四肢動物肢體發(fā)育

1、關(guān)于四肢動物肢體的發(fā)育第1頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四脊椎動物肢體發(fā)生曾是胚胎學(xué)研究的經(jīng)典問題，從一定意義上講，它與整個胚胎的發(fā)育有許多可以類比的地方，例如，鳥翅的發(fā)生既有各部分組織結(jié)構(gòu)分化構(gòu)建的問題，也存在前后、背腹、左右對稱的問題。此外，在進(jìn)化上肢體也是多樣化發(fā)生十分突出的問題。第2頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四人上肢的結(jié)構(gòu)第3頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四反應(yīng)停導(dǎo)致的海豹畸形第4頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四畸形青蛙第5頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四多氯聯(lián)苯

2、導(dǎo)致的前肢畸形第6頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四雞翅骨骼模式圖尺骨橈骨肱骨腕骨示三個發(fā)育軸：近側(cè)-遠(yuǎn)側(cè)軸、前后軸及背腹軸。第7頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四在所有的四足動物中，附肢發(fā)育的基本形態(tài)發(fā)生原則（basic morphogenetic rules）是相同的。構(gòu)建一個附肢所需要的位置信息要在一個三維（或包括時間在內(nèi)的四維）的、相互協(xié)調(diào)的系統(tǒng)中發(fā)揮作用。現(xiàn)在已鑒定了一系列蛋白，在附肢近遠(yuǎn)軸、前后軸和背腹軸的形成過程中發(fā)揮作用。第8頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四一、肢芽的形成脊椎動物的附肢在起源上是由胚胎體壁向外生

3、長形成的，主要是由來自中胚層的疏松間質(zhì)形成的中央核，以及來自外胚層的表皮兩大部分組成。附肢的原基稱為附肢芽（limb bud）。附肢芽形成的位置在每一物種是恒定的，由Hox基因沿身體前后軸表達(dá)的水平?jīng)Q定。第9頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四雞胚胎的肢芽。孵化后第三天胚胎的側(cè)面出現(xiàn)肢芽第10頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四許多脊椎動物胚胎中的預(yù)定附肢區(qū)（prospective limb area）已被定位。能形成一個附肢的所有細(xì)胞，稱為附肢場（limb field），包括位于中央的、產(chǎn)生附肢本身的中胚層細(xì)胞（附肢盤，limb disc）以及形成周圍

4、的軀干組織和肩帶的細(xì)胞。附肢場起初具有調(diào)節(jié)失去或增加部分附肢的能力，附肢場中的每個細(xì)胞都能被指令形成附肢的任意一部分。第11頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四肢體盤（limb disc）：肢體場(limb field): 由有能力形成一個肢體的中胚層細(xì)胞所組成的區(qū)域。肢體場細(xì)胞的特點：可調(diào)節(jié)性。中央?yún)^(qū)將形成自由活動的附肢，包圍中央?yún)^(qū)的灰色和淺色半環(huán)形細(xì)胞帶分別是肩帶和圍臂組織。這些區(qū)域以外的外周組織（深色環(huán)形）通常不直接參與肢體的發(fā)育，但是如果切除中央組織，它們有可能誘導(dǎo)肢體形成。第12頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四二、附肢的早期發(fā)育 附肢發(fā)育中

5、外胚層和中胚層間的相互作用附肢發(fā)育起始于肢場側(cè)板中胚層（四肢骨的前體）和體節(jié)中胚層（四肢肌肉的前體）間質(zhì)細(xì)胞的增殖。體節(jié)中胚層細(xì)胞沿胚胎長軸的增殖，逐漸在表皮的下面形成厚的間質(zhì)細(xì)胞團(tuán)，可能與兩對附肢形成的位置有關(guān)。第13頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四兩棲類胚胎側(cè)板中胚層的細(xì)胞增值引起肢芽外突，這些細(xì)胞將產(chǎn)生肢體的骨骼，遷移到肢芽的體節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生肌肉。生肌節(jié)細(xì)胞（紫色）進(jìn)入肢芽的計算機(jī)三維重構(gòu)模式圖。側(cè)板中胚層肢體骨骼前體肢芽肢體肌肉前體內(nèi)胚層 原腎 脊索 第14頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四兩棲類胚胎中附肢由中胚層起源的圖解第15頁，共50頁，

