核糖體和核酶

CHAPTER9

核糖體Ribosome

1第一頁，共五十九頁。OUTLINERibosomestructureRibosomeFunctionPolyribosomeandProteinsynthesis2第二頁，共五十九頁。BackgroundaboutRibosome1953Robinsin,Brown(Plantcell)1955Palade(Animalcell)1958RobertsnameitasRIBOSOMERibosomesexistinalmostallkindsofcells.EukaryoticcellProkaryoticcellMycoplast(支原體）ChloroplastMitochondrionNomembranearoundit3第三頁，共五十九頁。Ribosomestructure

◆核糖體(ribosome)是細胞內一種核糖核蛋白顆粒(ribonucleoproteinpartical),是細胞內合成蛋白質的細胞器?！艉颂求w的主要成分是核糖體RNA(rRNA),占60%,蛋白質(r蛋白質),占40%。4第四頁，共五十九頁。60S結構大亞基小亞基柄中心突嵴平臺頭部裂溝基部50S30SmRNA40SmRNAtRNA多肽中央管5，3，mRNAA部位

P部位G因子T因子核糖體的四個活性部位5第五頁，共五十九頁。Structureofribosome?/v/b/20860082-1402872485.html#208600826第六頁，共五十九頁。核糖體的類型細胞有兩種主要類型的核糖體:◆原核細胞的核糖體:

沉降系數為70S，分子量為2.5x106,由50S和30S兩個亞基組成?！粽婧思毎暮颂求w:

沉降系數是80S，分子量為2.5x106,由60S和40S兩個亞基組成。7第七頁，共五十九頁。Mg2+

濃度對大小亞基的聚合和解離的影響:◆70S核糖體在Mg2+的濃度小于1mmol/L的溶液中易解離;◆當Mg2+

濃度大于10mmol/L,兩個核糖體通常形成100S的二聚體。

8第八頁，共五十九頁。鎂離子濃度對核糖體的影響9第九頁，共五十九頁。各種來源的核糖體亞基組成

來源完整核糖體核糖體亞基核糖體RNAs

細胞質(真核生物)80S60S(大亞基)28S40S(小亞基)18S，5.8S,5S細胞質(原核生物)70S50S(大亞基)23S30S(小亞基)16S，5S線粒體(哺乳動物)55-60S45S(大亞基)16S35S(小亞基)12S線粒體(酵母)75S53S(大亞基)21S 35S(小亞基)14S線粒體(高等植物)78S60S(大亞基)26S45S(小亞基)18S，5S葉綠體70S50S(大亞基)23S30S(小亞基)16S，5S 10第十頁，共五十九頁。核糖體的化學組成rRNA蛋白質原核細胞核糖體(70S)：1.5:1

真核細胞核糖體(80S):1:1化學組成70S核糖體50S30S80S核糖體60S40S23SRNA16SRNA5SRNA28SRNA5.8SRNA5SRNA18SRNA~34種蛋白質~21種蛋白質~45種蛋白質~33種蛋白質11第十一頁，共五十九頁。12第十二頁，共五十九頁。核糖體的裝配原核生物核糖體的裝配◆小亞基的rRNA和蛋白質的裝配關系:

組成核糖體的蛋白質和rRNA在大小亞基中均有一定的空間排布。13第十三頁，共五十九頁。原核生物rRNA前體的加工14第十四頁，共五十九頁。核糖體結合蛋白15第十五頁，共五十九頁。核糖體的合成與裝配16第十六頁，共五十九頁。17第十七頁，共五十九頁。RibosomeFunction

核糖體的功能

--蛋白質的合成18第十八頁，共五十九頁。ThreebindingsitefortRNAsAsite:氨?；?tRNA結合位點P-site:

肽?；?tRNA結合位點E-site:

