豬冷凍精液用的關鍵技術課件

豬冷凍精液用的關鍵技術課件豬冷凍精液用的關鍵技術課件目錄一、豬冷凍精液的研究意義

二、使用豬冷凍精液的現狀

三、冷凍稀釋液配方技術

四、冷凍解凍程序技術

五、深部輸精技術

目錄一、豬冷凍精液的研究意義

二、使用豬冷凍精液的一、豬冷凍精液的研究意義一、豬冷凍精液的研究意義延長豬精液的保存期限

常溫液態(tài)保存精液：2～3天、5～7天、10～15天冷凍保存精液：原則上可長期保存降低引種及飼養(yǎng)管理成本

2014年能繁母豬4500萬頭2.2窩/年受胎率80%常溫液態(tài)精液：配種800頭次約12萬頭種公豬冷凍精液：配種4600頭次約2.1萬頭種公豬減少公豬飼養(yǎng)量：約82%一、豬冷凍精液的研究意義一、豬冷凍精液的研究意義一、豬冷凍精液的研究意義延長豬精液的降低引種及飼養(yǎng)管理成本

以飼養(yǎng)100頭種公豬的豬場為例：（1）1頭公豬的引種費用6000元，使用冷凍精液可少引種82頭公豬，引種費用可節(jié)省82頭×6000元=492000元。（2）每頭每天豬飼養(yǎng)費用10元，82頭一天可節(jié)省82頭×10元=820元，每年可節(jié)省820×365天=299300元。（3）人工費用（飼喂+采精費用）：按2人計算，每天每人100元，一年2人可節(jié)省100元×2人×365天=73000元。（4）疾病費用方面，每頭豬藥費成本每年100元，82頭豬可節(jié)省藥費82頭×100元=8200元。以上這些直接節(jié)省的費用（即豬場的純利）可達872500元。一、豬冷凍精液的研究意義降低引種及飼養(yǎng)管理成本一、豬冷凍精液的研究意義提高優(yōu)秀種公豬的利用率

常溫液態(tài)保存精液：可稀釋成鮮精25-30瓶，可配13-15頭母豬冷凍精液：可制成凍精大約400-500支，可配60-80頭左右母豬（深部輸精）凍精利用率比鮮精至少高5倍使高性能種公豬與更多數量的母豬配種，大大提高了優(yōu)質基因的覆蓋面促進品種改良，提高生產性能

冷凍精液便于儲存、便于運輸、便于使用，不受地域、時間的限制，便于跨區(qū)域、跨國引入優(yōu)秀的種質資源，輻射區(qū)域可全球化，打破了鮮精使用區(qū)域輻射小的限制。有利于品種的改良，提高生產性能。一、豬冷凍精液的研究意義提高優(yōu)秀種公豬的利用率一、豬冷凍精液的研究意義為生物安全提供保障公豬冷凍精液可以在后裔測定或疾病檢測后再開始大量供應，為穩(wěn)定的遺傳進展和嚴格的生物安全提供保障。從健康角度考慮，凍精為疾病檢測提供了足夠的時間，凍精還能為大型的人工授精站暴發(fā)疾病時提供穩(wěn)定的精液供應保障，并可實現無抗供種。為了確保全球的生物安全，豬精液成功的冷凍保存對國際市場是必需的。并且全球養(yǎng)豬業(yè)最感興趣的就是商業(yè)上可行的豬精液冷凍保存技術的成功開發(fā)。瀕臨絕種的品種保種工作其他

冷凍精液+體外受精→體外胚胎生產體系，現代生物工程技術，如細胞核移植、胚胎早期性別鑒定、基因轉移提供豐富的實驗材料和基本技術保證一、豬冷凍精液的研究意義為生物安全提供保障一、豬冷凍精液的研究意義二、豬冷凍精液的研究現狀世界各國都在進行冷凍精液技術的開發(fā)

1956年，Ploge開始研究豬精液冷凍保存技術1970年，Ploge首次報道，得到凍精生產的小豬1971年，3個研究小組用干冰制作顆粒凍精

1975年，Pursel和westendorf分別以粒狀和細管冷凍方法，成功冷凍保存公豬精液在1977～1979年，美國、瑞士、法國、匈亞利、西班牙利用凍精配種母豬達800～1000頭,英國、澳大利亞用凍精配種母豬50～200頭二、豬冷凍精液的研究現狀世界各國都在進行冷凍精液技術的開發(fā)二、豬冷凍精液的研究現狀我國從50年代初期開始對豬精液冷凍技術進行探索