6、2022年，5月20日，7點45分，星期四覆蓋在間質(zhì)細(xì)胞團(tuán)表面的表皮變得稍微增厚，同時被包裹在內(nèi)部的間質(zhì)細(xì)胞團(tuán)向外突出，形成肢芽（limb bud）。肢芽形成的信號是由形成預(yù)定附肢間質(zhì)細(xì)胞的側(cè)板中胚層細(xì)胞提供的，這些細(xì)胞分泌的FGF10能夠啟動上皮和中胚層細(xì)胞之間的相互作用。含有FGF10的磁珠（bead）異位放置于上皮下方，會誘導(dǎo)出額外的肢芽。第16頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四FGF10的表達(dá)及其在雞肢發(fā)育過程中的作用第17頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四三、頂外胚層嵴的形成隨著鳥類和哺乳類的中胚層間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)入肢區(qū)，它們分泌的因子誘導(dǎo)肢芽頂

7、端前、后邊緣的外胚層細(xì)胞伸長，形成一個增厚的特殊結(jié)構(gòu)，稱為頂外胚層嵴（apical ectoderm ridge，AER）。AER是一個臨時的結(jié)構(gòu)，對于附肢的繼續(xù)向外生長是至關(guān)重要的。第18頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四FGF10能夠誘導(dǎo)雞胚背腹交界處的外胚層形成AER。在背部化的肢芽突變體中，由于沒有背腹交界，便不能形成AER。第19頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四AER的作用： 1.維持其內(nèi)側(cè)的間質(zhì)細(xì)胞的增生能力，使肢體沿ProximalDistal軸線生長。2.持續(xù)產(chǎn)生和分泌P-D軸分化決定因子。3.與控制AP和DV軸線的因子互作，以指導(dǎo)

8、細(xì)胞的分化。第20頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四AER的形成依賴于背部外胚層和腹部外胚層的互作A.移植手術(shù)：將一個肢芽的腹部外胚層細(xì)胞移植到另一肢芽的背部外胚層中；B. 手術(shù)26h后將產(chǎn)生一個額外的AER（三角所指）；C. 在頂端外胚層嵴形成過程中，肢芽中表達(dá)的radical fringer基因限制在背腹連接處背側(cè)細(xì)胞中表達(dá)，這部分細(xì)胞將發(fā)育為AER第21頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四 附肢的向外生長涉及AER和中胚層間持續(xù)的相互作用。一旦中胚層誘導(dǎo)其上方的外胚層形成AER，AER與中胚層的相互作用對附肢的向外生長是最重要的。中胚層在附肢發(fā)育

9、中也起著關(guān)鍵的作用。AER起初的形成和繼續(xù)存在依賴于位于其下方的中胚層。附肢發(fā)育中至少要求三種類型的外胚層和中胚層間的相互作用：第一，中胚層起始附肢芽向外生長和形成AER；第二，AER進(jìn)一步刺激肢芽的向外生長以及肢芽中胚層的增殖和分化；第三，附肢芽中胚層提供保持AER所必須的刺激。第22頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四肢芽起始形成的分子模型側(cè)板中胚層分泌的FGF10誘導(dǎo)背腹邊緣外胚層表達(dá)FGF8，外胚層分泌的FGF8又反過來誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞增殖和肢芽后段表達(dá)sonic hedgehog基因。Sonic hedgehog 基因誘導(dǎo)肢芽后段外胚層表達(dá)FGF4，由此構(gòu)成了一個持續(xù)

