固定化酶的技術

1、關于固定化酶技術第1頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四1 原理2 特點3 制備方法4 應用5 發(fā)展趨勢及建議第2頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四水溶性酶1 原理 水不溶性載體固定化技術 水不溶性酶 （固定化酶） 第3頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四 2 特點穩(wěn)定性高；酶可反復使用；產(chǎn)物純度高，極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；固定化酶的反應條件易于控制生產(chǎn)可連續(xù)化和自動化，節(jié)約勞動力；設備小型化、可節(jié)約能源。固定化酶同自由酶相比，具有以下優(yōu)點：第4頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四缺點：固定化所需載體和試劑較貴，

2、成本高，投資大固定化時，酶活力有損失長期生產(chǎn)，易污染，載體易降解，酶易失活只能用于可溶性底物，較適用于小分子底物，對大分子底物不適宜與完整菌體相比不適宜于多酶反應，特別是需要輔助因子的反應第5頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四 3 制備方法必須注意維持酶的催化活性及專一性。酶與載體的結合部位不應當是酶的活性部位（酶活性中心的氨基酸殘基不發(fā)生變化）避免那些可能導致酶蛋白高級結構破壞的條件。由于酶蛋白的高級結構是憑借氫鍵、疏水鍵和離子鍵等弱鍵維持，所以固定化時要采取盡量溫和的條件，盡可能保護好酶蛋白的活性基團。基本原則：第6頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四

3、固定化應該有利于生產(chǎn)自動化、連續(xù)化。載體能抗一定的機械力。固定化酶應有最小的空間位阻。酶與載體必須結合牢固，利于固定化酶的回收及反復使用。固定化酶應有最大的穩(wěn)定性，所選載體不與廢物、產(chǎn)物或反應液發(fā)生化學反應。固定化酶成本要低，以利于工業(yè)使用。第7頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四3.1 固定化酶的傳統(tǒng)制備方法3.1.1吸附法吸附法是利用物理吸附法，將酶固定在纖維素、瓊脂糖等多糖類或多孔玻璃、離子交換樹脂等載體上的固定方式。顯著特點是：工藝簡便及條件溫和，包括無機、有機高分子材料，吸附過程可同時達到純化和固定化；酶失活后可重新活化，載體也可再生。但要求載體的比表面積要求較大，

4、有活潑的表面。3.1.2包埋法包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子結構或微囊結構等多空載體中，而底物仍能滲入格子或微囊內(nèi)與酶相接觸。這個方法比較簡便，酶分子僅僅是被包埋起來，生物活性被破壞的程度低，但此法對大分子底物不適用。第8頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四(1)網(wǎng)格型將酶包埋在凝膠細微網(wǎng)格中，制成一定形狀的固定化酶，稱為網(wǎng)格型包埋法。也稱為凝膠包埋法。(2)微囊型把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。由于形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，所以也稱為微囊化法。第9頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四1.3結合法酶蛋白分子上與不溶

5、性固相支持物表面上通過離子鍵結合而使酶固定的方法，叫離子鍵結合法。其間形成化學共價鍵結合的固定化方法叫共價鍵結合法。共價鍵結合法結合力牢固，使用過程中不易發(fā)生酶的脫落，穩(wěn)定性能好。該法的缺點是載體的活化或固定化操作比較復雜，反應條件也比較強烈，所以往往需要嚴格控制條件才能獲得活力較高的固定化酶。第10頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四1.4交聯(lián)法交聯(lián)法是用多功能試劑進行酶蛋白之間的交聯(lián)，使酶分子和多功能試劑之間形成共價鍵，得到三向的交聯(lián)網(wǎng)架結構，除了酶分子之間發(fā)生交聯(lián)外，還存在著一定的分子內(nèi)交聯(lián)。多功能試劑制備固定化酶方法可分為：(1) 單獨與酶作用；( 2) 酶吸附在載體

6、表面上再經(jīng)受交聯(lián)；( 3) 多功能團試劑與載體反應得到有功能團的載體，再連接酶。交聯(lián)劑的種類很多，最常用的是戊二醛，其他的還有異氰酸衍生物、雙偶氮二聯(lián)苯胺、N，N-乙烯馬來酰亞胺等。交聯(lián)法的優(yōu)點是酶與載體結合牢固，穩(wěn)定性較高；缺點是有的方法固定化操作較復雜，進行化學修飾時易造成酶失活。第11頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四3.2固定化酶的新型制備方法3.2.1共價固定法酶分子表面存在很多可供利用的化學基團。選擇性地利用酶分子表面遠離活性位點的特定稀有基團(如巰基)進行反應，使該基團與載體上另一基團共價交聯(lián)來同定酶蛋白，使其活性中心朝向溶液方向，以達到控制其空間取向的目的。

