豬冷凍精液用的關(guān)鍵技術(shù)課件

豬冷凍精液用的關(guān)鍵技術(shù)課件豬冷凍精液用的關(guān)鍵技術(shù)課件目錄一、豬冷凍精液的研究意義

二、使用豬冷凍精液的現(xiàn)狀

三、冷凍稀釋液配方技術(shù)

四、冷凍解凍程序技術(shù)

五、深部輸精技術(shù)

目錄一、豬冷凍精液的研究意義

二、使用豬冷凍精液的一、豬冷凍精液的研究意義一、豬冷凍精液的研究意義延長豬精液的保存期限

常溫液態(tài)保存精液：2～3天、5～7天、10～15天冷凍保存精液：原則上可長期保存降低引種及飼養(yǎng)管理成本

2014年能繁母豬4500萬頭2.2窩/年受胎率80%常溫液態(tài)精液：配種800頭次約12萬頭種公豬冷凍精液：配種4600頭次約2.1萬頭種公豬減少公豬飼養(yǎng)量：約82%一、豬冷凍精液的研究意義一、豬冷凍精液的研究意義一、豬冷凍精液的研究意義延長豬精液的降低引種及飼養(yǎng)管理成本

以飼養(yǎng)100頭種公豬的豬場為例：（1）1頭公豬的引種費(fèi)用6000元，使用冷凍精液可少引種82頭公豬，引種費(fèi)用可節(jié)省82頭×6000元=492000元。（2）每頭每天豬飼養(yǎng)費(fèi)用10元，82頭一天可節(jié)省82頭×10元=820元，每年可節(jié)省820×365天=299300元。（3）人工費(fèi)用（飼喂+采精費(fèi)用）：按2人計(jì)算，每天每人100元，一年2人可節(jié)省100元×2人×365天=73000元。（4）疾病費(fèi)用方面，每頭豬藥費(fèi)成本每年100元，82頭豬可節(jié)省藥費(fèi)82頭×100元=8200元。以上這些直接節(jié)省的費(fèi)用（即豬場的純利）可達(dá)872500元。一、豬冷凍精液的研究意義降低引種及飼養(yǎng)管理成本一、豬冷凍精液的研究意義提高優(yōu)秀種公豬的利用率

常溫液態(tài)保存精液：可稀釋成鮮精25-30瓶，可配13-15頭母豬冷凍精液：可制成凍精大約400-500支，可配60-80頭左右母豬（深部輸精）凍精利用率比鮮精至少高5倍使高性能種公豬與更多數(shù)量的母豬配種，大大提高了優(yōu)質(zhì)基因的覆蓋面促進(jìn)品種改良，提高生產(chǎn)性能

冷凍精液便于儲(chǔ)存、便于運(yùn)輸、便于使用，不受地域、時(shí)間的限制，便于跨區(qū)域、跨國引入優(yōu)秀的種質(zhì)資源，輻射區(qū)域可全球化，打破了鮮精使用區(qū)域輻射小的限制。有利于品種的改良，提高生產(chǎn)性能。一、豬冷凍精液的研究意義提高優(yōu)秀種公豬的利用率一、豬冷凍精液的研究意義為生物安全提供保障公豬冷凍精液可以在后裔測定或疾病檢測后再開始大量供應(yīng)，為穩(wěn)定的遺傳進(jìn)展和嚴(yán)格的生物安全提供保障。從健康角度考慮，凍精為疾病檢測提供了足夠的時(shí)間，凍精還能為大型的人工授精站暴發(fā)疾病時(shí)提供穩(wěn)定的精液供應(yīng)保障，并可實(shí)現(xiàn)無抗供種。為了確保全球的生物安全，豬精液成功的冷凍保存對國際市場是必需的。并且全球養(yǎng)豬業(yè)最感興趣的就是商業(yè)上可行的豬精液冷凍保存技術(shù)的成功開發(fā)。瀕臨絕種的品種保種工作其他

