復(fù)旦大學(xué)-核酸化學(xué)1課件

核酸化學(xué)

BiochemistryofNucleicAcids核酸是重要的生物大分子核酸研究是現(xiàn)代生物化學(xué)及分子生物學(xué)的重要領(lǐng)域一百多年的研究歷史（1868）核酸的生物學(xué)作用在其被發(fā)現(xiàn)后的70多年才被證明-所有生物的遺傳物質(zhì)（1944）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)（1953）重組DNA技術(shù)（1972）人類基因組計劃（1990-2003）RNA干擾（RNAi）（1996） 核酸的生物學(xué)功能主要是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，隨著對核酸研究的深入，發(fā)現(xiàn)它的功能是多方面的。生物體的生長發(fā)育、遺傳變異等都與核酸密切相關(guān)。因此核酸結(jié)構(gòu)和功能的研究對深入探索生命奧秘起著至關(guān)重要的作用。研究歷史核酸化學(xué)研究史（1）1869年Miescher博士論文工作中測定淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)組成時,發(fā)現(xiàn)了不溶于稀酸和鹽溶液的沉淀物,并在所有細(xì)胞的核里都找到了此物質(zhì),故命名“核質(zhì)(Nuclein)

”。1879年Kossel經(jīng)過10年的努力,搞清楚了核質(zhì)中有四種不同的組成部分:A,T,C和G。核酸化學(xué)研究史（3）1950年

Chargaff,E和Hotchkiss,R.D.采用紙層析法仔細(xì)分析了DNA的組成成分,得知[A]=[T],[G]=[C],[A+G]=[C+T]1953年Watson,Crick根據(jù)DNA的X射線圖譜的研究結(jié)果,提出了DNA的雙螺旋模型(Doublehelix)。幾星期后提出了半保留式復(fù)制模型。1957年Meselsnhe&Stahl用密度梯度超離心法和同位素標(biāo)記-半保留復(fù)制假說。核酸化學(xué)研究史（4）1958年

Kornberg得到高純度的DNApolymerase,這種酶需要一個模板DNA。1960年Cairns拍下了復(fù)制中的細(xì)菌DNA的電鏡照片。

1970年發(fā)現(xiàn)第一個DNA限制性內(nèi)切酶。1972年DNA重組技術(shù)的建立。1978年雙脫氧DNA測序法的建立。1990年人類基因組(HGP)計劃實施。核酸化學(xué)研究史-mRNA

（6）1948年有人報道，當(dāng)噬菌體感染了細(xì)菌后會產(chǎn)生一種很不穩(wěn)定的RNA，而大多數(shù)是和核糖體結(jié)合在一起。Brenner,Jacob等人用13C，15N標(biāo)記蛋白質(zhì)，用32P標(biāo)記核酸的方法證實了這是一種新的RNA分子，命名為信使RNA,即mRNA(m,messenger)。1961年，Spielman創(chuàng)造了分子雜交法，通過32P

-mRNA-DNA雜交分子證明了mRNA的存在。核酸化學(xué)研究史-tRNA（7）

1957年Hoagland,M.B.發(fā)現(xiàn)一類穩(wěn)定的RNA小分子，不與核糖體結(jié)合，因而不同于mRNA和rRNA。Crick,F.比較了核酸和氨基酸的大小和形狀后，認(rèn)為不可能在空間上互補(bǔ)，因此他對核酸→蛋白質(zhì)的信息傳遞作了以下預(yù)測：a).它是一種分子轉(zhuǎn)換器，使信息從核酸序列轉(zhuǎn)換成氨基酸序列；b).這種分子很可能是核酸；c).它不論以何種方式進(jìn)入蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)的模板，都必須與模板形成氫鍵（即配對）；d).有20種分子轉(zhuǎn)換器，每種氨基酸一個；e).每種氨基酸必定還有一個對應(yīng)的酶，催化與特定的分子轉(zhuǎn)換器結(jié)合。

1963年，Ehrenstein等人用實驗證明了Hoagland發(fā)現(xiàn)的分子就是Crick預(yù)言的分子轉(zhuǎn)換器，即tRNA。1965年Holley經(jīng)過7年努力測出酵母Ala-tRNA序列。核酸化學(xué)研究史-遺傳密碼的破譯（8）1953年Dounce假設(shè)DNA通過RNA將信息傳給蛋白質(zhì)，RNA上每三個核苷酸形成一個“空洞”，正好將一個個氨基酸裝進(jìn)去。該假說允許三聯(lián)體的重疊。命中率80％1954年物理學(xué)家Gamow與Teller等人聯(lián)手，也提出三聯(lián)體學(xué)說，并指出不可重復(fù)的特點(diǎn)。