7、3.2.2氨基酸置換法利用基因定點突變技術在蛋白質(zhì)分子表面合適位置置換一個氨基酸分子，通過該氨基酸殘基特殊的側鏈基團控制固定方向。通過定點突變在枯草蛋白酶(subtil2isin)分子表面遠離活性中心的位置引入半胱氨酸(Cys)殘基。經(jīng)蛋白質(zhì)空間折疊后暴露出Cys，然后利用Cys殘基上的巰基固定枯草蛋白酶分子，取得了較好的固定效果，固定效率和固定后催化活性均有很大提高。第12頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四3.2.3抗體耦聯(lián)法大多數(shù)抗體具有足夠的穩(wěn)定性承受各種活化與偶聯(lián)方法?？贵w分子中很多可供偶聯(lián)用的官能團可以通過賴氨酸的-氨基或末端氨基、天冬氨酸的-氨基、谷氨酸的-氨基

8、或末端羧基進行一般性的偶聯(lián)。Spitznagel等用碘乙酸活化多孔玻璃珠來定向固定抗體酶(abzyme)48G7-4A1的Fab片段，抗體酶Fab片段保持了很好的催化活性?？贵w分子Fc區(qū)的糖鏈部分氧化可產(chǎn)生醛基，醛基與載體上的氨基通過縮合反應可實現(xiàn)定向固定。醛基若與載體上的酰肼通過腙鍵結合實現(xiàn)抗體分子的定向固定，與隨機固定相比，固定后抗體穩(wěn)定性提高的同時免疫吸附活性也提高了3倍。3.2.4生物素-親和素親合法生物素是存在于所有活細胞內(nèi)但含量甚微(00001)的中性小分子輔酶。親和素是一個含有四個相同亞基的四聚體，每個亞基均含一個生物素結合位點(解離常數(shù)105molL) 。生物素與親和素或相應細

9、菌中的鏈霉親和素有高專一性的、極強的親和力。這種特性使其成為免疫分析、受體研究、免疫組織化學、基因工程和蛋白質(zhì)分離等領域中獨特有力的工具。Min等將生物素羧化載體蛋白、片段分別融合在熒光素酶和氧化還原酶的N末端，然后將這兩個融合蛋白定向固定在親和素包被的瓊脂顆粒上。熒光活性提高了8倍，固定化酶的穩(wěn)定性和固定效率均大大提高。第13頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四4 應用4.1 在食品中的應用4.2 在環(huán)境工程中的應用4.3 醫(yī)學和臨床分析的應用第14頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四4.1 在食品中的應用4.1.1 固定化木瓜蛋白酶應用于啤酒澄清長期放置

10、的啤酒會由于多肽和多酚物質(zhì)發(fā)生聚合反應而變得混濁。為防止出現(xiàn)混濁，目前主要是采取向啤酒中添加蛋白酶來水解啤酒中的蛋白質(zhì)和多肽，但水解過度會影響啤酒保持泡沫的性能。Witt等1970年用戊二醛交聯(lián)將木瓜蛋白酶固定化制成反應柱，生產(chǎn)所得啤酒在長期貯存中可保持穩(wěn)定。Finely 等人報道，用幾丁質(zhì)固定的木瓜蛋白酶可用于啤酒的大罐冷藏或過濾后裝瓶進行處理，通過調(diào)節(jié)流速(酶柱法)和反應時間(分批法)，可以精確控制蛋白質(zhì)的分解程度。處理后的啤酒和固定化酶易分開，固定化酶可以多次反復使用，極為經(jīng)濟。經(jīng)處理后的啤酒在風味上與傳統(tǒng)的啤酒無明顯差異。第15頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四4.

11、1.2 固定化酶用于水解牛奶中的乳糖牛奶中含有4.34.5的乳糖，患乳糖缺乏癥的人飲用牛奶后將導致不良后果，用乳糖酶可以將乳糖分解為半乳糖和葡萄糖。用固定化乳糖酶反應器可以連續(xù)處理牛奶，將乳糖分解。此外，固定化乳糖酶還可以用來分解乳糖，制造具有葡萄糖和半乳糖甜味的糖漿。乳糖在溫度較低時易結晶，用固定化乳糖酶處理后，可以防止其在冰激淋類產(chǎn)品中結晶，改善口感，增加甜度。第16頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四4.1.3 固定化葡萄糖異構酶在高果糖漿生產(chǎn)中的應用固定化葡萄糖異構酶是世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種，它可以來催化玉米糖漿和淀粉生產(chǎn)高甜度的高果糖漿。自1972年這技術產(chǎn)生以來