1975年西安市草灘農場試配了8頭母豬，有4頭產仔,平均每窩8.9頭。此后,廣東、北京、上海、吉林、四川等省市也都相繼研究成功。1977年成立了全國豬凍精協作組。據統(tǒng)計,1975～1978年全國利用豬凍精進行人工授精,累計配種母豬6079頭,情期受胎率為42.1%～61.3%。據廣西、北京、四川、黑龍江等6省市的統(tǒng)計數字表明,1986年冷凍精液累計配種母豬6萬余頭,第一情期受胎率達70%以上。二、豬冷凍精液的研究現狀我國從50年代初期開始對豬精液冷凍技二、豬冷凍精液的研究現狀近幾年科研單位：中國農業(yè)大學、朱士恩教授、吉林大學周虛教授、西北農林科技大學李青旺教授、東北農業(yè)大學劉娣教授、上海農科院張德福研究員、吉林省農業(yè)科學院李兆華研究員企業(yè)：百鈞達科技發(fā)展（北京）有限公司、溫氏集團、二、豬冷凍精液的研究現狀近幾年二、豬冷凍精液的研究現狀特別是

百鈞達科技發(fā)展（北京）有限公司進兩年來在豬冷凍精液保存技術研發(fā)取得突破性進展。解凍后豬精子的活力使用只能容下單層精子活動空間的專用精子計數板在顯微鏡同一焦距視野下，活力已經達到80%以上。38℃條件下可存活5～6小時。通過對近一年的冷配母豬進行統(tǒng)計，發(fā)情正常健康的母豬情期受胎率胎率達88.5%，平均產仔數11.2頭（百鈞達公司提供）。已經達到常溫液態(tài)精液的繁育水平。

二、豬冷凍精液的研究現狀特別是

14年9月英國養(yǎng)豬協會出口負責人克瑞斯.杰克遜先生來訪百鈞達公司，參觀豬凍精項目技術成果并給予高度肯定。14年9月英國養(yǎng)豬協會出口負責人克瑞斯.杰克14年9月省農業(yè)廳張鈺副廳長蒞臨百鈞達公司指導豬冷凍精液技術項目，并給予后備支持14年9月省農業(yè)廳張鈺副廳長蒞臨百鈞達公司指導豬冷凍精液技術14年11月河北省生豬產業(yè)體系首席專家張杰英所長、河北省畜牧站苗玉濤處長來百鈞達公司考察豬凍精項目技術成果14年11月河北省生豬產業(yè)體系首席專家張杰英14年種豬網董事長、國家《豬常溫精液生產與保存技術規(guī)范》制定者——孫德林教授，多次來百鈞達公司實地考察豬精液的冷凍技術及準胎成果，給予商品豬凍精技術為豬人工授精的第二次革命！14年種豬網董事長、國家《豬常溫精液生產與保存技術規(guī)范》制定14年12月豬病研究專家、華中農業(yè)大學倪德斌教授來百鈞達公司考察豬冷凍精液技術成果并給予高度的肯定

14年12月豬病研究專家、華中農業(yè)大學倪德斌教授來百鈞達公司15年1月農業(yè)部畜牧總站資源保護中心、國家種畜禽質量監(jiān)督檢驗測試中心劉丑生主任、趙俊金主任、朱芳賢總工程師來百鈞達公司考察豬凍精項目技術15年1月農業(yè)部畜牧總站資源保護中心、國家種畜禽質量監(jiān)督檢驗15年3月亞盛投資公司總裁、家育種豬集團創(chuàng)始人毛區(qū)健麗女士來訪百鈞達公司，參觀豬冷凍精液項目技術成果，并與公司達成友好合作協議15年3月亞盛投資公司總裁、家育種豬集團創(chuàng)始人毛區(qū)健麗女士來15年4月美國mofa公司亞洲市場部主任、基礎科技部主任吳衛(wèi)東博士來百鈞達公司考察豬凍精項目技術，給予“酷似鮮精”的好評！15年4月美國mofa公司亞洲市場部主任、基礎15年5月加拿大加裕集團亞太區(qū)商務總監(jiān)林瑞先生來百鈞達公司參觀豬凍精項目技術15年5月加拿大加裕集團亞太區(qū)商務總監(jiān)林瑞先生稀釋液組成的分類1、營養(yǎng)劑如葡萄糖、果糖等

