siRNA干擾整合素β4的表達對MDAMB231乳腺癌細胞侵襲和遷移的影響

HainanMedHainanMedJ，Dec．2013，V01．24,No．23 海南醫(yī)學2013年12月第24卷第23期doi：10．3969／j．issn．1003—6350．2013．23．1430siRNA干擾整合都4的表達對MDA—MB一231乳腺癌細胞侵襲和遷移的影響曹穎，吳倩，文建力，童英(貴州省人民醫(yī)院病理科，貴州 貴陽550002)【摘要】目的采用RNA干擾(SmallinterferenceRNA，siRNA)技術(shù)抑制MDA．MB-231乳腺癌細胞中整合素觶(integrin／34)基因表達，觀察其對細胞侵襲和遷移能力的影響。方法選用MDA．MB-23l乳腺癌細胞為研究對象，應(yīng)用siRNA技術(shù)沉默癌細胞Integrin／34mRNA的表達，Real．timePCR和Westernblotting方法分別檢測未轉(zhuǎn)染integdnfl4siRNA的乳腺癌細胞組(簡稱空白對照組)及轉(zhuǎn)染integfin／34siRNA的乳腺癌細胞組(簡稱Integrin／34RNA干擾組)的Integrin／34mRNA和蛋白表達水平；Transwell實驗檢測兩組細胞的侵襲及遷移能力。結(jié)果與空白對照組相比，Integrin／34RNA干擾組Integrinl34的mRNA及蛋白表達水平分別降低了86％(P<0．01)和89％(P<0．01)，細胞侵襲和遷移能力下降(P<O．05)。結(jié)論應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)抑制Integrin_84表達可使MDA．MB．231細胞遷移及侵襲能力降低，提示IntegrinB4在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用?！娟P(guān)鍵詞】乳腺癌細胞；整合素彤；侵襲；遷移【中圖分類號】R737．9 【文獻標識碼】A 【文章編號】 1003---6350(2013)23—3433—04InfluenceofsiRNAsilencingintegrin盧4expressiontheabilityofinvasionandmigrationinbreastMDA—bib一231cellline．CA0Ying,WUQian,WENJian-li，TONGYing．DepartmentofPathology,GuizhouProvincmlPeople"sHospital,Guiyang550002，Guizhou,CHINA【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheinfluenceofinhibitedintegrin／34bysmallinterferenceRNA(siRNA)ontheabilityofinvasionandmigrationinbreastMDA·MB一231cellline．MethodsThebreastMDA-MB一23lcelltineswereselected．Integrin／34genewassilencedbyRNAinterferencetechnique，theexpressionsofintegrin／34atmRNAandproteinlevelsinMDA—MB——23lcellsnottransfectedwiththeintegrin／34(blankcontrols)andMDA-MB一231cellstransfectedwiththeintegrin／34siRNA(integrinl34siRNA)werestudiedbyreal—timePCRandwesternblotting，respectively．TheabilityofinvasionandmigrationweremeasuredthroughTranswell．ResultComparedwiththeblankcontrols，theexpressionsofintegrin／34atmRNAandproteinlevelsinintegrin／34siRNAweredecreasedby86％(P<0．01)and89％(P<0．O1)，respectively,andtheabilityofinvasionandmigrationwerealsodecreasedfP<O．05)．