分析方法的方法學(xué)驗證

3/3分析方法的方法學(xué)驗證一、方法驗證

1．準(zhǔn)確度該指標(biāo)主要是通過回收率來反映。驗證時一般要求分別配制濃度為80％、100％和120％的供試品溶液各三份，分別測定其含量，將實測值與理論值比較，計算回收率?？山邮艿臉?biāo)準(zhǔn)為：各濃度下的平均回收率均應(yīng)在98.0%-102.0%之間，9個回收率數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）應(yīng)不大于2.0%。

2．線性線性一般通過線性回歸方程的形式來表示。具體的驗證方法為：在80％至120％的濃度范圍內(nèi)配制6份濃度不同的供試液，分別測定其主峰的面積，計算相應(yīng)的含量。以含量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸分析?？山邮艿臉?biāo)準(zhǔn)為：回歸線的相關(guān)系數(shù)（R）不得小于0.998，Y軸截距應(yīng)在100％響應(yīng)值的2％以內(nèi)，響應(yīng)因子的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%。

3．精密度1）重復(fù)性配制6份相同濃度的供試品溶液，由一個分析人員在盡可能相同的條件下進(jìn)行測試，所得6份供試液含量的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%。2）中間精密度配制6份相同濃度的供試品溶液，分別由兩個分析人員使用不同的儀器與試劑進(jìn)行測試，所得12個含量數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%。

4．專屬性可接受的標(biāo)準(zhǔn)為：空白對照應(yīng)無干擾，主成分與各有關(guān)物質(zhì)應(yīng)能完全分離，分離度不得小于2.0。以二極管陣列檢測器進(jìn)行純度分析時，主峰的純度因子應(yīng)大于980。

5．檢測限主峰與噪音峰信號的強度比應(yīng)不得小于3。

6．定量限主峰與噪音峰信號的強度比應(yīng)不得小于10。另外，配制

6份最低定量限濃度的溶液，所測6份溶液主峰的保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%。

7．耐用性分別考察流動相比例變化±5％、流動相pH值變化±0.2、柱溫變化±5℃、流速相對值變化±20％時，儀器色譜行為的變化，每個條件下各測試兩次?？山邮艿臉?biāo)準(zhǔn)為：主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰與雜質(zhì)峰必須達(dá)到基線分離；各條件下的含量數(shù)據(jù)（n=6）的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%。

8、系統(tǒng)適應(yīng)性配制6份相同濃度的供試品溶液進(jìn)行分析，主峰峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%，主峰保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于1.0%。另外，主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰與雜質(zhì)峰必須達(dá)到基線分離，主峰的理論塔板數(shù)應(yīng)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。

二、分析方法驗證（Validation）

進(jìn)行驗證，以證明分析方法符合檢測的目的和要求，這就是分析方法驗證。從本質(zhì)上講，方法驗證就是根據(jù)檢測項目的要求，預(yù)先設(shè)置一定的驗證內(nèi)容，并通過設(shè)計合理的試驗來驗證所采用的分析方法符合檢測項目的要求。方法驗證在質(zhì)量控制上有重要的作用和意義，只有經(jīng)過驗證的分析方法才能用于藥品生產(chǎn)的分析檢測，方法驗證是制訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)。方法驗證內(nèi)容包括方法的專屬性、線性、范圍、準(zhǔn)確度、精密度、檢出限、定量限、耐用性和系統(tǒng)適用性等，檢測目的不同驗證要求也不盡相同。

1.專屬性（Speciality/Specificity）

專屬性是指分析方法能夠?qū)a(chǎn)品和雜質(zhì)分開的特性，也稱為“選擇

性”。對于純度檢測，可在標(biāo)準(zhǔn)品中加入產(chǎn)品中的已知雜質(zhì)，或者直接用粗品，考察產(chǎn)品峰是否受到雜質(zhì)的干擾，對于過程跟蹤，可用反應(yīng)體系樣品來考察有沒有其它的雜質(zhì)干擾。必要時使用二極管陣列檢測器或者質(zhì)譜檢測器進(jìn)行色譜峰純度檢查。一般要求產(chǎn)品和雜質(zhì)之間的分離度大于2.0。

2.線性（Linearity）

線性是在設(shè)定的范圍內(nèi)，檢測結(jié)果與樣品中原料或產(chǎn)品的濃度呈線性關(guān)系的程度。線性是定量檢測的基礎(chǔ)，需要定量檢測的項目都需要驗證線性。一般用貯備液經(jīng)過精密稀釋，或分別精密稱樣，制備得到一系列被測物質(zhì)的濃度（5個以上），按濃度從小到大運行序列，以峰面積和濃度的函數(shù)作圖，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸計算，考察分析方法的線性。

