老年缺血性腦卒中患者eNOS基因VNTR多態(tài)性研究

1、老年缺血性腦卒中患者eNOS基因VNTR多態(tài)性研究【摘要】目的討論老年缺血性腦卒中與內(nèi)皮細(xì)胞型一氧化氮合酶eNS基因變數(shù)串聯(lián)重復(fù)序列VNTR多態(tài)性的關(guān)系。方法選擇老年缺血性腦卒中患者112例作為病例組，同期選擇年齡與性別相匹配的安康志愿者或其他住院患者105例作為對(duì)照，通過(guò)PR技術(shù)和聚丙烯酰胺電泳來(lái)確定其基因型。結(jié)果病例組eNS基因ab基因型的頻率明顯高于對(duì)照組(22.3%vs12.4%，P0.05)，a等位基因的頻率也高于對(duì)照組12.9%vs7.0%，P0.05。結(jié)論ab基因型與老年缺血性腦卒中有相關(guān)性，a等位基因可能是中國(guó)老年缺血性腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素?！娟P(guān)鍵詞】一氧化氮合酶；基因多態(tài)性；

2、VNTR；老年；缺血性腦卒中血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶NS編碼基因存在多種基因多態(tài)性。其中，第4號(hào)內(nèi)含子27個(gè)堿基的變數(shù)串聯(lián)重復(fù)序列VNTR多態(tài)性與血漿一氧化氮N程度親密相關(guān)，該多態(tài)性與心腦血管病的相關(guān)性研究較多，但結(jié)論并不一致。atyar等1研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞型NS(eNS)4a/b基因多態(tài)性是南部土耳其人冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而Vasilaku等2發(fā)如今希臘人中該基因多態(tài)性與早發(fā)的冠心病沒(méi)有相關(guān)性。本研究的目的是討論eNS基因VNTR多態(tài)性與中國(guó)老年缺血性腦卒中的關(guān)系。1對(duì)象與方法1.1研究對(duì)象1.1.1入選標(biāo)準(zhǔn)選擇2002年712月在青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院的112例老年缺血性腦卒中患者作

3、為病例組,其中36例短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)，76例腦梗死，均行頭顱RI和/或T掃描明確診斷，符合1996年第四屆全國(guó)腦血管病會(huì)議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除腦出血和占位性病變。選取同期住院的其他疾病患者和安康志愿者105例作為對(duì)照。對(duì)照組均無(wú)腦卒中或冠心病病史。病例組平均年齡(64.911.2)歲，男62例；對(duì)照組平均年齡(63.911.9)歲，男53例，兩組的年齡與性別相匹配,入選對(duì)象均行血糖、血脂等檢查。1.1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)高血壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)為血壓140/90Hg或正服用降壓藥物；糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)為空腹血糖7.0l/L或服用降血糖藥物；吸煙的標(biāo)準(zhǔn)為正在吸煙5支/d或有吸煙史，血脂異常的標(biāo)準(zhǔn)為總膽固醇

4、(T)5.62l/L和/(或)甘油三酯(TG)1.92l/L或服用降血脂藥物。1.2方法1.2.1提取基因組DNA入選者均于清晨空腹抽取靜脈血1l,加20lEDTA濃度150ng/l抗凝，4冰箱短期存放。采用UltraPureT基因組DNA提純?cè)噭┖斜本┵惏偈⒐鞠M(fèi)，提取的基因組DNA置于-20保存。1.2.2目的基因片段PR擴(kuò)增方法1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料組間比擬用非配對(duì)的t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比擬用2檢驗(yàn)，應(yīng)用Lgisti回歸分析計(jì)算比數(shù)比并進(jìn)展危險(xiǎn)因素獨(dú)立性分析。2結(jié)果2.1病例組與對(duì)照組各種危險(xiǎn)因素比擬吸煙、高血壓、糖尿病等在病例組的比例均較對(duì)照組高P0.05。血

5、脂異常發(fā)生率在病例組也較高，但無(wú)顯著性差異P0.05，見(jiàn)表1。表1兩組各危險(xiǎn)因素的比擬n(略)2.2eNS基因VNTR多態(tài)性電泳結(jié)果eNS基因VNTR多態(tài)性主要有2種等位基因，27bp的序列重復(fù)4次為a，重復(fù)5次為b，在電泳圖中分別為417bp和444bp的片段，從而構(gòu)成3種基因型(aa，ab，bb)，見(jiàn)圖1。2.3兩組eNS基因型和等位基因頻率的比擬病例組與對(duì)照組的ab基因型頻率分別為22.3%和12.4%，兩者比擬有顯著差異(P0.05)。a等位基因頻率在病例組為12.9%，較對(duì)照組(7.0%)明顯偏高P0.05)，見(jiàn)表2。表2卒中組與對(duì)照組的基因型及等位基因頻率比擬n(略)2.4病例組各

