實驗一蛋白質及氨基酸的顯色反應驗證

1、關于實驗一蛋白質及氨基酸的顯色反應驗證第1頁，共29頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三實驗一、 蛋白質及氨基酸的顯色反應 目的和要求 1、學習和了解常用的幾種鑒定蛋白質與氨基酸的方法。 2、進一步認識氨基酸是蛋白質的基本組成單位。第2頁，共29頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三、雙縮脲反應 (Biurea reaction) 原理: 雙縮脲反應:在堿性條件下，雙縮脲與二價銅離子作用，生成紫紅色配合物的反應。當加熱至180左右時，兩分子尿素縮合脫去一分子氨，生成雙縮脲。在肽和蛋白質分子中具有肽鍵，其結構與雙縮脲類似，也能發(fā)生此反應，生成藍紫色或紫紅色的配合物。該反應常用于

2、蛋白質的定性或定量測定。第3頁，共29頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三紫紅色銅雙縮脲復合物分子結構為： 第4頁，共29頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三 蛋白質和多肽都有雙縮脲反應，但有雙縮脲反應的物質不一定都是蛋白質或多肽。此反應所產生顏色的深淺與蛋白質的濃度成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關。第5頁，共29頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三操作步驟 一、取少量尿素結晶，放入干燥試管中，用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮脲。冷卻后，加10%NaOH溶液約1mL，振蕩混勻，再加入1%CuSO溶液1滴，振蕩之。觀

3、察出現(xiàn)的粉紅顏色。避免添加過量硫酸銅，生成的藍色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。二、取另一支試管，加1mL卵清蛋白溶液和10%氫氧化鈉溶液2mL，搖勻，再加1%硫酸銅溶液兩滴，隨加隨搖，觀察紫玫瑰色的出現(xiàn)。第6頁，共29頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三、茚三酮反應 (Ninhydrin reaction)原理: 除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應生成黃色物質外，所有的-氨基酸及一切蛋白質都能和茚三酮反應生成藍紫色物質。該反應分兩步進行，首先是氨基酸被氧化，產生CO、NH3和醛，而水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所生成的還原型茚三酮與另一個水合茚三酮分子和氨縮合生成有色物質。第7頁，共2

4、9頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三 此反應的適宜pH為5-7。該反應十分靈敏，1：1 500 000濃度的氨基酸水溶液即能顯示反應，是一種常用的氨基酸定量方法。第8頁，共29頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三操作步驟一、取2支試管分別加入蛋白質溶液和0.5%甘氨酸溶液1mL，再加0.5mL0.1%茚三酮水溶液混勻，在沸水浴中加熱1-2min，觀察顏色由粉色變成紫紅色再變藍。二、在一小片濾紙上滴上一滴0.5%的甘氨酸溶液，風干后，再在原處滴0.1%的茚三酮乙醇溶液一滴，在微火旁烘干顯色，觀察紫紅色斑點的出現(xiàn)。第9頁，共29頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三、

5、黃色反應 (Xanthoproteic reaction) 原理 凡是含有苯環(huán)的化合物都能與濃硝酸作用產生黃色的硝基苯衍生物。該化合物在堿性溶液中進一步轉化成深橙色的硝醌酸鈉。 在蛋白質分子中酪氨酸和色氨酸殘基易發(fā)生上述反應，而苯丙氨酸不易硝化，需加少量濃硫酸催化才能呈明顯的正反應。皮膚、指甲、頭發(fā)等遇濃硝酸變黃即為這一反應的結果。第10頁，共29頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三操作步驟: 一、取一支試管加4滴0.5%苯酚溶液，再加濃硝酸2滴，觀察黃色出現(xiàn)，冷卻后逐滴加入10%氫氧化鈉溶液，觀察顏色轉變?yōu)槌壬?二、取一支試管加蛋白質溶液4滴及濃硝酸2滴，由于強酸的作用，開始蛋白

6、質形成白色沉淀，小火加熱，則沉淀變?yōu)辄S色，冷卻，逐滴加入10%氫氧化鈉溶液，顏色由黃色轉變成深橙黃色。 三、剪少許指甲或頭發(fā)放入試管中，加入數(shù)滴濃硝酸，觀察顏色變化。第11頁，共29頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三管號1234材料0.5苯酚雞蛋清液指甲頭發(fā)量（滴)44少許少許濃硝酸（滴）422020現(xiàn)象加入NaOH后現(xiàn)象變化黃色反應第12頁，共29頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三、坂口反應 (Sakaguchi reaction原理 在次溴酸鈉或次氯酸鈉存在的條件下，許多含有胍基的化合物 能與-萘酚發(fā)生反應生成紅色物質。在20種氨基酸中唯有精氨酸含有胍基，所以只有它

