甲基亞砷酸對(duì)內(nèi)皮型一氧化氮合酶磷酸化影響

1、甲基亞砷酸對(duì)內(nèi)皮型一氧化氮合酶磷酸化影響【關(guān)鍵詞】甲基亞砷酸(a)；砷中毒；ens磷酸化；活性氧自由基(rs)摘要：目的觀察無(wú)機(jī)砷的活性中間產(chǎn)物甲基亞砷酸(a)對(duì)牛主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(bae)的內(nèi)皮型一氧化氮合酶(ens)磷酸化以及活性氧自由基(rs)產(chǎn)生的影響。方法培養(yǎng)的bae分別暴露于a(075l/l，015in)；亞砷酸鈉(ias，100ll，060in)；或n乙酰半胱氨酸na，1ll)預(yù)處理2h后，再暴露于a(075ll，015in。收獲細(xì)胞懸液進(jìn)展ens磷酸化蛋白的esternblt分析；應(yīng)用二氯二乙酰熒光素法(h2dfda)觀測(cè)細(xì)胞內(nèi)的rs產(chǎn)生。結(jié)果bae暴露于a(075ll)15

2、in后，ensser1179磷酸化顯著增加p005)，na預(yù)處理(1ll)可以抑制這一現(xiàn)象；ias暴露也可以誘導(dǎo)ensser1179磷酸化p005)，但是需要高濃度和更長(zhǎng)的暴露時(shí)間(100ll，30in)；a(075ll)暴露可以誘導(dǎo)bae產(chǎn)生rs，na預(yù)處理(1ll)可以抑制這一現(xiàn)象。結(jié)論a暴露可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生rs以及rs依賴性ens磷酸化。關(guān)鍵詞：甲基亞砷酸(a)；砷中毒；ens磷酸化；活性氧自由基(rs)studynensphsphrylatininduedbynethylarsnusaidlibing,angyi,sunguifan.departentfupatinalhealth,

3、shlfpublihealth,hinaedialuniversity(shenyang110001,hina)abstrat：bjetivetbservetheeffetsfnethylarsnusaid(a)nensphsphrylatinandreativexygenspeies(rs)generatininbvineartiendthelialells(bae).ethdsulturedbaeasexpsedta(075l/l,015in)ithutrithaetylysteine(na)pretreatent(1l/l,2h),rias(100l/l,060in).esternblt

4、raellularrsgeneratinasassessediththefluresentprbe,2,7dihlrdihydrflureseindiaetate(h2dfda).resultsa(075l/l)ausedarapidinreaseinphsphrylatedensser1179at15inafterexpsure(p005).inntrast,upt100l/liasausedtheinreasefphsphrylatedensser1179at30in(p005).astiulat

5、edthersprdutininliveells.bththeainduedensser1179phsphrylatinandrsgeneratinereblkedbynapretreatent(1l/l,2h).nlusinaexpsureaninduersgeneratinandrsdependentensphsphrylatin.keyrds：nethylarsnusaid(a);arsenipisn;ensphsphrylatin;reativexygenspeies(rs)無(wú)機(jī)砷的體內(nèi)代謝中間產(chǎn)物甲基亞砷酸(a)比無(wú)機(jī)砷的細(xì)胞毒性和遺傳毒性更強(qiáng)1，因此其毒性效應(yīng)是砷中毒發(fā)病機(jī)制研究的

6、一個(gè)新熱點(diǎn)。研究說(shuō)明，無(wú)機(jī)砷可以激活人類角質(zhì)細(xì)胞和白血病jurkat細(xì)胞的內(nèi)皮型一氧化氮合酶(ens)磷酸化2，3，還可以誘導(dǎo)產(chǎn)生h22和超氧陰離子自由基(-2)等活性氧自由基(rs)4。本研究觀察a對(duì)牛主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(bae)的ens磷酸化以及rs產(chǎn)生的誘導(dǎo)作用。1材料與方法11主要試劑和儀器a(h3as，獲贈(zèng)自加拿大ullenr實(shí)驗(yàn)室)；亞砷酸鈉(ias，ak)；n乙酰半胱氨酸(na，ak)；二氯二氫二乙酰熒光素(h2dfda，leularprbes)；2細(xì)胞培養(yǎng)箱(kendr)；電泳儀和轉(zhuǎn)膜裝置(att)；共聚焦熒光顯微鏡(leiairsystes)。12細(xì)胞培養(yǎng)bae培養(yǎng)于高糖培養(yǎng)

7、基def12)(siga)，添加成分包括10胎牛血清、10u/l青霉素和100g/l鏈霉素、10u/l肝素和5ng/l成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。37，52常規(guī)培養(yǎng)。13ens磷酸化的esternblt分析暴露因素包括a(075l/l，015in)；ias(100ll，060in)；或na(1ll)預(yù)處理2h后，再暴露于a(075ll，015in)。參加細(xì)胞裂解液收獲細(xì)胞懸液，低溫離心后取上清凍存?zhèn)溆谩Ｊ榛撬徕csds聚丙烯酰胺凝膠后進(jìn)展蛋白印跡esternblt分析。特異性一次抗體為抗phsphensser1179抗體和抗ens抗體(分別1：1000稀釋)；特異性二次抗體為hrp標(biāo)記的抗兔或抗小

