吸光光度法 (2)講稿

1、關(guān)于吸光光度法 (2)第一張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月原子吸收光譜法（或吸光光度法或分光光度法）分子吸收光譜法紫外可見光分光光度法紅外分光光度法核磁共振譜法 1、定義：基于物質(zhì)對光的選擇性吸收的分析方法 吸光光度法概述第二張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2、特點：（1）靈敏度高：10-310-6molL-1，適用微量組分的測定。（2）準(zhǔn)確度高：比色分析，相對誤差510%，分光光度法，25%；（3）應(yīng)用廣泛：可測定幾乎所有無機(jī)物和許多有機(jī)物；生產(chǎn)、科研廣泛應(yīng)用。（4）操作簡便、儀器設(shè)備易普及。第三張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/6*3、原理：利用物

2、質(zhì)的顏色深淺與濃度的關(guān)系確定其含量 許多物質(zhì)具有顏色， 例如 MnO4- 粉紅Cr2O72-橙黃FeSCN2+血紅顏色深淺與濃度有關(guān). 第四張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月4、光學(xué)光譜區(qū)（真空紫外）遠(yuǎn)紅外中紅外近紅外可見近紫外遠(yuǎn)紫外10nm200nm中層電子200nm 400nm價電子400nm 800nm價電子800 nm 2.5 m分子振動2.5 m 50 m分子振動50 m 300 m分子轉(zhuǎn)動第五張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/655、可見光： (1)單色光：某一波長的光 (2)白光：七色光按不同比例混合的復(fù)合光(3)互補(bǔ)光：按一定比例混合為白光的兩種光

3、 紫外 | 紫 | 藍(lán) | 青 | 綠 | 黃 | 橙 | 紅 | 紅外 400 450 480 500 560 600 650 750 nm 第六張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/66、物質(zhì)顏色與光互補(bǔ)色光：把兩種適當(dāng)顏色的光按一定的強(qiáng)度比例混合，成為白光，稱為互補(bǔ)色光。無色：對光譜中各種色光透過程度相同。有色：物質(zhì)的顏色由它透過或反射的光決定。黑色:幾乎吸收所有的入射光。白色:幾乎全部反射入射光。第七張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/6/nm顏色互補(bǔ)光400-450紫黃綠450-480藍(lán)黃480-490青藍(lán)橙490-500青紅500-560綠紅紫

4、560-580黃綠紫580-610黃藍(lán)610-650橙青藍(lán)650-760紅青不同顏色的可見光波長及其互補(bǔ)光第八張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/68如：KMnO4溶液呈紫紅色，是因為其吸收了白光中的綠色光，透過其互補(bǔ)色紫紅色光；CuSO4溶液呈藍(lán)色，是因為其吸收了黃色光，透過其互補(bǔ)色藍(lán)色光。 光的互補(bǔ)：藍(lán) 黃第九張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/68.1 光的吸收基本定律 朗伯-比爾（Larnbert-Beer）定律一 朗伯-比耳定律(光吸收的基本定律)1. 透光率T和吸光度A 當(dāng)強(qiáng)度為I0 的一束平行單色光通過任何均勻、非散射性的吸光物質(zhì)時，一部分

5、被吸收(強(qiáng)度為Ia),一部分被透過(強(qiáng)度為It同時還有部分被折射或反射(強(qiáng)度可略)。則第十張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/62. 朗伯-比爾定律A=LcA 吸光度(absorbance)L 介質(zhì)厚度(length/cm)c 濃度(concentration) 吸光系數(shù)(absorptivity)第十一張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/62）吸光系數(shù)(Absorptivity)的單位: Lmol-1cm-1當(dāng)c的單位用molL-1表示時，用k表示. k摩爾吸光系數(shù)(Molar absorptivity) A bc 摩爾吸光系數(shù)k的物理意義：它表示物質(zhì)

6、的濃度為1molL-1、液層的厚度為1cm時，溶液的吸光度。通常配制低濃度的溶液，測得A后，通過計算求得。第十二張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/63）吸光度(A)、透光率(T)與濃度(c)的關(guān)系A(chǔ)TcA=bc線性關(guān)系第十三張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/6（1）吸收物質(zhì)在一定波長和溶劑條件下的特征常數(shù)；（2）不隨濃度c和光程長度L的改變而改變。在溫度和波長等條件一定時， 僅與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，與待測物濃度無關(guān)；（3）同一吸收物質(zhì)在不同波長下的值是不同的。在最大吸收波長max處的摩爾吸收系數(shù)max表明了該吸收物質(zhì)最大限度的吸光能力，也反映了光