精子在保存過程中不停地進行著新陳代謝作用，為了補充精子的能量消耗，向精液中添加的能量物質。2、抗冷凍保護劑如甘油、DMSO、白蛋白等

保護精子在冷凍解凍過程中因溫度變化造成的損傷，包括滲透性冷凍保護劑和非滲透性冷凍保護劑。3、其他保護劑如各種抗氧化成分和抗生素等

保護精子不受各種不良環(huán)境因素的危害而添加的物質，包括緩沖物質、抗氧化物質和抑菌物質。4、其他添加劑如滲透壓、酸堿平衡調節(jié)物質

改善精子所處環(huán)境的理化特性，以及提高精子存活率和受精能力。三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)稀釋液組成的分類三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)抗冷凍保護劑的研究1、分類：滲透性冷凍保護劑、非滲透性冷凍保護劑2、原理：1）滲透性冷凍保護劑：在溶液中易結合水分子，發(fā)生水合作用。在細胞冷凍液完全凝固之前，滲透到細胞內，降低細胞內外結冰溶液中電解質的濃度，從而保護細胞免受高濃度電解質的損傷，同時細胞內水分也不會過分外滲，避免了細胞過分脫水。2）非滲透性冷凍保護劑：能溶于水，但不能進入細胞，因此能夠提高細胞外滲透壓，在冷凍過程中使細胞內的水分向細胞外滲出，引起細胞脫水而皺縮，減少細胞內冰晶的形成，從而保護細胞免受破壞。

三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)抗冷凍保護劑的研究三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)抗冷凍保護劑的研究3、常用滲透性冷凍保護劑甘油、二甲基亞砜(DMSO)、乙二醇（EG）、丙二醇（PROH）、二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基乙酰胺（DMA）、木糖醇、阿東糖醇等。4、常用非滲透性冷凍保護劑蔗糖、海藻糖、聚蔗糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚已二醇(PEG)、白蛋白等

三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)抗冷凍保護劑的研究三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)抗冷凍保護劑的研究

5、冷凍保護劑的應用研究1）甘油３％是最常用的濃度標準2）各種冷凍保護劑中，以EG和DMA.混合作為冷凍保護劑效果最佳，解凍后精子活率最高，頂體異常率，尾部畸形率均較低（邰秀林，1998）。3）20mL/LDMF+10mL/L甘油混合冷凍保護劑比單一使用甘油或DMF能起到更好的冷凍保護作用（張樹山，2009）。4）DMA可以代替甘油作為滲透性保護劑,且以1%DMA、50℃解凍最佳（郭堂玉，2010）。5）甘油、DMSO、乙二醇3種抗凍劑作為豬凍精的保護劑,結果表明，甘油作為抗凍劑時精子凍后活率最高，效果最好（李青旺，2003）三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)抗冷凍保護劑的研究三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)抗冷凍保護劑的研究

6、冷凍保護劑應用研究的方向1）甘油與其它冷凍保護劑聯合應用。2）是從稀釋液中除去甘油。

糖類和一些氨基酸被視為將來有效的冷凍保護劑。糖類如棉子糖、乳糖、及像PVP這樣的多聚體和親脂親水性的物質：谷氨酸鹽、脯氨酸等被視為潛在的冷凍保護劑。三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)抗冷凍保護劑的研究三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)其它保護劑的研究

1、抗氧化劑研究1）精子的氧化損傷是ROS產生和清除活動不平衡的結果正常情況下，精液中清除ROS依賴于精漿(SP)的抗氧化物質，但在精液冷凍保存過程中，一方面精液離心使精子失去了SP抗氧化劑的保護作用，導致精子處于易受氧化攻擊的條件下；另一方面冷凍過程又能誘導精子產生ROS。其中有缺陷和死精子是冷凍期間ROS的主要來源。因此，冷凍很容易造成豬精子質膜過氧化損傷，從而降低冷凍精液的質量。2）常用的抗氧化添加劑甲基黃嘌呤類、丁羥甲苯、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和過氧化物酶、褪黑素或維生素E及其類似物等。三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)其它保護劑的研究三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)其它保護劑的研究