7、呈正反應。 第13頁，共29頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三 生成的氨被次溴酸鈉或次氯酸鈉氧化生成氮。該反應中過量的次溴酸鈉或次氯酸鈉是不利的，因其能進一步緩慢氧化，使產物破裂分解，引起顏色消失。但加入適量尿素可破壞過量的次溴酸鈉。 該反應靈敏度達 1：250 000。因此常用于定量測定精氨酸的含量和定性鑒定含有精氨酸的蛋白質。第14頁，共29頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三操作步驟 取3支試管，分別加入1mL蒸餾水、0.3%精氨酸溶液和蛋白溶液，各加20%氫氧化鈉溶液5滴，1%-萘酚酒精溶液3滴，次氯酸鈉溶液6滴，搖勻，放置片刻，觀察出現(xiàn)的顏色。第15頁，共29頁

8、，2022年，5月20日，22點8分，星期三試劑（滴）管號H2O0.3精氨酸蛋白質溶液20NaOH 萘酚NaClO現(xiàn)象記錄005536050536500536坂口反應第16頁，共29頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三、乙醛酸反應 (Adamkiewica-Hopkins-Cole reaction) 原理 在濃硫酸存在下，色氨酸與乙醛酸反應生成紫色物質，反應機理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸與兩分子色氨酸脫水縮合形成與靛藍相似的物質。色氨酸在濃硫酸中與一些醛類反應也形成有色物質。很多人用含有少量醛雜質的冰醋酸或芳香醛等進行此反應。第17頁，共29頁，2022年，5月20日，22點8分

9、，星期三操作步驟向試管中加數(shù)滴蛋白質溶液，再加冰醋酸 (常含有少量乙醛酸或醛類)約1mL并混勻傾斜試管，謹慎地沿著管壁加濃硫酸(AR)約1mL，使其重迭，且勿使二者混合。靜置后，觀察在兩液界面上出現(xiàn)的紅紫色環(huán)，于水浴中微熱，可加快色環(huán)形成。用20%的白明膠作乙醛酸反應。觀察結果。第18頁，共29頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三 試劑 （滴）管號白明膠蛋白質溶液（滴）冰醋酸（ml）濃硫酸（ml）現(xiàn)象記醛酸反應第19頁，共29頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三、偶氮反應 (Azo reaction) 原理偶氮化合物 (偶氮試劑)與酚核或咪唑環(huán)結合

10、產生有色物質。它與酪氨酸和組氨酸反應的產物分別為紅色和櫻桃紅色。含有酪氨酸和組氨酸的蛋白質也有此反應。第20頁，共29頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三操作步驟 取2支試管，分別加入0.3%組氨酸溶液和純雞蛋清各4滴，再各加入新配制的重氮試劑8滴搖勻，加入2滴20%氫氧化鈉溶液，再搖勻。過幾分鐘，觀察顏色的形成，一般出現(xiàn)櫻桃紅色。 第21頁，共29頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三 試劑 （滴）管號0.3組氨酸（滴）雞蛋清（滴）偶氮試劑 20NaOH溶液 現(xiàn)象記錄14822482偶氮反應第22頁，共29頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三反應名稱反應基團反應產

11、物及現(xiàn)象用途雙縮脲反應肽鍵Cu雙縮脲絡合物（蘭紫色）測蛋白質含量和鑒定蛋白質水解 是否完全茚三酮反應 -氨基酸蘭紫色 測AA含量、檢驗AA及蛋白質 黃色反應苯環(huán)、Trp、Tyr黃色硝醌酸生成 鑒定Trp、Tyr 坂口反應 胍基 玫瑰紅色產物生成 鑒定Arg測定Arg含量 乙醛酸反應吲哚環(huán)中間生成蘭紫色環(huán)鑒定Trp偶氮反應咪唑基、酚核鮮紅色物質生成鑒定His、Tyr第23頁，共29頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三試劑和器材一、試劑1.蛋白質溶液：取5mL蛋清，用蒸餾水稀釋至100mL，攪拌均勻后，用紗布過濾。2.0.1%茚三酮乙醇溶液：稱取0.1g茚三酮，溶于100mL95%乙醇。

12、臨用前配制。3.尿素粉末 4.1%硫酸銅溶液5.10%氫氧化鈉溶液和20%氫氧化鈉溶液6.0.5%苯酚溶液第24頁，共29頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三7.濃硝酸和濃硫酸(A.R.) 8.0.1%茚三酮水溶液9.0.3%精氨酸溶液、0.3%組氨酸溶液、0.5%甘氨酸10.純雞蛋清11.1%-萘酚乙醇溶液，臨用時配制12.冰醋酸13.20%明膠溶液14.次氯酸鈉溶液15.重氮試劑：溶液 A：溶解5g亞硝酸鈉于1 000mL水中。溶液 B：溶解5g對氨基苯磺酸于1 000mL水中。溶解后，再加入5mL濃硫酸。A、B溶液分別保存于密閉瓶內。需用時，以1：1的比例混合。第25頁，共29頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三二、器材 1.試管及試管架 2.水浴鍋3.酒精燈 4.量筒(10mL) 5.濾紙片 6.烘箱第26頁，共29頁，2022年，5月20日，22點8分，星期三 實驗注意事項：1.本次實驗內容繁多，請嚴格按步驟操作，并做好實驗報告。2.本次實驗是定性實驗，各種實驗的現(xiàn)象都可能發(fā)生，要細心觀察。3.本次實驗有的試劑具強腐蝕性和刺激