10、性的區(qū)域化多基因誘導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致肢芽的形成。AER區(qū)外胚層也表達(dá)FGF2，其是否被FGF10誘導(dǎo)還不清楚。第23頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四肢芽形成的分子模型第24頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四四、肢體近-遠(yuǎn)端發(fā)育的實現(xiàn)肢體近-遠(yuǎn)端發(fā)育的實現(xiàn)是AER和肢芽間質(zhì)細(xì)胞相互作用的結(jié)果。肢芽的逐漸向外生長是由于位于AER下面間質(zhì)細(xì)胞的增殖，而AER釋放的分子維持間質(zhì)細(xì)胞不斷進(jìn)行分裂。由AER合成、釋放到其下的間質(zhì)中的成纖維細(xì)胞生長因子FGF可能是雞胚中維持間質(zhì)細(xì)胞增殖的分子。第25頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四AER在肢芽沿

11、PD軸生長中的作用AER的主要責(zé)任是誘導(dǎo)間質(zhì)組織不斷的生長和促使其骨骼的形成，而肢芽間質(zhì)組織則決定著肢體發(fā)育的類型。第26頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四AER中FGF8的表達(dá)是肢體生長所必需的A. 原位雜交顯示肢芽開始形成時Fgf8在外胚層中的表達(dá)；B. Fgf8在AER的表達(dá); C. FGF8在正常的3天雞胚前后肢芽的AER中表達(dá)，此外，也在包括咽弓在內(nèi)的其他部位表達(dá)。第27頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四AER對PD軸線影響的分子基礎(chǔ)是FGF因子A.將第20期的雞胚胎翅芽AER移去后，只形成肱骨；B. 將一個吸吮了鹽溶液的緩釋膠珠植入發(fā)生帶

12、，也只形成肱骨；C.將一個吸吮了FGF2的緩釋膠珠植入發(fā)生帶，肢芽繼續(xù)生長，形成尺骨和橈骨；D.如果在第一個緩釋膠珠失效時，植入第二個吸吮了FGF2的緩釋膠珠，則肢芽繼續(xù)生長，形成掌骨和指骨。第28頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四發(fā)生帶Progress zone是指AER內(nèi)保持了旺盛分裂能力的間質(zhì)細(xì)胞區(qū)域。不同時間離開progress zone的細(xì)胞分化為不同的軟骨。證據(jù)之一是，在不同時間去除AER，所形成的肢體骨不同。先離開的間質(zhì)細(xì)胞分化為發(fā)育為肢體的近端部分，后離開的間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育為遠(yuǎn)端部分。第29頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四發(fā)生帶（PZ）

13、細(xì)胞控制近-遠(yuǎn)端分化A. 將早期翅芽的PZ移植到已經(jīng)形成尺骨和橈骨的晚期翅芽中，形成額外的尺骨和橈骨；B. 將晚期翅芽的PZ移植到早期翅芽中，中間結(jié)構(gòu)缺失。第30頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四PZ區(qū)作用模式第31頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四間質(zhì)細(xì)胞離開PZ區(qū)的時間決定了其分化命運(yùn)第32頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四刪除平行同源Hox基因會導(dǎo)致發(fā)育中肢骨丟失A.野生型小鼠前肢；B.Hoxa-11和Hoxd11基因雙突變小鼠的前肢缺失尺骨和橈骨；C.HOXD-13位點純合突變導(dǎo)致并指；D.Hox基因控制前肢不同部位分化

14、的假說：Hox913分別對應(yīng)肩胛骨、肱骨、尺骨與橈骨、掌骨、指骨。第33頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四人的多指癥也可能與Hox基因的異位表達(dá)有關(guān)第34頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四五、肢體AP軸線的確定 雞肢芽尚未形成之前，其AP和DV軸線就已經(jīng)確定。(移植的肢芽的極性不受受體胚胎極性的影響)第35頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四將額外的ZPA移植到肢芽的前端可導(dǎo)致遠(yuǎn)端形成鏡像對稱結(jié)構(gòu)肢體前后方向的決定來自早期就存在于肢芽后側(cè)的稱為極性活化區(qū)（zone of polarizing activity, ZPA）的小塊間質(zhì)

15、組織的作用。第36頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四Sonic Hedgehog的表達(dá)部位與ZPA吻合原位雜交顯示，在脊椎動物的肢芽中sonic hedgehog基因表達(dá)并僅表達(dá)在ZPA區(qū)域。第37頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四Sonic hedgehog was found to be expressed in the ZPA第38頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四極性活化區(qū)位于后部間質(zhì)細(xì)胞區(qū)附肢發(fā)育中的位置信號圖中以不同的色塊表示sonic hedgehog基因的不同表達(dá)強(qiáng)度，而色塊中的數(shù)字表示，如果將這些區(qū)域被切下并移

