實(shí)驗(yàn)六細(xì)胞器的分離與觀察

1、關(guān)于實(shí)驗(yàn)六細(xì)胞器的分離與觀察第1頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)11分，星期三一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饧?xì)胞器的分離原理掌握差速離心和密度梯度離心技術(shù)第2頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)11分，星期三二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞器是細(xì)胞中維持細(xì)胞復(fù)雜生命活動(dòng)的功能性器官，為了研究各種細(xì)胞器的功能，首先就要將這些細(xì)胞器從細(xì)胞中分離出來。利用各種物理方法（研磨、超聲波振蕩、低滲等將組織制成勻漿，細(xì)胞中的個(gè)中亞組分即從細(xì)胞中釋放出來。細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器大小密度存在差異，因此不同細(xì)胞器在介質(zhì)中的沉降系數(shù)各不相同。根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法來分離不同的細(xì)胞器。分級(jí)分離的方法有差速離心和密度

2、梯度離心兩種。第3頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)11分，星期三分離細(xì)胞器最常用的方法是將組織制成勻漿，在均勻的懸浮介質(zhì)中用差速離心法進(jìn)行分離，其過程包括組織細(xì)胞勻漿、分級(jí)分離和分析三步，這種方法已成為研究亞細(xì)胞成分的化學(xué)組成、理化特性及其功能的主要手段。第4頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)11分，星期三 (1)細(xì)胞勻漿(Homogenization)：低溫條件下，將組織放在勻漿器中，加入等滲勻漿介質(zhì)(即0.25molL蔗糖)進(jìn)行破碎細(xì)胞使之成為各種細(xì)胞器及其包含物的勻漿。第5頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)11分，星期三 (2)分級(jí)分離(Fractiona

3、tion)：由低速到高速離心逐漸沉降。先用低速使較大的顆粒沉淀，再用較高的轉(zhuǎn)速，將浮在上清液中的顆粒沉淀下來，從而使各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞核、線粒體等得以分離。由于樣品中各種大小和密度不同的顆粒在離心開始時(shí)均勻分布在整個(gè)離心管中，所以每級(jí)離心得到的第一次沉淀必然不是純的最重的顆粒，須經(jīng)反復(fù)懸浮和離心加以純化.第6頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)11分，星期三 (3)分析：分級(jí)分離得到的組分，可用細(xì)胞化學(xué)和生化方法進(jìn)行形態(tài)和功能鑒定。第7頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)11分，星期三Unna染色法（甲基綠-派洛寧染色） 細(xì)胞核分析：甲基綠-派洛寧對(duì)DNA和RNA有選擇性的染

4、色效果。核酸是酸性的，它們對(duì)于堿性染料甲基綠和派洛寧的親和力不同，而使這兩種染料對(duì)兩類核酸具有了選擇性。DNA被甲基綠染成綠色，RNA被派洛寧染成紅色，這樣就能使細(xì)胞中兩種核酸分布顯示出來。 第8頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)11分，星期三第9頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)11分，星期三 活體染料之所以能固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊的部分，主要是染料的“電化學(xué)”特性起重要作用。堿性染料的膠粒表面帶陽離子，酸性染料的膠粒表現(xiàn)帶有陰離子，而被染的部分本身也是具有陰離子或陽離子，這樣它們彼此之間就發(fā)生了吸引作用。第10頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)11分，星期

5、三中性紅-詹納斯綠染色 線粒體分析：詹納斯綠（Janus green B）是對(duì)線粒體專一的活細(xì)胞染料，毒性很小，屬于堿性染料，解離后帶正電，由電性吸引堆積在線粒體膜上。由于線粒體內(nèi)具有細(xì)胞色素氧化酶系，能使詹納斯綠保持在氧化狀態(tài)（淡藍(lán)綠色）。中性紅為弱堿性染料，對(duì)液泡系(即高爾基體)的染色有專一性，將活細(xì)胞中的液泡系染紅色。 第11頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)11分，星期三洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞的線粒體分布第12頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)11分，星期三植物根尖液泡的中性紅染色第13頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)11分，星期三三、材料和試劑材料：小鼠的肝臟

6、器材：高速冷凍離心機(jī)、天平、顯微鏡、Eppendorf管、冰塊、冰盒、載玻片、蓋玻片、玻璃勻漿器試劑：生理鹽水、0.25mol/L蔗糖溶液、 0.34mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、0.88mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、 95%乙醇溶液、丙酮、PBS液、 甲基綠-派洛寧染液、中性紅-詹納斯綠染液。第14頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)11分，星期三四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟1.細(xì)胞核的分離 （1）組織勻漿:將饑餓24h的大白鼠處死,立即剪開腹部,迅速取出肝組織浸入預(yù)冷的生理鹽水,洗去血污,用濾紙吸干。稱取0.5g肝組織,在小燒杯中剪碎,用預(yù)