12、，科學家已經(jīng)固定了幾種芽孢桿菌和鏈霉菌中提的葡萄糖異構化酶，并大量應用于工業(yè)生產(chǎn)中，今后幾十年中它將是應用最廣，市場份額最大的固定化酶。第17頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四4.1.4 固定化酶法脫去柑桔類果汁中的苦味柑桔類加工產(chǎn)品出現(xiàn)過度苦味是柑桔加工業(yè)中較重要的問題。造成苦味的物質(zhì)主要是二類：一類為檸檬苦素的二萜烯二內(nèi)酯化合物(A 環(huán)和B 環(huán))；另一類為果實中多種黃酮苷。脫去苦味的方法有：吸附法和固定化酶法。吸附法是一次去除苦味物質(zhì)，而酶法脫苦主要是利用不同的酶分別作用于檸檬苦素和柚皮苷，生成不含苦味的物質(zhì)。工廠生產(chǎn)中常采用固定化柚皮苷酶減少柑桔類果汁中的柚皮苷含量。

13、Tsen等在1989 年使用甲殼素固定柚皮苷酶，并且研究了固定化的動力學因子。Manjon等14使用空心玻璃床作為載體，分別在1977 年使用DEAE-Sephadex，1978 年使用單寧-2- 氨基乙基纖維作為載體。1996 年Puri等使用海藻糖，1998年Soures等使用醋酸纖維和三醋酸纖維制成膜固定酶。第18頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四酶法去除苦味物質(zhì)因為酶的生物活性特征而使其應用受到很多限制。為了在不改變底物理化性質(zhì)條件下，使酶保持最大活性，通常要注意以下幾個問題：固定化材料的選擇；固定率；固定化后的酶活性；最適pH值；溫度對酶活性的影響；酶在不同濃度果

14、汁中受到的抑制作用；酶的保存。第19頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四4.1.5 固定化酶技術應用于食品檢測固定化酶技術的發(fā)展使生物傳感器應運而生。而它的問世不僅使食品成分的快速、低成本、高選擇性分析測定成為可能，而且生物傳感器技術的持續(xù)發(fā)展將很快實現(xiàn)食品生產(chǎn)的在線質(zhì)量控制，降低食品生產(chǎn)成本，并給人們帶來安全可靠及高質(zhì)量的食品。生物傳感器的核心元件就是其分子識別元件，即由生物活性物質(zhì)經(jīng)固定化后形成的敏感膜。Kurube用酶傳感器測定了豬肉新鮮度；日本農(nóng)林水產(chǎn)省研制出的滋味傳感器，可品嘗肉湯風味，用于肉湯生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制；Fernando采用電導型生物傳感器來檢查食品中有機

15、農(nóng)藥的污染。第20頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四4.2 在環(huán)境工程中的應用4.2.1 用于有機廢水處理污水處理中常用的酶有辣根過氧化物酶、漆酶、酪氨酸酶等。這些酶可降解有機廢水中毒性很強的酚類。利用固定化辣根過氧化物酶去除污水中的4-氯酚，去除率高達80%。用殼聚糖微球固定化辣根過氧化物酶處理含酚廢水，并考察酚濃度對去除率的影響。研究表明，酚濃度低于100 mg/L 時，酚的去除率達90%以上，隨著酚濃度的增加，酚的去除率逐漸下降。第21頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四用固定化酶處理受污染水體中的農(nóng)藥也取得了很好的效果。用聚丙烯負載二氧化鈦膜固定農(nóng)

16、藥降解酶，降解農(nóng)藥甲基對硫磷。研究發(fā)現(xiàn)，甲基對硫磷在30 min 內(nèi)降解了70%以上。尤其等以殼聚糖為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，固定化真菌漆酶對農(nóng)藥氯苯嘧啶醇進行降解。研究認為，在酸性條件下，固定化漆酶對氯苯嘧啶醇具有良好的降解作用。第22頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四“用于污染水源修復的固定化酶復合材料及其制備方法”發(fā)明專利也用到了固定化酶。這種復合材料造價低，廣泛應用于廢水處理工程，是一種經(jīng)濟實用、前景廣闊的新型環(huán)保材料，具有綜合交叉學科集成創(chuàng)新的特點， 為環(huán)保領域水處理工程技術帶來嶄新的突破。聯(lián)合固定化技術使酶的特性得到了更好的發(fā)揮，擴展了固定化酶的應用范圍。將脫色酶

