免疫組化概論抗原抗體培訓(xùn)課件

1、免疫組化概論抗原抗體免疫組化概論抗原抗體概 論 一、什么是免疫組織化學(xué) 免疫組織化學(xué)是應(yīng)用免疫學(xué)和組織化學(xué)原理，對(duì)細(xì)胞組織標(biāo)本中的某些多肽、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)進(jìn)行定性、定位、定量研究的一門科學(xué)。2免疫組化概論抗原抗體概 論 2免疫組化概論抗原抗體這項(xiàng)技術(shù)本質(zhì)上是一種染色及原位示蹤技術(shù)，它是在酶組織化學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，始于20世紀(jì)中期。二、發(fā)展歷史3免疫組化概論抗原抗體二、發(fā)展歷史3免疫組化概論抗原抗體免疫熒光標(biāo)記抗體技術(shù)-Coons 1940年免疫酶標(biāo)抗體技術(shù)-Abakane 1963不標(biāo)記酶抗體（酶抗酶復(fù)合物）技術(shù)-Sternberger 1970膠體金免疫標(biāo)記技術(shù)和親和標(biāo)記技術(shù)-Hsu

2、19854免疫組化概論抗原抗體免疫熒光標(biāo)記抗體技術(shù)-Coons 1940年免疫酶標(biāo)抗免疫試劑，自1975年Kohler和Milstein發(fā)明了單克隆抗體制備的雜交瘤技術(shù)后，已從采用多克隆抗體轉(zhuǎn)入了廣泛應(yīng)用單克隆抗體時(shí)代。目前商品供應(yīng)的特異性第一抗體和交聯(lián)第二抗體，絕大多數(shù)都為單克隆抗體。 5免疫組化概論抗原抗體免疫試劑，自1975年Kohler和Milstein發(fā)明了 1.特異性強(qiáng) 專一 2.敏感性高 檢測(cè)閾值達(dá)ng或pg水平 3.定位準(zhǔn)確 既可定性、定位，又可定量 4.三位一體 形態(tài)、功能和代謝三結(jié)合 缺點(diǎn)：干擾多，易出現(xiàn)假陽性 三、技術(shù)特點(diǎn)（優(yōu)點(diǎn)）6免疫組化概論抗原抗體 三、技術(shù)特點(diǎn)（優(yōu)點(diǎn)

3、）6免疫組化概論抗原抗體（一）組織處理與切片選擇 （二）免疫染色的前處理 試劑準(zhǔn)備（示蹤，放大，標(biāo)記） 消化 阻斷*（三）免疫組化染色 原理、優(yōu)缺點(diǎn)、流程 （四）免疫染色的后處理 增強(qiáng)、襯染、封固 四、免疫組織化學(xué)染色操作步驟7免疫組化概論抗原抗體（一）組織處理與切片選擇四、免疫組織化學(xué)染色操作步驟7免*（五）結(jié)果判斷與對(duì)照設(shè)置 方法眾多 敏感不同 程序雷同 按需選用 關(guān)鍵步驟：特異抗體-橋聯(lián)抗體-標(biāo)記抗體種系必需匹配 （第一抗體）（第二抗體）（第三抗體） 8免疫組化概論抗原抗體*（五）結(jié)果判斷與對(duì)照設(shè)置關(guān)鍵步驟：特異抗體-橋聯(lián)抗第一節(jié) 抗原和抗體9免疫組化概論抗原抗體第一節(jié) 抗原和抗體9免疫

4、組化概論抗原抗體一、抗原：凡能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答（免疫原性），并能與相應(yīng)免疫應(yīng)答物（抗體或致敏淋巴細(xì)胞）在體內(nèi)、外發(fā)生特異性結(jié)合（反應(yīng)原性）的物質(zhì)?？乖拿庖咴匀Q于抗原的異物性；大分子；表面積；專一決定簇等。10免疫組化概論抗原抗體一、抗原：抗原的免疫原性取決于抗原的異物性；大分子；表免疫原性反應(yīng)原性完全抗原complete antigen有有半抗原h(huán)epten無有半抗原載體蛋白 全抗原載體蛋白：BSA 、 多聚賴氨酸 、 牛甲狀腺球蛋白等； （免疫原性強(qiáng)，易獲得，交叉反應(yīng)易去除）交聯(lián)要求：不改變半抗原的分子構(gòu)型； 遠(yuǎn)離半抗原的抗原決定簇； 高結(jié)合率（結(jié)合半抗原數(shù)目至少20個(gè)以上）