釋放位點19第十九頁，共五十九頁。20第二十頁，共五十九頁。肽鏈合成的起始三元復合物的生成：起始因子(IF3)30S小亞基+mRNA（起始信號部位）+IF3

—IF3-mRNA-30S三元復合物30S前起始復合物的形成：起始因子(IF2)IF3-mRNA-30S三元復合物+IF2+fMet-tRNAf—IF2-30S-mRNA-fMet-tRNAf70S起始復合物的形成：GTP——GDP+PiIF2-30S-mRNA-fMet-tRNAf+50S大亞基

—30S-mRNA-50S-fMet-tRNAf+IF221第二十一頁，共五十九頁。5,3,AUG小亞基肽鏈合成的起始小亞基5,3,AUGIF3IF3IF3-mRNA-30S三元復合物IF2-30S-mRNA-fMet-tRNAf30S-mRNA-50S-fMet-tRNAfIF2IF3UACfMet大亞基小亞基5,3,AUGUACfMetIF2GTPGDP+PiIF2大亞基小亞基5,3,AUGUACfMetA位22第二十二頁，共五十九頁。原核和真核生物蛋白質合成起始的區(qū)別內容原核生物真核生物完整核糖體70S80S核糖體亞基50S，30S60S，40S起始tRNAfMet-tRNAfMetMet-tRNAiMet起始因子三種至少七種起始復合物1.30S-mRNA1.40S-Met-tRNAiMet主要順序2.30S-mRNA-fMet-tRNAfMe2.40S-mRNA-Met-tRNAiMet3.70S-mRNA-fMet-tRNAfMe3.80S-mRNA-Met-tRNAiMet23第二十三頁，共五十九頁。

肽鏈的延長1.氨?；?tRNA進入A位肽鏈的延長2.肽鍵的形成3.移位循環(huán)重復過程參與的因子延長因子（EF)EF-T(EF-1):與氨基酰-tRNA和GTP結合形成一種復合物，并將其帶到核糖體上。EF-G(EF-2):幫助肽?；?tRNA由核糖體A位移向P位。GTP:提供能量24第二十四頁，共五十九頁。P位A位P位A位fMetCGG丙

肽鏈的延長UACfMetP位A位3,AUGGCCUCUGGAACG5,CGG丙1.氨?；?tRNA進入A位2.肽鍵的形成UAC肽基轉移酶形成肽鍵P位A位CGG丙3,AUGGCCUCUGGAACG5,UACfMet3.移位(由A位轉移至P位）CGG丙fMet3,AUGGCCUCUGGAACG5,EF-G易位酶G因子GTPGDP+PiUACfMetP位A位3,AUGGCCUCUGGAACG5,ACUUAGACUUAGACUUAGACUUAGEF-TGTP密25第二十五頁，共五十九頁。P位A位CGG丙EF-TGTPUACfMetCGG丙fMetUAC肽基轉移酶形成肽鍵ACUUAG3,AUGGCCUCUGGAACG5,EF-G易位酶G因子GTPGDP+PiAGA絲CGG

肽鏈合成的終止與釋放P位A位RF釋放因子UGA絲fMet丙甘蘇ACUUAG3,AUGGCCUCUGGAACG5,RFUGA30S50SRF

肽鏈的延長密P位A位CGG丙3,AUGGCCUCUGGAACG5,P位A位fMetCGG丙ACUUAG3,AUGGCCUCUGGAACG5,P位A位ACUUAG3,AUGGCCUCUGGAACG5,P位A位ACUUAG3,AUGGCCUCUGGAACG5,fMet丙AGA絲26第二十六頁，共五十九頁。IF3-mRNA-30S三元復合物IF3IF2-30S-mRNA-fMet-tRNAfIF230S-mRNA-50S-fMet-tRNAf大亞基IF2GTP小亞基IF3UACfMetIF2IF3小亞基A位UACfMet大亞基GTPGDP+PiACUUAG3,AUGGCCUCUGGAACG5,P位A位ACUUAG3,AUGGCCUCUGGAACG5,UACfMetCGG丙EF-TGTPCGG丙肽基轉移酶形成肽鍵fMetP位A位CGG丙3,AUGGCCUCUGGAACG5,UACEF-G易位酶G因子GTPGDP+PiP位A位fMetCGG丙ACUUAG3,AUGGCCUCUGGAACG5,AGA絲P位A位ACUUAG3,AUGGCCUCUGGAACG5,CGGP位A位ACUUAG3,AUGGCCUCUGGAACG5,AGA絲fMet丙P位A位UGARF釋放因子UGA30S50SRFRF絲fMet丙甘蘇ACUUAG3,AUGGCCUCUGGAACG5,肽鏈合成的起始肽鏈的延長肽鏈合成的終止與釋放多肽鏈的合成27第二十七頁，共五十九頁。核糖體合成的蛋白質