ConclusionSilencingofintegrinf14impairstheabilityinvasionandmigrationofbreastcell，suggestingthatintegrin／34mayplaykeyroleintheinvasivenessandmetastasisofbreast【Keywords】Breastcell；Integrin／34；Invasion；Migration乳腺癌是嚴重危害女性身心健康的常見惡性腫 鍵的角色n屯，；其可能參與了調(diào)節(jié)乳腺癌遷移、侵襲的瘤之一，近年來發(fā)病率明顯上升。遷移浸潤是癌細 關(guān)鍵信號通路p31。為探討Integrin134在乳腺癌浸潤胞惡性程度的重要評價指標之一，具有高遷移浸潤 轉(zhuǎn)移中的作用，本研究采用體外合成的小干擾RNA能力的乳腺癌容易復(fù)發(fā)，預(yù)后不良。腫瘤的侵襲機 (SmallinterferenceRNA，siRNA)抑制MDA-MB一231制極為復(fù)雜，包括腫瘤細胞的脫離、侵入、附著、侵 乳腺癌細胞Integrin／34的表達，觀察其對癌細胞侵襲出、血管生成及其生長。整合素(Integrin)是粘附分 和遷移能力的影響。子中的一類，由a,／3亞單位經(jīng)非共價鍵連接而成的異 1材料與方法二聚體跨膜糖蛋白。研究顯示，Integrin／34(即Integ— 1．1 主要材料源于人的MDA．MB一231乳腺rinet6／34，簡稱Integrin／34)可能在腫瘤進展中起到關(guān) 癌細胞株購自中南大學湘雅中心實驗室；1640培基金項目：貴州省科技廳科研項目(編號：黔科合J字[201112121號)；貴陽市科技局科研項目(編號：筑科合同[2011103137號)通訊曹穎。E-mail：caoyin90417@163．corn·3433·萬方數(shù)據(jù)海南醫(yī)學2013年12月第24卷第23期海南醫(yī)學2013年12月第24卷第23期HainanMedJ，Dee．2013，Vol。24,No．23養(yǎng)基、胎牛血清、0．25％胰酶購于HyClone公司；兔 Integrin／34腳．a(chǎn)ctin蛋白表達。結(jié)果用GDS一8000型抗人多克隆抗體Integrin／34(SC一9090)、辣根過氧化 uVP凝膠成像系統(tǒng)照像，以Labworks軟件分析結(jié)果物酶(HRP)標記的驢抗兔二抗(sc一2313)和驢抗鼠 時以p．a(chǎn)ctin蛋白條帶作為內(nèi)參照，計算Integrinfl4蛋二抗(sc一2314)、siRNA(sc一35678)、siRNA陰性對照 白條帶與屆．a(chǎn)ctin蛋白條帶像素灰度的百分比值作為(SC一37007)、siRNA熒光質(zhì)控(sc一36869)、siRNA轉(zhuǎn)染 蛋白表達的相對水平。試劑(SC一29528)及siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基(sc一36868)均購 1．2．5 Transwell檢測細胞侵襲和遷移能力于SantaCruz公司；鼠抗人口一actin單克隆抗體1．2．5．1Transwell侵襲實驗細胞轉(zhuǎn)染同實驗(A-1987)購于Sigma公司；SYBPGreenMix購自ABI1．2．2，轉(zhuǎn)染48h后，常規(guī)消化細胞，PBS洗兩遍，用含公司；Real．timePCR引物由上海基康公司合成；0．I％FBS的無血清培養(yǎng)基混懸、稀釋，調(diào)整細胞密度Transwelld、室購于美國ComingCostar公司；Matrigel至l×105個／ml。取細胞懸液200ul加入至已鋪膠購于BD公司；結(jié)晶紫溶液購于Sigma公司。Matrigel膠的8岬孔徑Transwelldx室上室，將600肛l1．2方法 含5％FBS的1640培養(yǎng)基加入下室，37℃、5％CO：培1．2．1細胞培養(yǎng)及分組用含10％胎牛血清、 養(yǎng)24h后，取出Transwelldx室，棉簽擦去室內(nèi)未轉(zhuǎn)移1％雙抗(青霉素100U／mL，鏈霉素100U／mL)的1640細胞，95％酒精固定5min，結(jié)晶紫溶液染色，PBS洗培養(yǎng)液，5％CO：、37℃培養(yǎng)MDA—MB一231細胞。細2遍，顯微鏡下觀察，隨機取5個視野，細胞計數(shù)。實胞分組為空白對照組、陰性對照組、Integrin／34RNA驗重復(fù)3次。干擾組。1．2．5．2Transwell遷移實驗Transwell小室不1．2．2 siRNA的轉(zhuǎn)染 生長良好的細胞用 進行Matrigel膠包被，其余實驗步驟同Transwell侵襲0．