動物毒性試驗

關(guān)于動物毒性試驗第一頁，共五十六頁，2022年，8月28日一、實驗動物與實驗動物化世界上的動物通常被我們按照其與人類的關(guān)系分為：野生動物（WildAnimal）經(jīng)濟動物（EconomicAnimal）觀賞動物（OrnamentalAnimal）實驗動物（LaboratoryAnimal）。是指經(jīng)人工飼育，對其攜帶微生物實行控制，遺傳背景明確或來源清楚的，用于科學(xué)研究、教學(xué)、生產(chǎn)、檢定以及其它科學(xué)試驗的動物。第二頁，共五十六頁，2022年，8月28日實驗動物化：指以其它三類動物為來源，人為的使之變?yōu)閷嶒瀯游锏倪^程。實驗用動物：Animalforexeperiment是指某些未經(jīng)充分實驗動物化，而在某些實驗研究中經(jīng)常用到或不可不用的動物。實驗動物的特點：個體間的均一性；某些遺傳上的穩(wěn)定性；比較容易獲得。第三頁，共五十六頁，2022年，8月28日二、實驗動物的分類按微生物控制分：

種類飼養(yǎng)條件無菌動物（Germfreeanimal）隔離系統(tǒng)Isolationsystem悉生動物（Gnotobioticanimal）也叫已知生物體動物隔離系統(tǒng)Isolationsystem無特定病原體動物（SPF動物）（Specificpathogenfreeanimal）屏障系統(tǒng)中Barriersystem普通動物（Conventionalanimal）開放系統(tǒng)Opensystem（國際上）第四頁，共五十六頁，2022年，8月28日

我國的分類標(biāo)準(zhǔn)：——1994年國家技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布一級，普通動物（Conventionalanimal，CV）二級，清潔動物（Cleananimal，CL）三級，無特定病原體動物（Specificpathogenfreeanimal，SPF）四級，無菌動物（Germfreeanimal，GF）二級，清潔動物的飼養(yǎng)要求：

有屏障設(shè)施，空氣經(jīng)過濾凈化，正壓，進入飼養(yǎng)環(huán)境的一切物品均應(yīng)嚴(yán)格滅菌：飼料、墊料、飲水、籠器具、工作人員的衣物、實驗用品等。第五頁，共五十六頁，2022年，8月28日2按遺傳學(xué)控制分近交系（Inbredstrain）封閉群（Closecolony）突變系（Mutantstrain）系統(tǒng)雜交動物（Hybirdanima）現(xiàn)代遺傳工程產(chǎn)生的新品系第六頁，共五十六頁，2022年，8月28日1）近交系（Inbredstrain）

指近交程度相當(dāng)于全同胞兄妹連續(xù)交配20代以上，近交系數(shù)達98.6%以上，基因達到高度純合和穩(wěn)定的動物群。①常見的培育方式：全同胞兄妹交配（B×Smating）父女或母子交配（回交，backcross）堂兄妹交配（cousinmating）不同的近交方式?jīng)Q定了近交程度提高的速度近交程度的衡量是以近交系數(shù)來表示的第七頁，共五十六頁，2022年，8月28日近交系數(shù)指群體中兩個等位基因源于同祖先同一基因的概率1960年，F(xiàn)alconer經(jīng)試驗獲得計算公式：Fn=1-(1-△F)nFn——第n代的近交系數(shù)n——近交代數(shù)△F——近交系數(shù)的代遞增率同胞兄妹交配：19.1%父女或母子交配：19.1%堂兄妹交配：8%同父異母者交配：11.0%第八頁，共五十六頁，2022年，8月28日③近交系動物的特點基因位點的純合性(homozygosity)遺傳組成的同源性(isogenicity)長期遺傳的穩(wěn)定性(stability)表現(xiàn)性的均一性(uniformity)遺傳特征的可辨別性(identifiability)遺傳組成的獨特性(individuality)國際分布性(internationaldistribution)背景資料的完整性(backgrounddata)第九頁，共五十六頁，2022年，8月28日④常用的近交系動物