外輸蛋白（分泌蛋白）：由附著核糖體合成，大多從細胞分泌出去。

結構蛋白：由游離核糖體合成，多分布細胞基質中。某些結構蛋白（膜鑲嵌蛋白、溶酶體酶蛋白、等）是由附著核糖體合成的。完28第二十八頁，共五十九頁。核糖體蛋白與rRNA的功能

核糖體上具有一系列與蛋白質

合成有關的結合位點與催化位點29第二十九頁，共五十九頁。與mRNA的結合位點與新摻入的氨酰-tRNA的結合位點——氨?；稽c，又稱A位點與延伸中的肽酰-tRNA的結合位點——肽?；稽c，又稱P位點肽酰轉移后與即將釋放的tRNA的結合位點——E位點(exitsite)與肽酰tRNA從A位點轉移到P位點有關的轉移酶

(即延伸因子EF-G)的結合位點肽酰轉移酶的催化位點與蛋白質合成有關的其它起始因子、延伸因子和終止因子的結合位點核糖體結合位點30第三十頁，共五十九頁。在核糖體中rRNA是起主要作用的結構成分具有肽酰轉移酶的活性；為tRNA提供結合位點(A位點、P位點和E位點)；為多種蛋白質合成因子提供結合位點；在蛋白質合成起始時參與同mRNA選擇性地結合以及在肽鏈的延伸中與mRNA結合；核糖體大小亞單位的結合、校正閱讀(proofreading)、無意義鏈或框架漂移的校正、以及抗菌素的作用等都與rRNA有關。31第三十一頁，共五十九頁。r蛋白質的主要功能對rRNA折疊成有功能的三維結構是十分重要的；在蛋白質合成中,某些r蛋白可能對核糖體的構象起“微調”作用；在核糖體的結合位點上甚至可能在催化作用中,核糖體蛋白與rRNA共同行使功能。

32第三十二頁，共五十九頁。問題如何證明在核糖體合成蛋白質過程中起主要功能作用的是RNA，而不是蛋白質？？33第三十三頁，共五十九頁。

蛋白質合成抑制劑（抑制核糖體與tRNA結合）☆抗生素☆嘌呤霉素34第三十四頁，共五十九頁。多聚核糖體(polyribosome或polysome)蛋白質正在合成時的一種狀態(tài)。35第三十五頁，共五十九頁。多聚核糖體36第三十六頁，共五十九頁。多聚核糖體(polyribosome或polysome)概念核糖體在細胞內并不是單個獨立地執(zhí)行功能，而是由多個甚至幾十個核糖體串連在一條mRNA分子上高效地進行肽鏈的合成，這種具有特殊功能與形態(tài)結構的核糖體與

mRNA的聚合體稱為多聚核糖體。

多聚核糖體的生物學意義 細胞內各種多肽的合成，不論其分子量的大小或是mRNA的長短如何，單位時間內所合成的多肽分子數目都大體相等。 以多聚核糖體的形式進行多肽合成，對mRNA

的利用及對其濃度的調控更為經濟和有效。37第三十七頁，共五十九頁。RNA在生命起源中的地位及其演化過程38第三十八頁，共五十九頁。生命是自我復制的體系三種生物大分子，只有RNA既具有信息載體功能又具有酶的催化功能。因此，推測RNA