3.范圍（Range）

范圍指在能夠達(dá)到一定的準(zhǔn)確度、精密度和線性時，樣品中被分析物的濃度區(qū)間。簡單的說，范圍就是分析方法適用的樣品中待測物的濃度最大值和最小值。需要定量檢測的分析方法都需要對范圍進(jìn)行驗證，純度檢測時，范圍應(yīng)為測試濃度的80％～120％。

4.準(zhǔn)確度（Accuracy）

準(zhǔn)確度是指測定的結(jié)果與真實值之間接近的程度，所以也叫做“真實度”，需要定量得分析方法均需要驗證準(zhǔn)確度。準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)建立，對于原料藥可用已知純度的標(biāo)準(zhǔn)品或符合要求的原料藥進(jìn)行測定，必要時可與另一個已建立準(zhǔn)確度的方法比較結(jié)果。

5.精密度（Precision）

精密度是指在規(guī)定條件下，同一均勻樣品經(jīng)多次取樣進(jìn)行一系列檢測所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示，取樣檢測次數(shù)應(yīng)至少6次。精密度可以從三個層次考察：重復(fù)性、中間精密度、重現(xiàn)性。

a、重復(fù)性（Repeatability）：是在相同的操作條件下、較短時間間隔內(nèi)，由同一分析人員測定所得結(jié)果的精密度。一般是用100％濃度水平的樣品測定6次的結(jié)果進(jìn)行評價。

b、中間精密度（Intermediateprecision）：同一實驗室，在日期、分析人員、儀器等內(nèi)部條件改變時，測定結(jié)果的精密度。

c、重現(xiàn)性（Reproducibility）：指不同實驗室之間不同分析人員測定結(jié)果的精密度。

6.檢出限（LimitsofDetection；LOD）

檢出限是指樣品中的被分析物能夠被檢測到的最低量，不需要準(zhǔn)確定量。檢出限體現(xiàn)了分析方法的靈敏度。檢出限的測定可以通過對一系列已知濃度被測物的試樣進(jìn)行檢測，以能準(zhǔn)確、可靠檢出被測物的最小濃度來確定，也可把已知濃度樣品的信號與噪聲信號進(jìn)行比較，以信噪比為3：1時的濃度確定檢出限，一般要求能夠達(dá)到進(jìn)樣濃度的0.05%。

7.定量限（LimitsofQuantitation/Quantification；LOQ）定量限是指樣品中的被分析物能夠被定量檢測的最低量，其測定結(jié)果需要一定的準(zhǔn)確度和精密度，定量限體現(xiàn)了分析方法靈敏定量檢測的

能力。檢測需要嚴(yán)格控制含量的雜質(zhì)，必須考察方法的定量限，以保證雜質(zhì)能夠被準(zhǔn)確定量。一般以信噪比為10：1時相應(yīng)的濃度或進(jìn)樣量來確定定量限。

8.耐用性（Durability/Robustness）

耐用性是指測定條件發(fā)生小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度，耐用性主要表明方法的抗干擾能力，主要的變動因素包括：流動相的組成、流速和pH值、色譜柱、柱溫等。經(jīng)試驗，應(yīng)說明小的變動能否符合系統(tǒng)適用性試驗要求，以確保方法有效。

9.系統(tǒng)適用性試驗（SystemSuitability）

液相色譜分析方法主要依賴高效液相色譜儀和色譜柱，在做方法驗證時，有必要將高效液相色譜儀、色譜柱、流動相與實驗操作、待測樣品等一起當(dāng)作完整的系統(tǒng)進(jìn)行評估，并將系統(tǒng)適用性作為分析方法的組成部分，系統(tǒng)適用性便是對整個系統(tǒng)進(jìn)行評估的指標(biāo)。

一般系統(tǒng)適應(yīng)性的要求為：分析方法能夠達(dá)到0.05%的檢出限；主峰的拖尾因子（T）0.95<T<1.05時最理想（峰高定量時），峰面積定量時：T<2；主峰與雜質(zhì)的分離度（R）應(yīng)大于2.0；理論塔板數(shù)（n）應(yīng)符合規(guī)定；空白干凈，主峰處無系統(tǒng)峰干擾。

分析方法開發(fā)與驗證是一個整體，在實際工作中，一般是先開發(fā)分析方法，經(jīng)過適當(dāng)?shù)膬?yōu)化以后再做方法驗證，驗證的部分內(nèi)容在分析方法開發(fā)時就要做，比如說分析方法的專屬性驗證。分析方法驗證并非必須驗證所有的內(nèi)容，只要注意驗證內(nèi)容充分，足以證明分析方法的合理性就可以了，如雜質(zhì)限度檢測一般只需要驗證專屬性和檢出限，

而精密度、線性、定量限等涉及定量測定的項目，則不需要驗證。

有時需要對分析方法進(jìn)行全面或部分