日前世界上至少有250個小鼠品系，111個大鼠品系，20個家兔品系和14個豚鼠品系。在實驗中應(yīng)用最多的絕大部分是小鼠和大鼠的近交系。

小鼠常用的近交品系主要有：C57BL、C3H、BALB/c、DBA/2、CBA、A、AKR、NAB、B10.D2、SJL。

大鼠常用的近交品系主要有：F344、LEW、BN、SHR、DA、PVG、WAG、AC1、WF、WKY。第十頁，共五十六頁，2022年，8月28日2）封閉群（Closecolony）也稱非近交系（noninbredstrain）、遠交群和遠交原種（outbred）。特點：具有雜合性，避免了近交衰退；較強的繁殖力和生活力，表現(xiàn)為：產(chǎn)仔多、胎間隔短、生長塊、成熟早、疾病抵抗力強，成本低，可大量供應(yīng)。個體差異較大常用品系：小鼠：昆明、NIH、ICR、LACA；大鼠：Wistar、SD；DunkinHarleg豚鼠；新西蘭兔等。培育要求：5年以上不從外部引種，即不引進任何新的基因；只在群內(nèi)進行隨機交配；群體大小應(yīng)保持在50只以上。第十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日3）突變系（Mutantstrain）正常染色體的基因發(fā)生突變而具有了各種遺傳缺陷的動物，進行定向培育而成的近交系；或用遺傳學(xué)方法將突變基因?qū)胍延傻慕幌担贿@樣具有突變基因的近交系稱突變系。如果將突變基因保持在一個封閉群當(dāng)中，稱突變原種（mutantstock）。第十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日4）系統(tǒng)雜交動物（Hybirdanima）指兩個不同近交系雜交產(chǎn)生的第一代動物，也叫F1動物。特點：具有雜交優(yōu)勢?？共×?，對環(huán)境和實驗處理的耐受性強，克服了近交衰退，適于各種長期慢性實驗；遺傳和表現(xiàn)型的一致性。具有與近交系相似的個體均一性同時具有兩個親本片系的特點。不能進一步繁殖而保持其遺傳組成不變，否則會出現(xiàn)遺傳分離和基因重組。第十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日5）現(xiàn)代遺傳工程產(chǎn)生的新型品系

①轉(zhuǎn)基因動物指以實驗方法導(dǎo)入的外源基因在其染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的動物。如果外源基因在動物染色體上整合穩(wěn)定，則能進一步繁殖而保持外源DNA的存在。②嵌合體動物指將動物早期胚胎進行分割與同種或異種的胚胎細胞聚合而發(fā)育成的個體。不能進一步繁殖，只能在需要時隨時生產(chǎn)。第十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日三、實驗動物的選擇原則根據(jù)實驗?zāi)康暮鸵?，可考慮以下幾個原則：1.近似性原則2.差異性原則3.易化原則4.相容和匹配原則5.重復(fù)性和均一性原則6.易獲性原則：還要考慮是否經(jīng)濟及是否容易飼養(yǎng)管理

還要注意動物的種類、品種或品系、質(zhì)量（遺傳、微生物及營養(yǎng)狀況）和健康狀況等。第十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日三、實驗動物的選擇原則根據(jù)實驗的具體目的和要求，可考慮以下幾個方面：1.選用與人類的機能、代謝結(jié)構(gòu)、及疾病特點相似的實驗動物。2.選用遺傳背景明確、具有已知菌群及模型性狀顯著且穩(wěn)定的動物。3.選用解剖生理特點符合實驗?zāi)康囊蟮膶嶒瀯游?.選用具有符合研究需要的某些特殊反應(yīng)的動物。5.選用人畜共患疾病的實驗動物6.選用傳統(tǒng)應(yīng)用的實驗動物。第十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日四、嚙齒類實驗動物的意義1.代謝方式與人接近，對化學(xué)物質(zhì)敏感。2.體型大小適中。3.自然壽命不長，繁殖力強。4.實驗動物化程度高。

常選用大、小白鼠。其它嚙齒類動物如豚鼠、長爪沙鼠、地鼠等，

第十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日五、動物實驗所得數(shù)據(jù)的種屬差異毒理學(xué)實驗一般要求用兩種實驗動物（其中一種為非嚙齒類）對同一毒物進行試驗，以得到的兩個LD50之比來劃分種屬差異的大小：LD50（A）／LD50（B）

易感性＜3沒有種屬差異3.1～9中等種屬差異＞9明顯種屬差異第十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日六、實驗動物的飼育環(huán)境溫度：各種實驗動物的最適溫度如下表，且要求溫差不大于3℃，動物小鼠大鼠兔貓狗靈長類溫度℃15-2018-2215-2015-2015-2020-24濕度：濕度過高微生物易于繁殖，過低（＜40％)易使灰塵飛揚，相對濕度還影響體溫調(diào)節(jié)。因此，濕度以40～70％為宜，尤以45～55％為最適相對濕度。（一）氣候因素第十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日3.光照：光照與動物性周期有密切關(guān)系，尤其鼠類要避免日光直射。因此可以采用完全的人工光照，晝夜明暗交替，12h：12h或10h：14

h

。4.音響、噪音:

可引起動物緊張，大、小鼠尤怕突然音響，要求噪音不高于65分貝，一般60分貝以下（狗除外）。（二）物理化學(xué)因素5.