可能是生命起源中最早的生物大分子。核酶(ribozyme)：具有催化作用的RNA。由RNA催化產生了蛋白質39第三十九頁，共五十九頁。DNA代替了RNA的遺傳信息功能

DNA雙鏈比RNA單鏈穩(wěn)定；

DNA鏈中胸腺嘧啶代替了RNA鏈中的尿嘧啶，使之易于修復。40第四十頁，共五十九頁。蛋白質取代了絕大部分RNA酶的功能蛋白質化學結構的多樣性與構象的多變性；與RNA相比，蛋白質能更為有效地催化多種生化反應，并提供更為復雜的細胞結構成分，逐漸演化成今天的細胞。

41第四十一頁，共五十九頁。核糖體與癌癥蛋白質是生命活動的最終執(zhí)行者，核糖體擔負著細胞中蛋白質的合成，因此核糖體在整個生命過程中發(fā)揮重要功能。核糖體的生物合成和轉錄控制在細胞處理過程中多個水平進行。目前已經發(fā)現一些腫瘤抑制子和前癌基因可以影響核糖體成熟，通過改變蛋白質合成機器中的某些組分而誘導腫瘤的發(fā)生。42第四十二頁，共五十九頁。單一蛋白質突變控制核糖體生物合成

低等生物L16：在酵母菌中進行的基因靶向試驗表明單一一種蛋白質的去除如L16，導致60s核糖體大單位減少，這直接與多核糖體減少和細胞增殖缺陷相關。因此僅一種核糖體蛋白質的表達被破壞就能夠引起核糖體產生的減少。其它的蛋白質：在果蠅中，單一的核糖體蛋白質突變就可以導致一組綜合性突變，被稱為minute。Mintue

蒼蠅是以體積減少為特征，失去生育能力和隱性的致死性。許多直接和間接的證據已經證實minute細胞核糖體含量降低，因此蛋白質合成能力降低。蛋白質合成的減少導致了細胞生長和增殖的降低。43第四十三頁，共五十九頁。高等生物：S6：小鼠中去除40s核糖體蛋白質S6，直接導致了核糖體生物合成的缺陷和細胞增殖的降低。而S6磷酸化可以被癌細胞中失調的細胞外信號進行調節(jié)。S6磷酸化與特異的一組被稱為TOP的mRNA翻譯相關（TOP:aterminaloligopyrimidinebractinthe5’untranslatedregion(UTR)）。由TOP基因編碼的蛋白質本身即為一種原癌基因，因此，TOP基因的表達失調也許啟動了腫瘤的發(fā)生。哺乳動物中，S6磷酸化的調節(jié)是非常復雜的。這種復雜性提高歸因于另一種激酶S6K2的存在。44第四十四頁，共五十九頁。S3a：在腫瘤細胞中過量表達。顯然單個核糖體蛋白質刪除在許多模型組織中可以直接影響細胞的生長，但是對核糖體蛋白質的過量表達還沒有清晰明朗的認識。核糖體蛋白質S3a過量表達可以誘導NIH3T3細胞轉型突變，并在裸鼠中誘導腫瘤的產生。S3a誘導轉型突變的能力依賴于其抑制程序性死亡的作用，因此S3a也許引起了抗凋亡蛋白的上調。45第四十五頁，共五十九頁。癌癥和核糖體的生物合成先天性角化不良癥

DKC1編碼假尿嘧啶合成酶，通過在特異位點將尿嘧啶轉變成假尿嘧啶而介導了rRNA轉錄前的調節(jié)。DKC1基因的突變與DC相關。在酵母和蒼蠅中，DKC1的缺陷導致了rRNA修飾的損傷與核糖體生物合成過渡有關