命中率20％1957年

Crick也提出了三聯(lián)體的假說。他意識到要解決“天書”的“詞法”和“句法”，必須要有一本標(biāo)準(zhǔn)詞典，以便決定64種組合中的44種是無用的。

即“簡并密碼”和“閱讀框”1961年

Crick在Bencer,S的突變實驗的基礎(chǔ)上，用重組法得到了+++和---型，發(fā)現(xiàn)讀框和野生型一致，從而證明了三聯(lián)體的假說。

JamesWatson(left)andFrancisCrickFrancisHarryComptonCrick

JamesDeweyWatson

MauriceHughFrederickWilkins

GreatBritainUSAGreatBritainInstituteofMolecularBiology

Cambridge,GreatBritainHarvardUniversity

Cambridge,MA,USAUniversityofLondon

London,GreatBritain1916-1928-1916-2004"fortheirdiscoveriesconcerningthemolecularstructureofnucleicacidsanditssignificanceforinformationtransferinlivingmaterial"TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1962青山襯托之下，是一片金燦燦的中國水稻梯田。2002年4月5日以中國梯田為封面的?Science?雜志以14頁篇幅率先發(fā)表了一個重大成果—中國人獨(dú)立完成的論文《水稻（秈稻）基因組的工作框架序列》，顯示對中國科學(xué)家成就充分肯定。COVERPhotographoftheHongheHaniriceterracesinYunnanProvince,China.Inthisissue,twoseparateresearchgroupsreportdraftsequencesoftwostrainsofrice--japonicaandindica.Inaddition,theEditorial,NewsFocus,Letters,andPerspectiveshighlightthesignificanceofthericegenometotheworld'spopulation.[Image:LiwenMaandBaoxingQiu,BeijingGenomicsInstitute]核酸骨架結(jié)構(gòu)核酸 核酸是生物體內(nèi)的高分子化合物，包括脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）兩大類。一、元素組成 組成核酸的元素有C、H、O、N、P等，與蛋白質(zhì)比較，其組成上有兩個特點(diǎn)：一是核酸一般不含元素S，二是核酸中P元素的含量較多并且恒定，約占9-10%。因此，核酸定量測定的經(jīng)典方法，是以測定P含量來代表核酸量。二、化學(xué)組成與基本單位 核酸經(jīng)水解可得到很多核苷酸，因此核苷酸是核酸的基本單位。核酸就是由很多單核苷酸聚合形成的多聚核苷酸。核苷酸可被水解產(chǎn)生核苷和磷酸，核苷還可再進(jìn)一步水解，產(chǎn)生戊糖和含氮堿基。核糖核酸（RNA）：細(xì)胞質(zhì)，參與蛋白質(zhì)的生物合成

mRNA（信使RNA），5%，Pr合成的直接模板

tRNA

（轉(zhuǎn)運(yùn)RNA），15%，活化與轉(zhuǎn)運(yùn)AA

rRNA

（核糖體RNA），80%，充當(dāng)裝配機(jī)，提供場所。脫氧核糖核酸（DNA）：核內(nèi)染色質(zhì)，遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)

基因

—DNA分子中的

功能片段

（決定遺傳特性）（特定的堿基序列）

核酸的分類、分布與功能核酸脫氧核糖核酸（DNA）核糖核酸（RNA）tRNAmRNArRNA蛋白質(zhì)合成核酸的分類兩類核酸的分子組成RNADNA組分磷酸磷酸戊糖核糖脫氧核糖堿基嘌呤嘧啶AGUCTDNA的水解產(chǎn)物中有堿基、磷酸、脫氧核糖、核苷、核苷酸等，因而推測DNA的骨架結(jié)構(gòu)為DNA的骨架結(jié)構(gòu)RNA分子與DNA分子的區(qū)別只在一個羥基，TvsU，但就這點(diǎn)區(qū)別，RNA分子的化學(xué)性質(zhì)比DNA活潑得多。RNA的骨架結(jié)構(gòu)嘌呤腺嘌呤（A）（6-氨基嘌呤）鳥嘌呤（G）（2-氨基-6-氧嘌呤）Purines嘧啶環(huán)+咪唑環(huán)許多生物堿是嘌呤的衍生物：

尿酸uricacid：2,6,8-三羥嘌呤，嘌呤代謝產(chǎn)物黃嘌呤xanthine：2,6-二羥嘌呤，嘌呤代謝產(chǎn)物次黃嘌呤hypoxanthine：6-羥基嘌呤，嘌呤代謝產(chǎn)物茶葉堿theophylline：1,3-二甲基黃嘌呤可可堿theobromine：3,7-二甲基黃嘌吟咖啡堿（咖啡因）caffeine：1,3,7-三甲基黃嘌呤玉米素zeatin：N6-異戊烯腺嘌呤激動素kinetin：N6-呋喃甲基腺嘌呤Pyrimidines嘧啶胞嘧啶（C）（2-氧4-氨基嘧啶）尿嘧啶（U）（2，4-二氧嘧啶）胸腺嘧啶（T）（5-甲基尿嘧啶）