冷凍精液+體外受精→體外胚胎生產(chǎn)體系，現(xiàn)代生物工程技術(shù)，如細(xì)胞核移植、胚胎早期性別鑒定、基因轉(zhuǎn)移提供豐富的實(shí)驗(yàn)材料和基本技術(shù)保證一、豬冷凍精液的研究意義為生物安全提供保障一、豬冷凍精液的研究意義二、豬冷凍精液的研究現(xiàn)狀世界各國都在進(jìn)行冷凍精液技術(shù)的開發(fā)

1956年，Ploge開始研究豬精液冷凍保存技術(shù)1970年，Ploge首次報(bào)道，得到凍精生產(chǎn)的小豬1971年，3個(gè)研究小組用干冰制作顆粒凍精

1975年，Pursel和westendorf分別以粒狀和細(xì)管冷凍方法，成功冷凍保存公豬精液在1977～1979年，美國、瑞士、法國、匈亞利、西班牙利用凍精配種母豬達(dá)800～1000頭,英國、澳大利亞用凍精配種母豬50～200頭二、豬冷凍精液的研究現(xiàn)狀世界各國都在進(jìn)行冷凍精液技術(shù)的開發(fā)二、豬冷凍精液的研究現(xiàn)狀我國從50年代初期開始對豬精液冷凍技術(shù)進(jìn)行探索

1975年西安市草灘農(nóng)場試配了8頭母豬，有4頭產(chǎn)仔,平均每窩8.9頭。此后,廣東、北京、上海、吉林、四川等省市也都相繼研究成功。1977年成立了全國豬凍精協(xié)作組。據(jù)統(tǒng)計(jì),1975～1978年全國利用豬凍精進(jìn)行人工授精,累計(jì)配種母豬6079頭,情期受胎率為42.1%～61.3%。據(jù)廣西、北京、四川、黑龍江等6省市的統(tǒng)計(jì)數(shù)字表明,1986年冷凍精液累計(jì)配種母豬6萬余頭,第一情期受胎率達(dá)70%以上。二、豬冷凍精液的研究現(xiàn)狀我國從50年代初期開始對豬精液冷凍技二、豬冷凍精液的研究現(xiàn)狀近幾年科研單位：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、朱士恩教授、吉林大學(xué)周虛教授、西北農(nóng)林科技大學(xué)李青旺教授、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)劉娣教授、上海農(nóng)科院張德福研究員、吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院李兆華研究員企業(yè)：百鈞達(dá)科技發(fā)展（北京）有限公司、溫氏集團(tuán)、二、豬冷凍精液的研究現(xiàn)狀近幾年二、豬冷凍精液的研究現(xiàn)狀特別是

百鈞達(dá)科技發(fā)展（北京）有限公司進(jìn)兩年來在豬冷凍精液保存技術(shù)研發(fā)取得突破性進(jìn)展。解凍后豬精子的活力使用只能容下單層精子活動(dòng)空間的專用精子計(jì)數(shù)板在顯微鏡同一焦距視野下，活力已經(jīng)達(dá)到80%以上。38℃條件下可存活5～6小時(shí)。通過對近一年的冷配母豬進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)情正常健康的母豬情期受胎率胎率達(dá)88.5%，平均產(chǎn)仔數(shù)11.2頭（百鈞達(dá)公司提供）。已經(jīng)達(dá)到常溫液態(tài)精液的繁育水平。

二、豬冷凍精液的研究現(xiàn)狀特別是

14年9月英國養(yǎng)豬協(xié)會(huì)出口負(fù)責(zé)人克瑞斯.杰克遜先生來訪百鈞達(dá)公司，參觀豬凍精項(xiàng)目技術(shù)成果并給予高度肯定。14年9月英國養(yǎng)豬協(xié)會(huì)出口負(fù)責(zé)人克瑞斯.杰克14年9月省農(nóng)業(yè)廳張鈺副廳長蒞臨百鈞達(dá)公司指導(dǎo)豬冷凍精液技術(shù)項(xiàng)目，并給予后備支持14年9月省農(nóng)業(yè)廳張鈺副廳長蒞臨百鈞達(dá)公司指導(dǎo)豬冷凍精液技術(shù)14年11月河北省生豬產(chǎn)業(yè)體系首席專家張杰英所長、河北省畜牧站苗玉濤處長來百鈞達(dá)公司考察豬凍精項(xiàng)目技術(shù)成果14年11月河北省生豬產(chǎn)業(yè)體系首席專家張杰英14年種豬網(wǎng)董事長、國家《豬常溫精液生產(chǎn)與保存技術(shù)規(guī)范》制定者——孫德林教授，多次來百鈞達(dá)公司實(shí)地考察豬精液的冷凍技術(shù)及準(zhǔn)胎成果，給予商品豬凍精技術(shù)為豬人工授精的第二次革命！14年種豬網(wǎng)董事長、國家《豬常溫精液生產(chǎn)與保存技術(shù)規(guī)范》制定14年12月豬病研究專家、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)倪德斌教授來百鈞達(dá)公司考察豬冷凍精液技術(shù)成果并給予高度的肯定