25％胰蛋白酶消化傳人六孔細胞培養(yǎng)板中，待其匯實驗。合度達80％時按SantaCruz公司轉(zhuǎn)染說明書按不同 1．3統(tǒng)計學方法每組所得結(jié)果用均數(shù)-4-標準比例進行轉(zhuǎn)染siRNA熒光質(zhì)控，根據(jù)熒光值摸索和 差(孤)表示，結(jié)果應(yīng)用SPSS15．0統(tǒng)計軟件進行單因優(yōu)化siRNA的轉(zhuǎn)染條件。再分別轉(zhuǎn)染Integrin／34 素方差分析，組間比較采用g檢驗進行處理，P<0．05siRNA、siRNA陰性對照，轉(zhuǎn)染后6h換正常培養(yǎng)基繼 或P<0．01表示差異有統(tǒng)計學意義。續(xù)培養(yǎng)48h后收集細胞，并設(shè)未轉(zhuǎn)染組作為空白對2結(jié)果照，每組均設(shè)3個復(fù)孑L，重復(fù)3次。2．1轉(zhuǎn)染Integrin膽siRNA后Integrin膽mRNA1．2．3 Real．timePCR方法檢測Integrin肼mRNA 及蛋白表達水平與空白對照組比較，Integrin觶表達水平Trizol一步法提取各組細胞總RNA，取RNA干擾組Integfin／34mRNA和蛋白表達水平分3pgRNA樣品逆轉(zhuǎn)錄eDNA，以cDNA產(chǎn)物為模板 別下降86％(圖1A)和89％(圖1B)，差異有統(tǒng)計學進行Real．timePCR(SYBRGreenI嵌合熒光法)。 意義(P<0．01)；轉(zhuǎn)染陰性對照組與空白對照組比較ABl7300型熒光定量PCR儀采集Integfin／34基因及 差異無統(tǒng)計學意義；說明已將Integrin／34siRNA轉(zhuǎn)內(nèi)參照屆．a(chǎn)ctin擴增各循環(huán)熒光信號，以AppliedBio— 入MDA．MB一231細胞，且抑制了Integrin／34mRNAsystemsSDSl4．0軟件進行熒光采集和數(shù)據(jù)分析。 和蛋白水平的表達，瞬時轉(zhuǎn)染Integrin／34基因沉默SDS14．0軟件分析其ACt值及RQ(Relativequantity) 細胞構(gòu)建成功。值，RQ=2一ACt。分析實驗結(jié)果時以屆一actin為內(nèi)對 2．2轉(zhuǎn)染Integrin／34siRNA后細胞侵襲和遷照，計算Integrin／34mRNA和對照組的相對水平。 移能力變化Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染陰Real．timePcR引物序列、PCR產(chǎn)物片斷見表l。 性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義；表1Real—timePCR引物序列及PCR產(chǎn)物片斷 Integrin／34RNA干擾組與其他兩組比較，穿膜細胞基因 引物序列 擴增產(chǎn)物 數(shù)減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0．05，圖2A)；Integrin出上游5’TCATCAAGGAGCAAGCCAGA3’ 273bp Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染陰性對照組與空下游3’CCGCAGGAGC論AGTCAAC5。 白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義；Integrin／34RNA口一actin上游5’ACTGGAACGGTGAAGGTGACA3。60bp干擾組與其他兩組比較，遷移細胞數(shù)減少，差異具下游3’ATGGCAAGGGACTTCCTGTAAC5’有統(tǒng)計學意義(P<0．05，圖2B)。結(jié)果表明，siRNA1．2．4 WesternBlotting方法檢測Integfin／34蛋 干擾Integrin肼基因表達后細胞的侵襲和遷移能力白表達水平WesternBlotting方法檢測各組細胞下降?！?434·萬方數(shù)據(jù)海南醫(yī)學2013年12月第24卷第23期啪 海南醫(yī)學2013年12月第24卷第23期啪 O口空白對照紐{|||| 呂衄 照性哆纖小．4 組W O 口轉(zhuǎn)染例性對j!{{組奎濤_豈白染昭 衄integrin／34SiRNA㈨ )∞ )∞ )如 )o 丁n㈠㈠㈠U T囫M∽∽川u 樂曲 )一乏、『長一L強矗善蓼三 ，．|l_llllllloll，-Ill，}。