胞嘧啶中

尿嘧啶及胸腺嘧啶中能發(fā)生酮式/烯醇式、氨式/亞氨式互變嘌呤和嘧啶堿基都具有弱堿性-主要是環(huán)內(nèi)氨基的貢獻(xiàn)鳥嘌呤和次黃嘌呤中質(zhì)子則結(jié)合到N7上核苷和核苷酸NucleosidesandNucleotides核苷=堿基+戊糖（nucleoside,Ns)糖苷鍵，嘌呤環(huán)上的N-9或嘧啶環(huán)上的N-1與糖的C-1’以N-C糖苷鍵相連。腺嘌呤核苷（腺苷）胞嘧啶脫氧核苷（脫氧胞苷）核苷酸=核苷+磷酸（nucleotide,Nt)連接方式：磷酸酯鍵，糖環(huán)上所有游離羥基（核糖的C-2、C-3、C-5及脫氧核糖的C-3、C-5）均能與磷酸發(fā)生酯化結(jié)合。生物體內(nèi)多數(shù)核苷酸是5-核苷酸，即糖環(huán)上的C-5與磷酸酯化。腺嘌呤核苷酸（腺苷酸）脫氧胞嘧啶核苷酸（脫氧胞苷酸）名稱與縮寫(1)RNA：ribonucleic

acid核糖核酸DNA：deoxyribonucleic

acid脫氧核糖核酸pyrimidine：cytosine(Cyt)胞嘧啶

嘧啶thymine(Thy)胸腺嘧啶

uracil(Ura)尿嘧啶purine：adenine(Ade)腺嘌呤

嘌呤

guanine(Gua)鳥嘌呤

名稱與縮寫(2)Ribonucleoside(Ns)核糖核苷（不帶磷酸）adenosine(Ado)腺(嘌呤核)苷guanosine(Guo)鳥(嘌呤核)苷cytidine(Cyd)胞(嘧啶核)苷

thymidine(Thd)胸(腺嘧啶脫氧核)苷uridine(Urd)尿(嘧啶核)苷Ribonucleotide(Nt)核糖核苷酸（帶磷酸）adenosine5’-mono(di,tri)phosphaste；

AMP,ADP,ATPdeoxyribonucleoside脫氧核糖核苷（不帶磷酸）deoxyadenosine(dAdo)……deoxyribonucleotide脫氧核糖核苷酸（帶磷酸）

dAMP,dADP,dATP……dNTPDNA中的四種堿基及它們間的氫鍵胞嘧啶胸腺嘧啶鳥嘌呤腺嘌呤TCAG－CH3Ura與DNA分子中的Thy的區(qū)別RNA分子中的四個堿基核苷的解離戊糖可增強(qiáng)堿基的酸性解離核糖中的羥基也可發(fā)生解離核苷酸的解離磷酸基使核苷酸具有很強(qiáng)的酸性DNA等電點(diǎn)為4-4.5RNA等電點(diǎn)為2-2.5堿基、核苷、核苷酸的ｐＫ值堿基