14年12月豬病研究專家、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)倪德斌教授來百鈞達(dá)公司15年1月農(nóng)業(yè)部畜牧總站資源保護(hù)中心、國家種畜禽質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心劉丑生主任、趙俊金主任、朱芳賢總工程師來百鈞達(dá)公司考察豬凍精項(xiàng)目技術(shù)15年1月農(nóng)業(yè)部畜牧總站資源保護(hù)中心、國家種畜禽質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)15年3月亞盛投資公司總裁、家育種豬集團(tuán)創(chuàng)始人毛區(qū)健麗女士來訪百鈞達(dá)公司，參觀豬冷凍精液項(xiàng)目技術(shù)成果，并與公司達(dá)成友好合作協(xié)議15年3月亞盛投資公司總裁、家育種豬集團(tuán)創(chuàng)始人毛區(qū)健麗女士來15年4月美國mofa公司亞洲市場部主任、基礎(chǔ)科技部主任吳衛(wèi)東博士來百鈞達(dá)公司考察豬凍精項(xiàng)目技術(shù)，給予“酷似鮮精”的好評！15年4月美國mofa公司亞洲市場部主任、基礎(chǔ)15年5月加拿大加裕集團(tuán)亞太區(qū)商務(wù)總監(jiān)林瑞先生來百鈞達(dá)公司參觀豬凍精項(xiàng)目技術(shù)15年5月加拿大加裕集團(tuán)亞太區(qū)商務(wù)總監(jiān)林瑞先生稀釋液組成的分類1、營養(yǎng)劑如葡萄糖、果糖等

精子在保存過程中不停地進(jìn)行著新陳代謝作用，為了補(bǔ)充精子的能量消耗，向精液中添加的能量物質(zhì)。2、抗冷凍保護(hù)劑如甘油、DMSO、白蛋白等

保護(hù)精子在冷凍解凍過程中因溫度變化造成的損傷，包括滲透性冷凍保護(hù)劑和非滲透性冷凍保護(hù)劑。3、其他保護(hù)劑如各種抗氧化成分和抗生素等

保護(hù)精子不受各種不良環(huán)境因素的危害而添加的物質(zhì)，包括緩沖物質(zhì)、抗氧化物質(zhì)和抑菌物質(zhì)。4、其他添加劑如滲透壓、酸堿平衡調(diào)節(jié)物質(zhì)

改善精子所處環(huán)境的理化特性，以及提高精子存活率和受精能力。三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)稀釋液組成的分類三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)抗冷凍保護(hù)劑的研究1、分類：滲透性冷凍保護(hù)劑、非滲透性冷凍保護(hù)劑2、原理：1）滲透性冷凍保護(hù)劑：在溶液中易結(jié)合水分子，發(fā)生水合作用。在細(xì)胞冷凍液完全凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，降低細(xì)胞內(nèi)外結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)水分也不會(huì)過分外滲，避免了細(xì)胞過分脫水。2）非滲透性冷凍保護(hù)劑：能溶于水，但不能進(jìn)入細(xì)胞，因此能夠提高細(xì)胞外滲透壓，在冷凍過程中使細(xì)胞內(nèi)的水分向細(xì)胞外滲出，引起細(xì)胞脫水而皺縮，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而保護(hù)細(xì)胞免受破壞。