1、抗氧化劑研究3）抗氧化劑的應用研究（1）單獨或聯合添加褪黑素、谷胱甘肽，均能減少精液冷凍過程中ROS的生成，顯著提高冷凍精子解凍后的質量，其中聯合添加效果顯著優(yōu)于單獨添加效果（李博玲，2011）。（2）在豬精液的冷凍稀釋液中添加丁羥基甲苯（BHT）能夠有效抑制精子質膜過氧化反應（Roca等，2004）。（3）在冷凍稀釋液中添加谷胱甘肽，可以提高解凍精液的精子活力和活率，降低膜蛋白巰基基團改變的精子數（Gadea等，2004）（4）Roca等（2005）證實,超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（CAT）可降低解凍后豬精液中ROS含量,單獨或混合添加SOD和CAT顯著提高了解凍后的精子活率。三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)其它保護劑的研究三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)其它保護劑的研究

2、其它保護劑的研究1）環(huán)糊精(HBCD)：在豬精液冷凍稀釋劑BF5中添加HBCD,可提高精子頂體和質膜的完整性,并且精子活力也隨著HBCD濃度的增加而顯著提高。2）透明質酸(HA)：精液冷凍稀釋液中添加HA也能顯著改善解凍后豬精子的運動學參數,并在保持質膜穩(wěn)定性方面發(fā)揮作用。

3）受精促進肽(FPP)：在提高豬冷凍精液的精子體外受精能力和糖苷酶活性等方面的作用也日益受到關注4）中藥提取物：應用川穹嗪（四甲基吡嗪）不僅可以顯著降低凍后豬精子的畸形率，而且可以明顯提高凍后豬精子的頂體完整率。另外，隨著川穹嗪濃度的上升，凍后精子的質量有逐步改善的趨勢。三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)其它保護劑的研究三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)承載工具1、顆粒：約0.1ml2、細管：0.25、0.5ml小型細管和扁平管；5ml大型細管3、5ml扁平塑料袋冷凍解凍程序1、顆粒精液的冷凍程序

1）新鮮精液在常溫下，用不含甘油的I液稀釋，然后平衡0.5～2小時2）緩慢降溫至15℃維持4小時，再從15℃經1小時降至5℃3）用等溫含甘油的II液進行稀釋，然后用液氮熏蒸法制作凍精顆粒高度：1～2cm，滴凍時間：60秒以內，平衡3～4分鐘。四、冷凍解凍技術的研發(fā)承載工具四、冷凍解凍技術的研發(fā)冷凍解凍程序2、細管和塑料袋的冷凍程序

1）新鮮精液在常溫下，用不含甘油的I液稀釋，然后平衡0.5～2小時2）緩慢降溫至15℃維持3小時，然后離心（800g，10min），加入無甘油的I液，緩慢降到5℃，平衡2小時，加入含甘油的II液，然后分裝。3）程序冷凍儀冷凍：

初始溫度為5℃，以3℃/min降到-5℃，保持1min，然后以50℃/min降到-140℃，然后投入液氮保存。4）液氮熏蒸冷凍：

高度5cm，時間20分鐘。四、冷凍解凍技術的研發(fā)冷凍解凍程序四、冷凍解凍技術的研發(fā)深部輸精技術的分類

1、輸卵管輸精法（IOI）主要指腹腔內窺鏡人工授精技術，即利用腹腔內窺鏡裝置，通過微創(chuàng)手術，將精液直接輸入到子宮與輸卵管的連接部。是一種創(chuàng)傷較小的手術，但是，腹腔內窺鏡相對于其它的人工授精器械較為復雜，成本也較高，需要較高的專業(yè)水平和極為熟練的技術操作，可以應用于要求較高的科研試驗。

五、深部輸精技術的應用深部輸精技術的分類五、深部輸精技術的應用深部輸精技術的分類

2、子宮角輸精法

又稱子宮深部輸精法（DUI）。子宮深部輸精的輸精管是將改良的柔韌纖維內窺鏡管內置于常規(guī)的輸精管而制成，這種DUI輸精內管管長1.8m，外周直徑4mm，內圈直徑1.8mm。使用時先將商用常規(guī)輸精管插入子宮頸形成子宮鎖后，再在管內插入DUI輸精內管，內管穿過子宮頸，能夠順著子宮腔前進，可將精子輸送至子宮角近端1/3處。不僅節(jié)省精子量，還能夠提高一些“脆弱”精子的使用效率，比如冷凍-解凍精子、性控分離精子