5、交聯(lián)劑11免疫組化概論抗原抗體免疫原性反應(yīng)原性完全抗原有有半抗原h(huán)epten無有半抗原載 抗原決定簇(表位)：抗原分子中決定抗原特異性的活性化學(xué)基團(tuán)，其性質(zhì)、數(shù)量、空間構(gòu)型決定抗原的特異性。-免疫組化的精確性、特異性 12免疫組化概論抗原抗體12免疫組化概論抗原抗體交叉反應(yīng)：抗原（或抗體）除與其相應(yīng)抗體（或抗原）特異結(jié)合外，有時(shí)可與其他抗體（或抗原）發(fā)生反應(yīng)。-多數(shù)天然抗原表面帶有多個(gè)相同或不同的表位-不同抗原的表位相同或相似的情況下可發(fā)生交叉反應(yīng)-免疫組化的假陽性13免疫組化概論抗原抗體交叉反應(yīng)：抗原（或抗體）除與其相應(yīng)抗體（或抗原）特異結(jié)合外，二、抗體B細(xì)胞在抗原刺激下增殖分化為漿細(xì)胞所產(chǎn)

6、生的糖蛋白，又稱免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。-可與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合-亦可作為抗原，激發(fā)免疫應(yīng)答14免疫組化概論抗原抗體二、抗體B細(xì)胞在抗原刺激下增殖分化為漿細(xì)胞所產(chǎn)生的糖蛋白，又抗體的分子結(jié)構(gòu) 1.抗體分子在立體構(gòu)型上都是Ig， 但 Ig不都是抗體。 2.各類Ig的基本單位都是四條肽鏈的對(duì)稱結(jié)構(gòu),包括二條相同的重鏈(heavy chain, H鏈),及二條相同的輕鏈(light chain,L鏈),每條重鏈(H鏈)和輕鏈(L鏈)分為氨基端(N端)和羧基端(C端)。15免疫組化概論抗原抗體抗體的分子結(jié)構(gòu) 1.抗體分子在立體構(gòu)型上都是Ig， 但 I 3 .兩條重鏈間，兩條輕

7、鏈間及重鏈和輕鏈間，分別借二硫鍵連接。此為免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu)，又稱為免疫球蛋白的單體,呈“Y”字構(gòu)型。16免疫組化概論抗原抗體 3 .兩條重鏈間，兩條輕鏈間及重鏈和輕鏈間，分別借 4.重鏈上結(jié)合有不同量的糖,故Ig屬糖蛋白。根據(jù)重鏈抗原性的不同可分為5類，即 鏈， 鏈， 鏈，鏈和鏈， 由它們組成的Ig分別稱為IgM，IgG，IgA，IgE和IgD。17免疫組化概論抗原抗體 4.重鏈上結(jié)合有不同量的糖,故Ig屬糖蛋白。根據(jù)重免疫組化概論抗原抗體培訓(xùn)課件 6. Ig單體的氨基酸序列可分為恒定區(qū)（constant region,C區(qū))和可變區(qū)（variable region,V區(qū)）。-可變區(qū)位于I

8、g多肽鏈的N端，占輕鏈的約1/2及重鏈的約1/4（Ig結(jié)合抗原的所在部位）-恒定區(qū)位于Ig多肽鏈的C端，占輕鏈的余下的1/2及重鏈的3/4（補(bǔ)體結(jié)合域，F(xiàn)c受體結(jié)合位點(diǎn)，Ig 抗原決定簇等所在部位）19免疫組化概論抗原抗體 6. Ig單體的氨基酸序列可分為恒定區(qū)（consta7. Ig的水解片斷可因選用的水解酶不同而異。采用木瓜蛋白酶(papain)水解Ig時(shí)：-2個(gè)相同的Fab (fragment antigen binding)段，即抗原結(jié)合片斷-1個(gè)Fc （fragment crystalliable) 段，即可結(jié)晶片斷，擁有Ig抗原決定簇。20免疫組化概論抗原抗體7. Ig的水解片斷可

9、因選用的水解酶不同而異。采用木瓜蛋 采用胃蛋白酶（pepsin），其酶切位點(diǎn)在Ig重鏈間二硫鍵近羧基端- 一個(gè)具雙價(jià)抗體活性的F(ab)2片斷-一個(gè)不具任何免疫活性的Fc片斷。21免疫組化概論抗原抗體 采用胃蛋白酶（pepsin），其酶切位點(diǎn)在8.抗體的蛋白類型主要為IgG和IgM。-IgM見于初次免疫和免疫早期，滯留時(shí)間較短。-IgG一般見于加強(qiáng)免疫和免疫晚期，滯留時(shí)間較長，是免疫球蛋白的主要類型。22免疫組化概論抗原抗體8.抗體的蛋白類型主要為IgG和IgM。22免疫組化概論抗原三、抗體的制備依制備途徑，目前人工制備的特異性抗體有三類：-多克隆抗體（PcAb）-單克隆抗體（McAb）-基因