三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)抗冷凍保護(hù)劑的研究三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)抗冷凍保護(hù)劑的研究3、常用滲透性冷凍保護(hù)劑甘油、二甲基亞砜(DMSO)、乙二醇（EG）、丙二醇（PROH）、二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基乙酰胺（DMA）、木糖醇、阿東糖醇等。4、常用非滲透性冷凍保護(hù)劑蔗糖、海藻糖、聚蔗糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚已二醇(PEG)、白蛋白等

三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)抗冷凍保護(hù)劑的研究三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)抗冷凍保護(hù)劑的研究

5、冷凍保護(hù)劑的應(yīng)用研究1）甘油３％是最常用的濃度標(biāo)準(zhǔn)2）各種冷凍保護(hù)劑中，以EG和DMA.混合作為冷凍保護(hù)劑效果最佳，解凍后精子活率最高，頂體異常率，尾部畸形率均較低（邰秀林，1998）。3）20mL/LDMF+10mL/L甘油混合冷凍保護(hù)劑比單一使用甘油或DMF能起到更好的冷凍保護(hù)作用（張樹山，2009）。4）DMA可以代替甘油作為滲透性保護(hù)劑,且以1%DMA、50℃解凍最佳（郭堂玉，2010）。5）甘油、DMSO、乙二醇3種抗凍劑作為豬凍精的保護(hù)劑,結(jié)果表明，甘油作為抗凍劑時(shí)精子凍后活率最高，效果最好（李青旺，2003）三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)抗冷凍保護(hù)劑的研究三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)抗冷凍保護(hù)劑的研究

6、冷凍保護(hù)劑應(yīng)用研究的方向1）甘油與其它冷凍保護(hù)劑聯(lián)合應(yīng)用。2）是從稀釋液中除去甘油。

糖類和一些氨基酸被視為將來有效的冷凍保護(hù)劑。糖類如棉子糖、乳糖、及像PVP這樣的多聚體和親脂親水性的物質(zhì)：谷氨酸鹽、脯氨酸等被視為潛在的冷凍保護(hù)劑。三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)抗冷凍保護(hù)劑的研究三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)其它保護(hù)劑的研究

1、抗氧化劑研究1）精子的氧化損傷是ROS產(chǎn)生和清除活動(dòng)不平衡的結(jié)果正常情況下，精液中清除ROS依賴于精漿(SP)的抗氧化物質(zhì)，但在精液冷凍保存過程中，一方面精液離心使精子失去了SP抗氧化劑的保護(hù)作用，導(dǎo)致精子處于易受氧化攻擊的條件下；另一方面冷凍過程又能誘導(dǎo)精子產(chǎn)生ROS。其中有缺陷和死精子是冷凍期間ROS的主要來源。因此，冷凍很容易造成豬精子質(zhì)膜過氧化損傷，從而降低冷凍精液的質(zhì)量。2）常用的抗氧化添加劑甲基黃嘌呤類、丁羥甲苯、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和過氧化物酶、褪黑素或維生素E及其類似物等。三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)其它保護(hù)劑的研究三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)其它保護(hù)劑的研究

1、抗氧化劑研究3）抗氧化劑的應(yīng)用研究（1）單獨(dú)或聯(lián)合添加褪黑素、谷胱甘肽，均能減少精液冷凍過程中ROS的生成，顯著提高冷凍精子解凍后的質(zhì)量，其中聯(lián)合添加效果顯著優(yōu)于單獨(dú)添加效果（李博玲，2011）。（2）在豬精液的冷凍稀釋液中添加丁羥基甲苯（BHT）能夠有效抑制精子質(zhì)膜過氧化反應(yīng)（Roca等，2004）。（3）在冷凍稀釋液中添加谷胱甘肽，可以提高解凍精液的精子活力和活率，降低膜蛋白巰基基團(tuán)改變的精子數(shù)（Gadea等，2004）（4）Roca等（2005）證實(shí),超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（CAT）可降低解凍后豬精液中ROS含量,單獨(dú)或混合添加SOD和CAT顯著提高了解凍后的精子活率。三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)其它保護(hù)劑的研究三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)其它保護(hù)劑的研究