粉塵包括微生物在內(nèi)。實驗動物室的粉塵可引起鼻、咽喉炎、哮喘、發(fā)熱、皮膚炎等過敏性癥狀，粉塵中的微生物也可造成動物污染。粉塵的數(shù)量與空氣過濾效果、換氣次數(shù)、空氣濕度、飼養(yǎng)方式、人員操作等有關(guān)。第二十頁，共五十六頁，2022年，8月28日6.氣流速度及空氣清潔度：動物室內(nèi)的臭氣主要有氨、甲基硫醇、硫化氫等物質(zhì)。以氨的濃度最高，故一般以氨的含量作為衡量空氣質(zhì)量的重要指標(biāo)。當(dāng)氨濃度較高時，會刺激動物的粘膜而引起流淚、咳嗽，嚴(yán)重時可引起急性肺水腫，而造成動物死亡。高濃度的氨引起動物體質(zhì)下降，從而影響動物實驗效果。要求空氣中的NH3不超過20ppm。因此要求有5-15次／小時的換氣量。氣流速度為10-25cm／s。再加上適當(dāng)?shù)娘曫B(yǎng)密度和日常清潔工作。為了抑制動物室內(nèi)的臭氣，應(yīng)減少動物飼養(yǎng)密度，2～3日左右頻繁地更換籠具、墊料，增加換氣次數(shù)。我國動物室的氨濃度標(biāo)準(zhǔn)為14mg／m3以下。（三）居住因素：籠具、墊料、飲水器等第二十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日第二十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日第二十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日第二十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日第二十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日七、動物營養(yǎng)要求飼料蛋白質(zhì)最少占13—15％，最好18-24％,但通常不超過30％，而其中1／3為營養(yǎng)價值較高的蛋白質(zhì)。飼料中脂肪占4-6％，一般不超過10％。碳水化合物在40-70％左右，粗纖維要占10-15％鈣占1.5％，磷占0.75％。此外，還要注意維生素E和B族維生素及食鹽的供應(yīng)。大鼠對Vk與Vc無特殊要求，但豚鼠應(yīng)注意Vc供應(yīng)，兔子飼料中應(yīng)保證有足夠的纖維素，狗的飼料中應(yīng)有一定的肉食，還要保證有適當(dāng)?shù)膽敉饣顒?第二十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日成分名稱成分含量%主要微量元素含量（每kg飼料中）主要維生素含量（每kg飼料中）粗蛋白≥18鐵不低于100mg銅不低于10mg

不高于250mg鋅不低于30mg錳不低于80mg維生素A不低于7000IU維生素D3不低于800IU維生素E不低于60IU維生素K3不低于3mg維生素B6不低于8mg維生素B12不低于0.02mg粗纖維≤5粗灰分≤8鈣0.8-1.8總磷0.6-1.2賴氨酸≥1.35食鹽0.5水分≤10大、小鼠生長維持顆粒飼料北京科澳協(xié)力飼料有限公司按照GB14924·3-2001標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)第二十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日大、小鼠繁殖顆粒飼料成分名稱成分含量（%）主要微量元素含量（每kg飼料中）主要維生素含量（每kg飼料中）粗蛋白≥20鐵不低于100mg銅不低于10mg

不高于250mg鋅不低于80mg錳不低于80mg維生素A不低于15000IU維生素D3不低于600IU維生素E不低于120IU維生素K3不低于10mg維生素B6不低于12mg維生素B12不低于0.01mg粗纖維≤5粗灰分≤8鈣0.8-1.8總磷0.6-1.2賴氨酸≥1.35食鹽0.5水分≤10第二十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日第二節(jié)常用試驗動物的一般處理第二十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日一、試驗前觀察

