1987年發(fā)97具體過程：第一步，將測(cè)序引物雜交到PCR擴(kuò)增的模板上，與DNA聚合酶（polymera