adenine4.15,9.8cytosine4.5,12.2guanine3.2,9.6thymine9.9,>13核苷

adenosine3.5,12.5deoxyadenosine3.8cytidine4.15,12.5deoxycytidine4.3,>13guanosine1.6,9.2deoxyguanosine2.5uridine9.2,12.5deoxythymidine9.8,>13核苷酸AMP3.7,6.1:dAMP4.4ADP3.9,6.3:---------CMP4.5,6.3:dCMP4.6GMP2.4,6.1,9.4:dGMP2.9,9.7UMP6.4,9.5:dTMP10.0核酸的紫外吸收堿基中含有共軛雙鍵最大吸收峰260nm左右核酸溶液紫外吸收以摩爾磷的吸光度表示，摩爾磷即相當(dāng)于摩爾核苷酸。ε：摩爾吸光系數(shù)A：吸收值W：每升溶液磷重量L：比色杯內(nèi)徑OD260的應(yīng)用：1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0含雜蛋白及苯酚，降低3.判斷DNA是否變性 由于共振作用，所有核苷酸的堿基都吸收紫外光，核酸在260nm附近有強(qiáng)大光吸收。修飾堿基（核苷）AllofthefourbasesintRNAcanbemodified與氨基酸一樣，堿基在細(xì)胞中也受到各種各樣的修飾，其產(chǎn)物常常扮演信號傳導(dǎo)信使分子、營養(yǎng)因子、輔酶等角色，并對核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起著重要作用胸腺嘧啶核糖核苷二氫尿苷假尿苷4-硫尿苷3-甲基胞苷C5次黃苷，肌苷喹啉（Q 核苷）7-甲基鳥苷W(Y）核苷體內(nèi)一些重要核苷酸能量物質(zhì)：ATP、GTP、UTP、CTP等；酶輔助因子：NAD+、NADP+和FAD等；信號傳導(dǎo)：環(huán)腺苷酸（cAMP），環(huán)鳥苷酸（cGMP）;重要代謝中間物：PAPS（3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸）、SAM（S-腺苷甲硫氨酸）、UDPG（鳥苷二磷酸葡萄糖）、UDPGA（鳥苷二磷酸葡萄糖醛酸）、CDP-膽堿（乙醇胺）等AMPADPATP3,5-cAMP核酸的物理性質(zhì)I1、性狀：RNA及其組分核苷酸、核苷、嘌呤堿、嘧啶堿的純品都呈白色的粉末或結(jié)晶；DNA則為疏松的石棉一樣的纖維狀固體。2、粘性：核酸的水溶液粘度很大，DNA溶液的粘度大于RNA。核酸變性后，粘度下降。核酸的物理性質(zhì)II3、溶解性：RNA和DNA都是極性化合物，一般都微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑。它們的鈉鹽易溶于水。細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA都與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白。DNA核蛋白與RNA核蛋白的溶解度受溶液的鹽濃度的影響而不同。DNA核蛋白在低濃度的鹽溶液中隨鹽濃度的增加而增加，在1mol/LNaCl溶液中的溶解度比純水的高2倍，在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，僅為水的1%，幾乎不溶解；而RNA核蛋白在鹽溶液中其溶解度受鹽濃度的影響較小，在0.14mol/L的NaCl中溶解度較大。因此，在核酸的提取中，常依此將兩種核蛋白分開，然后用蛋白質(zhì)變性劑去除蛋白質(zhì)。酸或堿水解核酸的水解RNA的堿水解 DNA和RNA的共價主鏈可以被非酶條件緩慢水解磷酸二酯鍵，試管中RNA可被堿性條件迅速水解，而DNA則不。RNA的C-2’羥基直接參與了水解過程，2’,3’-單磷酸是堿對RNA作用的第一個產(chǎn)物，后者進(jìn)一步迅速被水解生成2’-及3’-核苷單磷酸。堿性條件下RNA的水解RNase酶水解水解酶兩種酶水解方式及產(chǎn)物a形式及b形式的兩種磷酸二酯酶外切核酸酶-逐個水解胰核糖核酸酶（RNase）：內(nèi)切酶，以b方式水解，產(chǎn)物為以3’-嘧啶核苷酸結(jié)尾的寡核苷酸(Palindrome)粘性末端末端為含未配對堿基，能與具有互補(bǔ)堿基的目的基因片段的DNA連結(jié)，故稱為粘性末端。這種酶在基因工程中應(yīng)用最多。平頭末端在兩條鏈的特定序列的相同部位切割，形成一個無粘性末端的平口.雙螺旋結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)Watson,CrickandtheirdoublehelixmodelJamesDeweyWatson,1928-FrancisHarryComptonCrick,1916-

1953年2月28日，他們發(fā)現(xiàn)了DNA雙螺旋Braggs,Wilkins,Franklinand#51photoMauriceHughFrederickWilkins,1916-RosalindFranklin(1920-1958)SirJohnRandall第51號照片，攝于1952年底A型DNAB型DNA核酸中核苷酸以磷酸二酯鍵共價連接，一個核苷酸的5’磷酸羥基與另一個核苷酸的3’核糖羥基形成磷酸二酯鍵。核酸的共價主鏈由磷酸及戊糖殘基構(gòu)成，含氮堿基可以看成是連接到主鏈上固定間隔的側(cè)鏈基團(tuán)。DNA和RNA的骨架結(jié)構(gòu)是親水的，糖殘基的羥基與水形成氫鍵，磷酸基團(tuán)的pKa接近于零，pH7時完全離子化并帶負(fù)電，所帶負(fù)電荷通常與帶正電的蛋白質(zhì)、金屬離子及多胺發(fā)生離子作用被中和。pA-C-G-T-AOHpApCpGpTpApACGTAWatson和Crick定義的核酸中堿基對的氫鍵模式DNA中的四種堿基及它們間的氫鍵胞嘧啶胸腺嘧啶鳥嘌呤腺嘌呤TCAG堿基間的氫鍵可以有不同形式Watson-CrickHoogsteen堿基配對時堿基一般以酮式存在，而不是醇烯式；堿基中的H原子一般不移動，因此很少有亞氨基團(tuán)；在中性pH條件下，參與氫鍵的-NH2基均不帶電荷，這是雜環(huán)電子共