8、鼠二次抗體。自顯影膠片掃描后用adbephtshp701軟件處理輸出，并進(jìn)展定量分析。共進(jìn)展獨(dú)立實(shí)驗(yàn)3次。14細(xì)胞內(nèi)rs產(chǎn)生的熒光測(cè)定應(yīng)用熒光染料h2dfda。詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟為：80交融的bae細(xì)胞參加5llh2dfda孵育20in后暴露a(075ll，015in)；或na(1ll)預(yù)處理2h的最后20in參加h2dfda共同孵育，然后暴露于a(075ll，015in)。用倒置熒光顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞內(nèi)的rs產(chǎn)生。激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為480和527n。共進(jìn)展獨(dú)立實(shí)驗(yàn)3次。15統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用spss100統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展單因素方差分析和q檢驗(yàn)。2結(jié)果21a或ias暴露對(duì)ensser1179磷酸化的影響ba

9、e暴露于075lla15in后，ensser1179磷酸化顯著增加p005)，為對(duì)照組的141倍(圖1)。而一樣實(shí)驗(yàn)條件下，100llias暴露30in才可誘導(dǎo)ensser1179磷酸化p005)，為對(duì)照組的132倍(圖2)。各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞內(nèi)總ens蛋白含量沒(méi)有變化。a：esternblt的典型結(jié)果圖1a暴露對(duì)ensser1179磷酸化的誘導(dǎo)作用略a：esternblt的典型結(jié)果圖2ias暴露對(duì)ensser1179磷酸化的誘導(dǎo)作用略22a暴露誘導(dǎo)rs依賴性ensser1179磷酸化和細(xì)胞內(nèi)rs產(chǎn)生na預(yù)處理(1ll)抑制a(075nll)暴露誘導(dǎo)的ensser1179磷酸(圖3)。df熒光檢測(cè)

10、法說(shuō)明，a(075ll)暴露確實(shí)可以誘導(dǎo)bae產(chǎn)生藍(lán)綠色熒光，提示有rs的生成，并且na預(yù)處理(1ll)后，藍(lán)綠色熒光顯著減弱，提示rs生成可以被抑制。圖3na預(yù)處理抑制a暴露誘導(dǎo)的ensser1179磷酸化略3討論ser1179是ens分子2個(gè)最重要的磷酸化位點(diǎn)之一。研究說(shuō)明，ser1179磷酸化通過(guò)在ser1179基團(tuán)增加一個(gè)負(fù)電荷而增加ens復(fù)原酶區(qū)域的電子流動(dòng)、以及降低鈣調(diào)蛋白ens復(fù)合物解離這兩個(gè)方面，引起ens活化5。ens磷酸化對(duì)于機(jī)體的ens活化具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，075lla暴露15in后，ensser1179磷酸化顯著增加，提示a暴露初期可能誘導(dǎo)體內(nèi)的ens活化。ia

11、s暴露也可以誘導(dǎo)ensser1179磷酸化，但是需要高濃度和更長(zhǎng)的暴露時(shí)間，提示ias的細(xì)胞效應(yīng)可能是通過(guò)其代謝中間產(chǎn)物a間接作用的結(jié)果。本研究中，a誘導(dǎo)產(chǎn)生的ensser1179磷酸化可以被抗氧化劑na有效抑制，提示內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的rs可能在其中發(fā)揮作用。進(jìn)一步應(yīng)用df熒光檢測(cè)觀測(cè)到a(075ll)暴露產(chǎn)生的熒光，并且這種熒光也可以被na預(yù)處理所抑制，提示a暴露激活ensser1179磷酸化具有rs依賴性。本研究說(shuō)明，a暴露可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生rs以及rs依賴性ens磷酸化。(本研究得到中日川醫(yī)學(xué)研究者制度的支持和日本筑波大學(xué)熊谷嘉人教授的指導(dǎo)，在此一并表示感謝)參考文獻(xiàn)1vaskenapshi

12、anh,zakharyanra,avrad,etal.arevieftheenzylgyfarsenietablisandaneptentialrlefhydrgenperxideinthedetxiatinfthetrivalentarsenispeiesj.txilapplpharal,2022,198:327-335.2suzak,addkda,zhangq,etal.arseniteativatinfp13k/aktellsurvivalpathayisediatedbyp38inulturedhuankeratinytesj.led,2001,7:767-772.3hssaink,akhandaa,kaaty,etal.aspaseativatinisaeleratedbytheinhibitinfarseniteindued,ebraneraftsdependentaktativatinj.freeradibiled,2022,34:598-606.4kuagaiy,pij.leularbasisfrarseniinduedalteratininnitrixideprdutinandxidativestress:ipliatinfendtheli