7、冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗滌數(shù)次。將燒杯中的懸浮肝組織倒入勻漿管中進(jìn)行勻漿,勻漿過程要在冰浴中進(jìn)行。勻漿完畢,移入1.5ml離心管中。第15頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)11分，星期三 （2）離心：低溫離心機(jī)（4）中進(jìn)行。 每次離心前一定要在天平（托盤天平）上將兩離心管配平。第一次以600g(3005rpm)離心10min。將其上清夜移入Eppendorf管中，蓋好蓋子置于冰浴中，留待后面使用（分離線粒體）。沉淀使用1ml預(yù)冷的0.25mol/L蔗糖溶液離心洗滌2次，每次1000g(3880rpm)離心10min。第16頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)11分，星

8、期三 （3）純化：將沉淀用5倍體積0.34mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液混懸，用長(zhǎng)針頭注射器再混懸液下輕輕加入4倍體積0.88mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液。盡量使兩種溶液明顯分層。以1500g(4752rpm)離心1520min。棄上清液，沉淀即為經(jīng)過純化的細(xì)胞核，用PBS溶液懸浮，4C保存。第17頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)11分，星期三細(xì)胞經(jīng)甲基綠-派洛寧混合液處理后，其中的DNA和RNA出現(xiàn)不同的呈色反應(yīng)，一般認(rèn)為這是由于帶有負(fù)電荷的核酸對(duì)堿性染料派洛寧和甲基綠具有親和力，且這兩種染料的作用有選擇性，甲基綠染高聚分子的DN

9、A呈藍(lán)綠色，派洛寧染低聚分子的RNA呈紅色。 第18頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)11分，星期三下次實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： （4）鑒定：將分離純化的細(xì)胞核制成涂片，空氣干燥。將干燥的涂片浸入95乙醇溶液固定5min，晾干，滴加甲基綠-派洛寧染液染色2030min，丙酮分色30s，蒸餾水漂洗，濾紙吸干水，鏡檢。核DNA呈藍(lán)綠色，核仁和混雜的細(xì)胞質(zhì)RNA呈紅色。第19頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)11分，星期三六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1. 線粒體提取分離過程中，為什么要在04進(jìn)行？2. 要獲得高活性的線粒體，在線粒體提取、分離和活性鑒定的過程中需注意哪些問題？根據(jù)你的實(shí)際體會(huì)，寫出操作注意事項(xiàng)

10、及改進(jìn)方法。3. 分離介質(zhì) 0.34mol/L及 0.88mol/L緩沖蔗糖溶液哪一種在下層? 有什么作用?第20頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)11分，星期三2.線粒體的分離(1)分離:將分離細(xì)胞核時(shí)收集的上清液以10000g(12270rpm)離心10min。沉淀用預(yù)冷0.25mol/L蔗糖溶液懸浮,10000g離心10min,反復(fù)2次。(2)鑒定:在干凈的載玻片中央滴加12滴中性紅-詹納斯綠染液,用牙簽挑取沉淀物均勻涂片。蓋上蓋片,染色5min,鏡檢。線粒體藍(lán)綠色，呈小棒狀或圓形。 第21頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)11分，星期三五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果核DNA呈藍(lán)綠色，

11、核仁和混雜的細(xì)胞質(zhì)RNA呈紅色。線粒體藍(lán)綠色，呈小棒狀或圓形。觀察每個(gè)視野中所見完整細(xì)胞核和線粒體的數(shù)量及純度。第22頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)11分，星期三差速離心（differential centrifugation）主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細(xì)胞器。起始的離心速度較低，讓較大的顆粒沉降到管底，小的顆粒仍然懸浮在上清液中。收集沉淀，改用較高的離心速度離心懸浮液，將較小的顆粒沉降，以此類推，達(dá)到分離不同大小顆粒的目的。 第23頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)11分，星期三第24頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)11分，星期三 沉淀 轉(zhuǎn)速x時(shí)間 內(nèi) 容 物 A150g x 20min完整細(xì)胞 B1000g x 20min 細(xì)胞核，細(xì)胞碎片C3000g x 6min 葉綠體 D10000g x20min 線粒體、溶酶體、微體 E105000g x120min微粒體 F105000g x 20min 0.26%脫氧膽酸納 核糖體 第25頁，共27頁，2022年，5月20日，22