17、與苯胺降解菌混合固定用來處理染料廢水。結果表明， 脫色率及苯胺降解率分別達到80%和90%以上。用苯酚甲醛樹脂吸附結晶型枯草桿菌淀粉酶處理造紙廠廢水，廢水在反應器中停留4.5 h，可去除廢水中78%的懸浮膠態(tài)淀粉。第23頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四4.2.2 用于環(huán)境污染物的監(jiān)測由固定化酶制成的酶反應器可以直接或與其他檢測器組成酶電極、酶傳感器等分析檢測系統(tǒng)來實現(xiàn)對環(huán)境污染物的監(jiān)測。由于農(nóng)藥的面源污染、未經(jīng)處理的污水直接灌溉等問題， 食品中的有毒有害物質(zhì)成為環(huán)境監(jiān)測對象。固定化酶技術可以實現(xiàn)對食品中有害物質(zhì)的有效檢測。用固定化草酸氧化酶完成了對河豚魚中河豚毒素的快速檢

18、測。用聚乙烯醇苯乙烯吡啶固定乙酰膽堿酯酶， 與搗碎提取設備、酶標儀組合了一套檢測設備，對200 多個蔬菜樣品進行了成功的檢測。第24頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四4.2.3 其他應用CO2是一種重要的溫室氣體。目前全球每年排放的數(shù)十億噸CO2需要得到妥善的處置。固定化酶技術在固定CO2方面也取得了成果。據(jù)報道，以工業(yè)固體廢棄物為原料， 利用固定化碳酸酐酶和超重力強化反應可得到CO2的有效固定固定化酶技術在清潔生產(chǎn)領域具有潛在的應用價值。固定化的木聚糖酶和漆酶用于紙漿漂白， 可以避免產(chǎn)生傳統(tǒng)造紙工藝過程中用氯漂白產(chǎn)生的難以生物降解的各類氯代有機物。第25頁，共35頁，20

19、22年，5月20日，5點9分，星期四固定化酶技術還在污水生物處理工藝中得到了應用。用大孔樹脂固定水解酶類到兩相厭氧反應器中處理黃漿廢水。對厭氧濾池中的以納米改性陶粒為載體固定化木瓜蛋白酶開展研究，都取得了一系列相應的成果。第26頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四4.3 固定化酶在醫(yī)藥治療上的應用溶液酶的應用缺陷：酶作為異體物質(zhì)，在體內(nèi)應用會導致免疫反應酶是蛋白質(zhì)，在體內(nèi)易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)移除和被蛋白質(zhì)酶水解破壞由于稀釋效應，藥物酶無法集中于靶器官組織以達到治療所需的最適高濃度 第27頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四 （1）轉(zhuǎn)入體內(nèi)發(fā)揮作用（口服和注入）

20、口服：最初主要限于消化酶類，近年來也有人嘗試將酶以口服方式用于尿中毒等疾患的治療。口服的優(yōu)點是藥物通過粘膜吸收后能迅速進行擴散，進入體內(nèi)，通常不會引起免疫反應。注入：是最有實用價值的一種方式，溶液酶的弱點集中于此方式。 固定化酶可很好的地解決這一問題，辦法是將藥物酶包埋于半透膜中，可防止藥物酶和蛋白水解酶以及其它免疫因子等直接接觸，因而可延長酶在體內(nèi)的半衰期和避免免疫過敏反應。第28頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四 （2）通過“體外循環(huán)”做成人工臟器 固定化酶也可做成“人工臟器”參與體外循環(huán)， 應用有兩方面：用于除去有害的毒性物質(zhì)及有潛在毒害作用的代謝產(chǎn)物除去氨基酸，使需

21、要這些物質(zhì)的病變組織“餓死”；治療時只需將患者的血液引出體外，通過由固定化酶等構成的“人工臟器”加以處理，然后再回流體內(nèi)。第29頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四實例： A. 消血栓：纖溶酶是異源蛋白質(zhì)，在人體內(nèi)引起免疫反應，無法長期使用。酶的不穩(wěn)定性使其在較短的時間內(nèi)失活。 用包埋法制備的酶固定化技術可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物質(zhì)能自由進出。第30頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四B.人工腎 將病人血液中的尿素經(jīng)脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用微膠囊固定化脲酶和活性炭組成人工腎。第31頁，共35頁，2022年，5月20日，5點9分，星期四5 發(fā)展趨勢及建議隨著生物技術的迅速發(fā)展，固定化酶在食品工業(yè)中的應用日益廣泛，但并不是說可以使用酶的地方，都可以用固定化酶來代替。在使用固定化酶技術時，也需要綜合考慮其制備工藝、酶回收率、可操作性、穩(wěn)定性及生產(chǎn)成本等方面的因素。我國目前食品加工企業(yè)使用該技術的現(xiàn)狀是，固定化酶的操作方法復雜、穩(wěn)定性較差，成本過高或使用了有毒的化學試劑而不符合食