2、其它保護(hù)劑的研究1）環(huán)糊精(HBCD)：在豬精液冷凍稀釋劑BF5中添加HBCD,可提高精子頂體和質(zhì)膜的完整性,并且精子活力也隨著HBCD濃度的增加而顯著提高。2）透明質(zhì)酸(HA)：精液冷凍稀釋液中添加HA也能顯著改善解凍后豬精子的運(yùn)動(dòng)學(xué)參數(shù),并在保持質(zhì)膜穩(wěn)定性方面發(fā)揮作用。

3）受精促進(jìn)肽(FPP)：在提高豬冷凍精液的精子體外受精能力和糖苷酶活性等方面的作用也日益受到關(guān)注4）中藥提取物：應(yīng)用川穹嗪（四甲基吡嗪）不僅可以顯著降低凍后豬精子的畸形率，而且可以明顯提高凍后豬精子的頂體完整率。另外，隨著川穹嗪濃度的上升，凍后精子的質(zhì)量有逐步改善的趨勢。三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)其它保護(hù)劑的研究三、冷凍稀釋液配方的研發(fā)承載工具1、顆粒：約0.1ml2、細(xì)管：0.25、0.5ml小型細(xì)管和扁平管；5ml大型細(xì)管3、5ml扁平塑料袋冷凍解凍程序1、顆粒精液的冷凍程序

1）新鮮精液在常溫下，用不含甘油的I液稀釋，然后平衡0.5～2小時(shí)2）緩慢降溫至15℃維持4小時(shí)，再從15℃經(jīng)1小時(shí)降至5℃3）用等溫含甘油的II液進(jìn)行稀釋，然后用液氮熏蒸法制作凍精顆粒高度：1～2cm，滴凍時(shí)間：60秒以內(nèi)，平衡3～4分鐘。四、冷凍解凍技術(shù)的研發(fā)承載工具四、冷凍解凍技術(shù)的研發(fā)冷凍解凍程序2、細(xì)管和塑料袋的冷凍程序

1）新鮮精液在常溫下，用不含甘油的I液稀釋，然后平衡0.5～2小時(shí)2）緩慢降溫至15℃維持3小時(shí)，然后離心（800g，10min），加入無甘油的I液，緩慢降到5℃，平衡2小時(shí)，加入含甘油的II液，然后分裝。3）程序冷凍儀冷凍：

初始溫度為5℃，以3℃/min降到-5℃，保持1min，然后以50℃/min降到-140℃，然后投入液氮保存。4）液氮熏蒸冷凍：

高度5cm，時(shí)間20分鐘。四、冷凍解凍技術(shù)的研發(fā)冷凍解凍程序四、冷凍解凍技術(shù)的研發(fā)深部輸精技術(shù)的分類

1、輸卵管輸精法（IOI）主要指腹腔內(nèi)窺鏡人工授精技術(shù)，即利用腹腔內(nèi)窺鏡裝置，通過微創(chuàng)手術(shù)，將精液直接輸入到子宮與輸卵管的連接部。是一種創(chuàng)傷較小的手術(shù)，但是，腹腔內(nèi)窺鏡相對于其它的人工授精器械較為復(fù)雜，成本也較高，需要較高的專業(yè)水平和極為熟練的技術(shù)操作，可以應(yīng)用于要求較高的科研試驗(yàn)。

五、深部輸精技術(shù)的應(yīng)用深部輸精技術(shù)的分類五、深部輸精技術(shù)的應(yīng)用深部輸精技術(shù)的分類

2、子宮角輸精法

又稱子宮深部輸精法（DUI）。子宮深部輸精的輸精管是將改良的柔韌纖維內(nèi)窺鏡管內(nèi)置于常規(guī)的輸精管而制成，這種DUI輸精內(nèi)管管長1.8m，外周直徑4mm，內(nèi)圈直徑1.8mm。使用時(shí)先將商用常規(guī)輸精管插入子宮頸形成子宮鎖后，再在管內(nèi)插入DUI輸精內(nèi)管，內(nèi)管穿過子宮頸，能夠順著子宮腔前進(jìn)，可將精子輸送至子宮角近端1/3處。不僅節(jié)省精子量，還能夠提高一些“脆弱”精子的使用效率，比如冷凍-解凍精子、性控分離精子