6、種危險(xiǎn)因素的獨(dú)立性分析病例組各危險(xiǎn)因素及eNSVNTR多態(tài)性的比數(shù)比R分析及95可信區(qū)間95%I，見(jiàn)表3。通過(guò)對(duì)各種危險(xiǎn)因素的多元Lgisti回歸分析發(fā)現(xiàn)，高血壓、糖尿并吸煙及ab基因型與老年缺血性腦卒中均明顯相關(guān)，是老年缺血性腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。表3病例組各危險(xiǎn)因素以及ab基因型的R值及95I略轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3討論NS是N合成的關(guān)鍵酶，可催化精氨酸代謝為N和瓜氨酸。根據(jù)細(xì)胞和組織來(lái)源分為3種：神經(jīng)元型(nNS)、內(nèi)皮細(xì)胞型(eNS)和免疫型NS(iNS)。eNS主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，可以被多種介質(zhì)激活，包括乙酰膽堿、P物質(zhì)、組氨、精氨酸、血管加壓素、緩激肽、前列腺素F和內(nèi)皮素R

7、等。eNS的激活導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞中N的產(chǎn)生增加，并引起一系列的生物學(xué)效應(yīng)，如舒張平滑肌細(xì)胞，抑制血小板聚集和黏附于血管內(nèi)皮，抑制血管平滑肌細(xì)胞的增生，阻礙低密度脂蛋白的過(guò)氧化而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用等。N還可通過(guò)抑制內(nèi)皮素和血管緊張素的產(chǎn)生從而抑制血管平滑肌細(xì)胞的增生。人類eNS的編碼基因位于第7號(hào)染色體長(zhǎng)臂7q36，含有26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子，總長(zhǎng)21kb，編碼產(chǎn)物為含有1203個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。該基因存在多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中研究最多的是4號(hào)內(nèi)含子的VNTR多態(tài)性、7號(hào)外顯子G849T多態(tài)性和啟動(dòng)子區(qū)T786多態(tài)性。VNTR多態(tài)性主要有2種等位基因，27bp的序列重復(fù)4次為a，重復(fù)5次為b，

8、從而構(gòu)成3種基因型(aa，ab，bb)。eNS基因多態(tài)性可影響eNS的功能，導(dǎo)致血管系統(tǒng)中N濃度改變，并由此影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和開(kāi)展，因此可能與冠心病和缺血性腦血管疾病有關(guān)。eNS基因不同位置的變異與心腦血管疾病的相關(guān)性不同。1996年ang等4發(fā)現(xiàn)，澳大利亞長(zhǎng)期吸煙者的eNS第4號(hào)內(nèi)含子基因多態(tài)性與冠心病關(guān)系親密，吸煙和eNS4a/a分別在環(huán)境和遺傳方面是導(dǎo)致冠心病的主要因素。Lee等5對(duì)韓國(guó)男性冠狀動(dòng)脈疾病病人暷研究也發(fā)現(xiàn)eNS基因a/b多態(tài)性與小于51歲的男性患者的冠狀動(dòng)脈疾病的開(kāi)展有相關(guān)性。Sali等6發(fā)現(xiàn)冠心病患者的等位基因a的頻率明顯高于對(duì)照組。Hu等7對(duì)中國(guó)人的研究，證實(shí)了e

9、NS第4號(hào)內(nèi)含子基因多態(tài)性可能是中國(guó)人缺血性腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，在無(wú)常見(jiàn)危險(xiǎn)因素的缺血性腦血管病患者中尤為顯著。eNS基因多態(tài)性與冠心并心肌梗死的關(guān)系得到了多國(guó)學(xué)者的肯定，但也存在分歧。德國(guó)學(xué)者Sigush等8栐1043例歐洲人的研究說(shuō)明，冠心病及其嚴(yán)重程度與eNS4a/b多態(tài)性無(wú)相關(guān)性。Yahashi等9對(duì)日本人該基因多態(tài)性與缺血性卒中的關(guān)系進(jìn)展了研究，127例患者其中18例為血栓栓塞，58例為腔隙性腦梗死，51例為無(wú)病癥性腔隙性腦梗死與91例對(duì)照的b等位基因頻率之比為0.862/0.868，缺血性卒中亞組中等位基因的頻率之比為0.889/0.862/0.853，其差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。aLed等10在361例缺血性卒中患者與236例對(duì)照中，對(duì)eNS基因7號(hào)外顯子的G894T多態(tài)性進(jìn)展了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)NN基因型在兩組中的分布無(wú)差異，提示該多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死和TIA無(wú)關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)老年缺血性腦卒中組ab基因型的頻率較對(duì)照組明顯增高22.3%vs12.4%，a等位基因的頻率在病例組也明顯偏高12.9%vs7.0%。用多元Lgis