10、工程抗體23免疫組化概論抗原抗體三、抗體的制備依制備途徑，目前人工制備的特異性抗體有三類：2（一） 抗原提取與純化的一般原則1.建立檢測(cè)方法（定性、定量、活性）2.選擇抗原含量高、易獲得、價(jià)廉、可大量收集的樣品為原料-人AFPAFP(+)肝癌病人腹水；46月胎兒血清-鼠AFP孕18天大鼠羊水-波形蛋白（vimentin）豬、牛眼晶狀體-角蛋白（keratin）角化上皮-肌紅蛋白（myoglobin）骨骼肌-膠原（collagen）皮膚、肌腱等24免疫組化概論抗原抗體（一） 抗原提取與純化的一般原則24免疫組化概論抗原抗體 3.保持抗原分子的穩(wěn)定性-低溫、適度pH與離子強(qiáng)度、抑制酶解、保護(hù)巰基

11、4.操作步驟簡易、有效。-提取-分離純化-濃縮-貯存25免疫組化概論抗原抗體 3.保持抗原分子的穩(wěn)定性25免疫組化概論抗原抗體（二）多克隆抗體（抗血清）PcAb的 制備程序 多克隆抗體-指由不同克隆B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體混合物。-每種抗原有多個(gè)表位-用其免疫動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生針對(duì)各表位的不同抗體（多克隆抗體）-血清中的抗體皆是多克隆的 優(yōu)點(diǎn)：制備簡便、價(jià)格低廉、抗體效價(jià)高缺點(diǎn)：特異性不高、易發(fā)交叉反應(yīng)、效價(jià)不太穩(wěn)定 26免疫組化概論抗原抗體（二）多克隆抗體（抗血清）PcAb的 制備程序26免疫組化（二）多克隆抗體（抗血清）PcAb的 制備程序 1 抗原純化免疫原 2 免疫動(dòng)物免疫對(duì)象 3 收集抗血清粗、混合

12、品 4 提取IgG PcAb，純品 5 質(zhì)量鑒定效價(jià)、特異性、蛋白量 6 保存與使用免疫試劑 純度（雜純）：抗血清r球蛋白IgG特異性IgGIgG片段（Fab或F(ab)2） 抗體IgG27免疫組化概論抗原抗體（二）多克隆抗體（抗血清）PcAb的 制備程序 （三）單克隆抗體的制備及其應(yīng)用 單克隆抗體是指由單個(gè)克隆的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)一種抗原決定簇的特異性抗體。它是采用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)（抗體的細(xì)胞工程）制備的。 優(yōu)點(diǎn)：純度高、特異性強(qiáng)、交叉反應(yīng)少、質(zhì)量和效價(jià)穩(wěn)定缺點(diǎn)：制備復(fù)雜、價(jià)格昂貴、抗體效價(jià)較低28免疫組化概論抗原抗體 單克隆抗體是指由單個(gè)克隆的雜交瘤1 .利用雜交瘤技術(shù)制備McAb的基

13、本原理 -淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的克隆選擇學(xué)說，即一個(gè)B細(xì)胞克隆只產(chǎn)生一種抗體； -細(xì)胞融合技術(shù)產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞可以保持雙方親代細(xì)胞的特性； -利用代謝缺陷補(bǔ)救機(jī)理篩選出雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行克隆化，然后大量培養(yǎng)增殖，制備所需的McAb。29免疫組化概論抗原抗體1 .利用雜交瘤技術(shù)制備McAb的基本原理29免疫組化概論抗 2. McAb的制備流程 親本細(xì)胞準(zhǔn)備細(xì)胞雜交融合（PEG）HAT選擇性培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞克隆性培養(yǎng)與建株（有效稀釋法）大量制備單克隆抗體質(zhì)量鑒定與分裝凍存 （擴(kuò)大培養(yǎng)或接種動(dòng)物） （雜交瘤細(xì)胞凍存與復(fù)蘇）30免疫組化概論抗原抗體 2. McAb的制備流程30免疫組化概論抗原抗體 抗原免疫 免疫脾細(xì)胞 小鼠骨髓瘤細(xì)胞 (BALB/C小鼠