16、植到早期肢芽前部邊緣，造成額外肢體發(fā)生的百分?jǐn)?shù)。第39頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四 將sonic hedgehog 基因插入一種雞病毒強(qiáng)啟動子后端，用此重組病毒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的雞胚胎成纖維母細(xì)胞。感染細(xì)胞離心分離后植入具有抗此病毒感染能力的雞胚胎的肢芽前側(cè)，此病毒不能感染受體胚胎，但移植的感染細(xì)胞具有表達(dá)并分泌高水平sonic hedgehog基因的能力。結(jié)果顯示接受移植的胚胎長出了鏡像對稱肢體，這說明sonic hedgehog基因有造成發(fā)育極化現(xiàn)象的功能。Sonic hedgehog基因的極性活化實驗第40頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四Z

17、PA活性決定AP軸線的信號傳導(dǎo)機(jī)制A.短距信號順序替換推進(jìn)模型，即一種信號（如2）生成細(xì)胞誘導(dǎo)前方細(xì)胞產(chǎn)生同樣的信號，自身變?yōu)榱硪环N信號生成細(xì)胞（如3），并依此類推下去； B.短距信號級聯(lián)誘導(dǎo)模式，即原初信號生成細(xì)胞誘導(dǎo)鄰近細(xì)胞成為新的另一種信號生成細(xì)胞（如4），這個細(xì)胞又誘導(dǎo)前方相鄰的細(xì)胞分化為再一種信號的生成細(xì)胞（如3），并依此類推下去； C. 信號濃度梯度模型，即原初信號發(fā)生細(xì)胞不斷產(chǎn)生同樣的信號物質(zhì)，但是由于在它周圍形成了信號物質(zhì)的濃度梯度分布，并由此誘導(dǎo)相鄰遠(yuǎn)近不同的細(xì)胞產(chǎn)生不同的分化（如4、3、2）。第41頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四六、肢體DV軸線的確

18、定在背部外胚層特異性表達(dá)的Wnt-7a誘導(dǎo)背部間質(zhì)細(xì)胞合成轉(zhuǎn)錄因子Lmx-1，后者再控制肢芽背部特異性基因的表達(dá)。若Lmx-1在背、腹間質(zhì)細(xì)胞中都表達(dá)，導(dǎo)致雙背部結(jié)構(gòu)。Engrailed在小鼠肢芽腹部外胚層表達(dá)，其突變體的肢芽腹部外胚層可表達(dá)Wnt-7a，從而形成雙背部結(jié)構(gòu)。第42頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四Wnt7a缺陷型小鼠肢體背-腹分化的改變A. 野生型小鼠15.5d胚胎前爪的組織切片，可以觀察到腹面腹腱和腹足墊的結(jié)構(gòu)（箭頭）；B. Wnt7a缺陷型小鼠15.5d胚胎前爪的組織切片，背面也有了腱和足墊的結(jié)構(gòu)。圖中：dt-背腱；dp-背足墊；vt-腹腱；vp-腹

19、足墊第43頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四七、前后肢的區(qū)分雞翅和腿的前軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)時對不同形態(tài)分化因子的應(yīng)答不同，雞翅和腿前軟骨細(xì)胞對血清、TGF-、視黃酸、纖粘連蛋白的應(yīng)答效果。左邊3組照片是光鏡照片，右邊1組照片是熒光顯微照片。第44頁，共50頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四Tbx5和Tbx4分別指定了前肢芽和后肢芽的發(fā)育在雞正常發(fā)育中，原位雜交顯示Tbx5在側(cè)板中胚層前端表達(dá)，而Tbx4在后端表達(dá)，含Tbx5的肢芽形成翅，含Tbx4的肢芽形成腿；人的Holt-Oram Syndrome表現(xiàn)為心臟和手的畸形，而腳是正常的，其TBX5基因發(fā)生了突變第45頁，共