上 ^∽M∽M幽integrin阻●——，——。fi-Actin崎嚏魚蔓一A B圖1轉(zhuǎn)染Integrinfl4siRNA后Integrinfl4mRNA(A)及蛋白(B)表達水平壤 針㈨嘲 Ⅻ舊¨如啪一 r---'l空l‘I對_}!{{組四轉(zhuǎn)染陰中i：對照組∞ ㈣一空輪m自染鋁差；卅．c嘲時膽照姘紕W 皿皿integrinf；4SiRNA印I_l¨ 鯽_∞_ ∞∞一 一≯二，乓掣磊淫吲 ∞ 一琶}v『，掣熹丟{!一^㈠㈠㈠U一南剴M幽一曷目*贏㈣～。～加_ 加。一一A B圖2轉(zhuǎn)染Integrin[34siRNA后細胞侵襲(A)和遷移能力(B)變化注：+表示與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<O．05)。3討論 于細胞膜，導致半橋粒結(jié)構(gòu)消失，細胞骨架重構(gòu)，腫瘤自1992年HynesH1首先提出細胞表面整合素的變 細胞脫離基底膜，失去極性。增高、游離的整合素口4化較細胞外基質(zhì)成分更能反映腫瘤細胞及轉(zhuǎn)化細胞黏 扮演著重要的細胞信號轉(zhuǎn)導功能，激活下游信號傳導附特性及對細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用以來，整合素表達 通路，這時的細胞往往表現(xiàn)出較強的增殖能力、遷移改變與腫瘤細胞生物學行為的關(guān)系備受重視。大量研 力和侵襲力。究均證明，整合素在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮著 Integrin／34在鱗癌、乳腺癌、甲狀腺癌、膀胱癌、結(jié)重要作用01。目前認為，整合索在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中 直腸癌和胃癌中的表達水平均明顯增高，而且與腫瘤主要起兩個方面的作用：①整合素介導腫瘤細胞和細 細胞的惡性程度相關(guān)。在乳腺癌中，Integrind邱4與胞外基質(zhì)的粘附，可改變基質(zhì)的成分，調(diào)節(jié)基質(zhì)生物學 癌細胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但其作用機制還不清楚。在功能，從而促進腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。②整合素介 轉(zhuǎn)移性乳腺癌中IntegrinoW、口3高表達，Integrind6．／3導的異常信息從細胞外基質(zhì)向細胞內(nèi)傳遞，促進了腫 4N表達意味著乳腺癌預(yù)后差口，。我們對不同分子亞瘤細胞失控制性生長、腫瘤細胞的去分化與遠處轉(zhuǎn) 型乳腺癌中Integrin／34表達研究也顯示：具不良預(yù)后移。目前研究認為整合素O／亞單位與基質(zhì)特異性粘附 的三陰性乳腺癌和HER2型乳腺癌Integrin／34呈高表有關(guān)，屆亞單位則可能與細胞的信號傳導功能有關(guān)陋，。 達趨勢(數(shù)據(jù)另文發(fā)表)。對乳腺癌轉(zhuǎn)移機制的體外實Integrin／34亞單位和“6亞單位組成異二聚體，是驗研究也顯示：由Integrin／34介導的細胞間及與細胞上皮細胞半橋粒的主要結(jié)構(gòu)分子。半橋粒是上皮細外基質(zhì)的相互作用等信號事件在乳腺腫瘤形成、生長、胞“錨釘”于基質(zhì)上的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其主要作用是將上皮侵襲、轉(zhuǎn)移諸多過程中起了重要作用。本研究通過細胞錨定在基底膜上，防止機械力造成的細胞與基底siRNA方法選擇性下調(diào)Integrin觶的表達，可使高侵襲膜脫離。在多種組織來源的惡性腫瘤細胞中，整合素性乳腺癌細胞株MDA—MB一231遷移及侵襲能力降低，口4的表達水平增高，并且脫離半橋粒結(jié)構(gòu)，游離分布提示Integrin肼在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用?！?435．萬方數(shù)據(jù)海南醫(yī)學2013年12B第24卷第23期 Hainan海南醫(yī)學2013年12B第24卷第23期 HainanMedJ'Dec．2013，Voi．24,No．23doi：10．3969／j．issn．1003～6350．2013．23．