DKC1也與端粒酶中的RNA合成相關，是否核糖體功能障礙引起了DC的病理過程仍需在動物模型中進一步驗證。46第四十六頁，共五十九頁。先天性障礙性貧血：這種疾病已經被確定與核糖體蛋白質S19突變相關，一種由于核糖體合成缺陷而使機體具有癌癥易感性的疾病。在Drosophila中，僅一個核糖體蛋白質的突變既可以造成minutue表型。先天性障礙性貧血病人，在出生時有一個生長不足，表現為嚴重的生長遲緩現象。兩這是否具有相同的發(fā)生機制還需要進一步闡明。47第四十七頁，共五十九頁。AproteinboundtoaspecificDNAsequencewillinterferewiththedigestionofthatregionbyDNaseI.Anend-labelledDNAprobeisincubatedwithaproteinextractorapurifiedDNA-bindingfactor.TheunprotectedDNAisthenpartiallydigestedwithDNaseIsuchthatonaverageeveryDNAmoleculeiscutonce.Digestionproductsarethenresolvedbyelectrophoresis.ComparisonoftheDNaseIdigestionpatterninthepresenceandabsenceofproteinwillallowtheidentificationofafootprint(protectedregion)****DenaturingPAGEFootprintExp.IdentificationofTFbindingsite:DNase1Footprinting48第四十八頁，共五十九頁。

RNApol在DNA上結合位點的鑒定足跡法原理：

?限制酶切割結合有RNApol的DNA→大分子DNA?末端標記該DNA（Klenow片段標記3’,堿性磷酸酯酶標記5’）

?用內切酶降解DNA（控制反應條件）

?凝膠電泳分離，放射自顯影觀察49第四十九頁，共五十九頁。限制酶切分離大片段DNA50第五十頁，共五十九頁。末端標記大分子DNA重新結合RNApol

作對照直接用DNase進行降解電泳用微量DNase降解電泳51第五十一頁，共五十九頁。52第五十二頁，共五十九頁。

?用足跡法鑒定出來的RNApol與DNA的結合區(qū)域為

+20~－50（－40），大約60~70bp

53第五十三頁，共五十九頁。核酶(ribozyme)：有催化活性的RNA1982年，美國ThomasCech在研究四膜蟲rRNA自我剪接時發(fā)現，在沒有任何蛋白酶參與下，含有413bp干擾序列（IVS）的前體rRNA發(fā)生了自切割.

同時加拿大的SidneyAltman發(fā)現RNaseP分子中的RNA組分有催化活性；1989年分享了Noble化學獎。不僅拓寬了生物催化劑的領域，而且對RNA的生物學功能開創(chuàng)了一種歷史性的新認識：RNA不僅具有儲存和傳遞遺傳信息的功能，而且還具有生物催化劑的功能，在一定程度上可以說，RNA一身兼有DNA和蛋白質兩大類生物大分子的功能。54第五十四頁，共五十九頁?！窈嗣刚婧松飏RNA的自身剪切

四膜蟲

26SrRNA核酶（ribozyme）應用

前體6.4kb414bp內含子

5.986kb

無酶催化，自身剪接具有催化功能的RNA

切割特異性RNA序列具特定的二級結構槌頭結構人工合成核酶的槌頭結構破壞HIV病毒

55第五十五頁，共五十九頁。底物催化部分圖13-1156第五十六頁，共五十九頁。酶底物圖13-1257第五十七頁，共五十九頁。Matchthefollowingwiththeirroleintranslation._____AseriesofthreetRNAbasescomplementarytoamRNAcodon.(ans)

_____Theribozymethatformspeptidebondsbetweenaminoacidsduringtranslation.(ans)

_____TheribosomalsubunitthatbindstomRNAtoformtheinitiationcomplex.(ans)

_____Theribosomalsitewhereanaminoacyl-tRNAfirstattachesduringtranslation.(ans)

_____TheribosomalsitewherethegrowingaminoacidchainistemporarilybeingheldbyatRNAasthenextcodoninthemRNAisbeingread.(ans)

_____AcomplexofanaminoacidandatRNAmolecule.(ans)

_____ThesequenceofbasesonmRNAtowhicha30Sor40Sribosomalsubunitfirstattaches.(ans)

_____AseriesofthreemRNAbases