動物在試驗前，一般要觀察一周，使實驗動物適應(yīng)實驗室生活條件，同時淘汰一部分不健康與不適用的動物。慢性毒性試驗要求比較嚴(yán)格，最好觀察兩周，并反復(fù)仔細觀察。實驗動物必須健康并發(fā)育正常，體型豐滿，毛濃密且緊貼于皮膚表面，有光澤，眼明亮而有神，天然孔無分泌物，周圍清潔，食欲良好，運動敏捷自如，無異常姿態(tài)。第三十頁，共五十六頁，2022年，8月28日

生理常數(shù)項目

大鼠小鼠豚鼠家兔貓狗妊娠天數(shù)（日）21～2318～2165～7228～3260～6858～63斷奶天數(shù)（日）25～3020～3021～3545～556060斷奶時體重（g）50±10～14200±700±性成熟時期（月）2.5～32±4±6～83～412±性成熟時體重（g）150～25020～30500～700

1000±出入較大每年胎次4～74～73～53～52～32每胎仔數(shù)5～95～9

1～5

3～53～61～10自然壽命（年）2～2.51.5～26～84～910～12

20±體溫（℃）37.5～39.5

38～3938～39.5

38～39.5

38～3937.5～39呼吸頻率（次／分）70～100140～180

80～12050～6010～30脈搏（次／分）270～350540～720

230～390

120～14070～120血壓（mmHg）90～120133～160

75～9082～124120～140常用實驗動物的生理常數(shù)第三十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日二、試驗動物編號與標(biāo)記

1染色標(biāo)記：常用于大鼠、小鼠、豚鼠等動物紅色（0.5％中性紅或品紅溶液）——代表十位數(shù)黃色（3～5％苦味酸染料）——代表個位數(shù)習(xí)慣上按前中后和左中右次序分成9區(qū)，代表1～9。這樣，用此種方法即可標(biāo)記99只動物。第三十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日二、試驗動物編號與標(biāo)記

鼠尾染色標(biāo)記法第三十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日二、試驗動物編號與標(biāo)記

2剪耳標(biāo)記：

用于兔、大鼠等在耳朵不同部剪一小孔（或用打孔器打一小孔）表示一定號碼。3其它，如掛牌和剪毛等方法

第三十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日三、實驗動物的抓取和保定

大小鼠兔豚鼠犬

第三十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日四、被檢物的給予方式和途徑1消化道染毒法1)灌胃法：是將液態(tài)、氣或固態(tài)受試化合物溶于某溶劑中，配制成一定濃度，裝入注射器等定量容器，經(jīng)過導(dǎo)管注入胃內(nèi)。

①該種方法特點、要求：

能準(zhǔn)確掌握給予被檢物的劑量與時間需做成一定劑型對每只動物逐一進行，工作量大，且容易造成損傷所以，一般只適用于一次給予被檢物的急性毒性試驗，灌胃前，動物應(yīng)停食12h，否則胃的充盈程度不同，影響結(jié)果，灌胃后，至少經(jīng)3h再喂食。第三十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日②被檢物的配制用水或經(jīng)過加熱的植物油配成均勻水溶液或油溶液。在水和油中均不溶的物質(zhì)，可用吐溫—60（tween—60）或吐溫—80水溶液配成乳狀液將被檢物在蛋黃中研勻，逐滴加入植物油，蛋黃與油的比例為7.5：5，然后再加入適量水配成乳液也可用1～3％的淀粉液或1～3％羧甲基纖維素溶液配成懸浮液。第三十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日在各種溶液中，被檢物濃度可根據(jù)給予動物劑量和可能灌入的液體容積而定。小鼠0.2～0.7ml；大鼠1～4ml左右為宜，大動物一般最多不超過動物體重的2％。2)自由采食（又叫喂飼法）

指將受試物摻入飼料或飲水中，讓動物自由攝入。

這種方法由于動物攝食量的變化和攝食中的損失，劑量不夠精確但無上述灌胃法缺點，適用于多次給藥的慢性試驗中。第三十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日將被檢物摻入飼料中，必須注意下列問題：

被檢物必須在飼料中混合均勻，在飼料中不揮發(fā)、不分解破壞；被檢物不與飼料起反應(yīng)，不影響飼料的感官性狀和動物食欲；不降低飼料的營養(yǎng)價值和消化吸收率；應(yīng)盡量保證摻有被檢物的飼料，按設(shè)計劑量全部被試驗動物攝入；動物生長發(fā)育期間，隨時調(diào)整摻入數(shù)量，以保證按公斤體重計算的劑量穩(wěn)定。將被檢物摻入飲水的方法的基本原則與摻入飼料類似，每日飲水量小鼠約為1.5～3ml，大鼠8～15ml。在食品毒理學(xué)研究中，該方法較少采用。第三十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日3)吞咽膠囊指將一定劑量的受試化學(xué)物裝入藥用膠囊內(nèi)，強制放入到動物的舌后咽部，迫使動物咽下。