1431 ·論不同劑量鏈脲佐菌素建立妊娠糖尿病小鼠模型穩(wěn)定性比較雷晨1，張婕2，王琦3(寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院教學工作辦公室1、檢驗中心2、肝膽外科3，寧夏銀川 750004)【摘要】目的探討鏈脲佐菌素方法建立妊娠糖尿病小鼠模型中不同給藥劑量對成模率及穩(wěn)定性的影響。方法將40只C57BL／6J孕鼠隨機分為對照組(10只)和實驗組(鏈脲佐菌素低、中、高劑量組，每組lO只)，對照組一次性腹腔注射等劑量的檸檬酸緩沖液，實驗組分別予一次性腹腔注射現(xiàn)配鏈脲佐菌素溶液20mg／kg、50mg／kg、100mg／kg，之后均給予普通飼料喂養(yǎng)，自由進水。分別于妊娠第3、10、18天測空腹血糖與體質(zhì)量，并觀察飲水量與尿量變化，比較孕鼠成模情況。結(jié)果20mg／kgSTZ注射組成模率為40％，50mg／kg鏈脲佐菌素組成模率為70％，100mg／kgSTZ注射組成模率為50％。空腹血糖與對照組相比較其高血糖狀態(tài)持續(xù)時間長，且體質(zhì)量明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(尸<O．05)。結(jié)論鏈脲佐菌素50mg／kg腹腔注射C57BL／6J孕鼠是建立妊娠糖尿病小鼠模型的最佳劑量，具有較好的穩(wěn)定性?！娟P(guān)鍵詞】鏈脲佐菌素；妊娠糖尿??；小鼠；模型【中圖分類號】R-332 【文獻標識碼】A 【文章編號】 1003--6350(2013)23—3436_-03Comparisonthestabilityofthemousemodelofgestationaldiabetesestablisbedbydifferentdosesofstreptozotocin．LEIChenl，Zhangfie2．WANGQi3．TeachingOff-zcei．ClinicalLaboratory2。DepartmentofHepatobiliarySurgeryJ，GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004，Ningxia，CHINA【Abstract】0bjeetiveToinvestigatetheeffectofdifferentdosesofstreptozotocin(STZ)onthestabilityofthemousemodelofgestationaldiabetesestablishedbystreptozotocin．MethodsFortyC57BL／6Jpregnantmicewererandomlydividedintothecontrolgroup(10mice)andthestreptozotocingroup(20mg&gSTZgroup，50m眺gSTZgroupand100mg／kgSTZgroup，eachwith10mice)．Themicewereinjectedintraperitoneallywithequaldoseofcitratebuffer,STZsolution20mg／kg，50mg／kg，100mg／kg，respectively,accordingtotheirassignedgroups，and基金項目：寧夏自然科學基金(編號：NZl214、NZ07101)；寧夏科技公關(guān)項目(編號：2009年)通訊雷晨。E—mail：leichen@medmait．tom．ca一般認為，Integrin是通過各種信號途徑把細胞 為乳腺癌藥物開發(fā)的候選靶點提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。外的信號傳人細胞內(nèi)，再通過激酶鏈(MAPKJJNK)傳 參考文獻人細胞核，調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的表達。同 【l】WilhelmsenK，LitjensSH，SonnenbergA．Multiplefunctionsoftheintegrina6f14inepidermalhomeostasisandtumorigenesis[J】．Mol時細胞外的信號傳到細胞骨架蛋白引起細胞變形、移CellBiol，2006，26(8)：2877—2886．動。信號傳導有以下途徑：(1)對黏著斑蛋白激酶(Fo．【2】LipscombEA，SimpsonKJ，LyleSR，eta1．Thealpha6bem4integrincaladhesionkinase，F(xiàn)闌的激活；(2)對整合素連接蛋maintainsthesurvivalofhumanbreastca