此種方法劑量準(zhǔn)確，尤其適用于易揮發(fā)、易水解和有異味的化合物，適于兔、貓、狗等大動物。第四十頁，共五十六頁，2022年，8月28日2經(jīng)呼吸道染毒

適于氣體、粉塵、蒸汽等狀態(tài)的毒物，這種方式又可分為兩種類型：

2）氣管注入：

是將受試物注入實驗動物氣管或肺內(nèi)。此種類型實際上相當(dāng)于對動物進行一次“手術(shù)”。1）呼入接觸法：

即將受試動物置于含有一定濃度的外來化學(xué)物的染毒柜中，或其它器皿中，動物自然吸入化學(xué)物。第四十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日3經(jīng)皮膚染毒

主要有浸尾試驗和皮膚涂藥試驗。其目的是鑒定化學(xué)物經(jīng)皮膚吸收作用、局部刺激作用、致敏作用、光感作用等。比如化妝品安全性鑒定。第四十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日五、實驗動物的性別鑒別1大鼠與小鼠：

幼年時主要依肛門與生殖孔的距離區(qū)分，間距大并有毛者為雄性，小并無毛者為雌性。成年雌性在腹部還可摸到乳頭，雄性臥位時可見睪丸。

2家兔：雄性生殖孔為圓形，用手指扒開可見中間有圓錐狀稍向下彎的陰莖，氣溫高時可見到或觸及睪丸。雌性生殖孔為一橢圓形間隙，呈尖葉形，上寬下窄，且距肛門較近，成年兔腹部可見乳頭。第四十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日六、生物材料的采集1血樣的采集1）斷尾采血：大、小鼠，可少量多次采血。2）眼眶后靜脈叢采血：大、小鼠，中等采血量多次采血。3）心臟采血：大鼠、豚鼠、兔等，4）斷頭采血：大、小鼠，一次大量采血。5）摘眼球采血：大、小鼠，一次，大量6）耳緣靜脈采血：兔，多次7）股靜脈或股動脈采血：大鼠、兔等，一次（放血）或多次（抽血）試驗。采血量較大。8）頸靜脈或頸動脈采血：大鼠、兔等，多次

第四十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日選擇采血方法應(yīng)根據(jù)實驗動物品種、所需采血量、采血次數(shù)和操作條件確定。實驗動物的允許采血量

━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━動物品種最大安全采血量（ml）最小致死采血量（ml）━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

小鼠0.10.3大鼠1.02.0豚鼠5.010.0家兔10.040.0━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

第四十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日2血液標(biāo)本的選擇1）全血：采血時加入適當(dāng)抗凝劑，使血液不產(chǎn)生凝固，含有有形成份的標(biāo)本。含水約81%。常用于碳氧血紅蛋白、高鐵血紅蛋白、硫血紅蛋白、細胞培養(yǎng)等測定，及制備血中各種細胞和全血分析用。常用抗凝劑有：肝素、草酸鉀、草酸鈉、草酸銨、草酸鋰、枸櫞酸鈉等。第四十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日2）血漿：全血中加入適當(dāng)抗凝劑，去除細胞成份后剩余部分的標(biāo)本。含水約93%。

3）血清：是血漿中除去凝血因子纖維蛋白原的標(biāo)本血清是生化分析中最常用的標(biāo)本。

采血后可立即分離，可避免凝血時和運輸時溶血。其中含有一種纖維蛋白原和前凝血酶。多用于血液凝固機制方面的檢驗，如游離血紅蛋白、變性血紅蛋白、纖維蛋白質(zhì)的分析及血漿分析第四十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日3尿液的收集

因動物不同而異。包括代謝籠法、導(dǎo)尿管法、輸尿管引出法和膀胱瘺管法等。

4組織勻漿的制備

用器械在一定的溶液中將組織細胞磨碎，其設(shè)備為勻漿器?，F(xiàn)用的勻漿器有玻璃勻漿器、高速組織搗碎機、超聲波勻漿器等。

第四十八頁，共五十六頁，20