7、度法測定該物質(zhì)可能達(dá)到的最大靈敏度。 5.摩爾吸收系數(shù)的討論第十四張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/67.朗伯-比爾定律的分析應(yīng)用(Analytical applications of Lambert-Beers law) 0 1 2 3 4 mol/LA。 。 。 。*0.80.60.40.20溶液濃度的測定A LcA c工作曲線法(校準(zhǔn)曲線)Calibration curve第十五張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/6偏離比耳定律的原因1. 現(xiàn)象 標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定未知溶液的濃度時，發(fā)現(xiàn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線常發(fā)生彎曲（尤其當(dāng)溶液濃度較高時），這種現(xiàn)象稱為對朗伯比

8、耳定律的偏離。2. 引起偏離的因素（兩大類） （1）物理性因素， 即儀器的非理想引起的； （2）化學(xué)性因素。第十六張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/6物理性因素：1、難以獲得真正的純單色光。 分光光度計只能獲得近乎單色的狹窄光帶。復(fù)合光可導(dǎo)致對朗伯比耳定律的正或負(fù)偏離。 非單色光、雜散光、非平行入射光都會引起對朗伯比耳定律的偏離，最主要的是非單色光作為入射光引起的偏離。 第十七張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/62、介質(zhì)不均勻引起的偏離：膠體、乳濁液或懸浮物質(zhì)溶液吸收、散射。第十八張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/6(2) 化學(xué)

9、性因素朗伯比耳定律的假定：所有的吸光質(zhì)點之間不發(fā)生相互作用；僅在稀溶液(c10 -2 mol L-1時，吸光質(zhì)點間可能發(fā)生締合等相互作用，直接影響了對光的吸收。 故：朗伯比耳定律只適用于稀溶液。 溶液中存在著離解、聚合、互變異構(gòu)、配合物的形成等化學(xué)平衡時。使吸光質(zhì)點的濃度發(fā)生變化。 例： CrO42- + 2H+ = Cr2O72- + H2O第十九張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/63.朗伯-比爾定律的適用條件1) 單色光: 應(yīng)選用max處測定2) 吸光質(zhì)點形式不變：離解、絡(luò)合、締合會破壞線性關(guān)系， 應(yīng)控制條件(酸度、濃度、介質(zhì)等)3) 稀溶液： 濃度增大，分子之間作用

10、增強(qiáng)第二十張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/6*7、吸收曲線與最大吸收波長 分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性使其對不同波長光的吸收程度不同，用不同波長的單色光照射，測吸光度 吸收曲線與最大吸收波長 max；吸收曲線：測量某種物質(zhì)對不同波長單色光的吸收程度，以波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到的一條吸收光譜曲線。第二十一張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月*吸收曲線的討論：（1）同一種物質(zhì)對不同波長光的吸光度不同。吸光度最大處對應(yīng)的波長稱為最大吸收波長max（2）不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲線形狀相似max不變。而對于不同物質(zhì)，它們的吸收曲線形狀和max則不同，判斷干擾。（3）吸收

11、曲線可以提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，并作為物質(zhì)定性分析的依據(jù)之一。第二十二張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月*吸收曲線的討論：（4）不同濃度的同一種物質(zhì)，在某一定波長下吸光度 A 有差異，在max處吸光度A 的差異最大。此特性可作為物質(zhì)定量分析的依據(jù)。（5）在max處吸光度隨濃度變化的幅度最大，所以測定最靈敏。吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長的重要依據(jù)。第二十三張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月8.2 目視比色法、分光光度法及光度計一、目視比色法1、定義：用眼睛比較溶液顏色深淺以測定物質(zhì)含量的方法。2、優(yōu)點：設(shè)備簡單，操作方便，不要求嚴(yán)格遵守比爾定律。3、用途: 用在要求不高的常規(guī)分

12、析中。4、缺點：準(zhǔn)確度不高，標(biāo)準(zhǔn)系列制作麻煩，容易受干擾。第二十四張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/65、測定方法：標(biāo)準(zhǔn)系列法。1）用同質(zhì)材料的比色管 2）配制不同量的標(biāo)準(zhǔn)溶液 3）同量的顯色劑，相同的實驗條件，配成一套標(biāo)準(zhǔn)色階 4）待測物與標(biāo)準(zhǔn)色階的配制條件相同，置于色階中比較顏色度 第二十五張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/6方便、靈敏，準(zhǔn)確度差。常用于限界分析。觀察方向目視比色法c4c3c2c1c1c2c3c4第二十六張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/6二. 光電比色法(colorimetry)通過濾光片(filter)得

13、一窄范圍的光(幾十nm)光電比色計結(jié)構(gòu)示意圖靈敏度和準(zhǔn)確度較差第二十七張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/6三. 吸光光度法(spectrophotometer)光源單色器吸收池檢測系統(tǒng)穩(wěn)壓電源通過棱鏡或光柵得到一束近似的單色光.波長可調(diào), 故選擇性好, 準(zhǔn)確度高.分光光度法的基本部件第二十八張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/6 吸光光度分析法中幾種方法對比方法原理入射光單色器檢測量常用儀器特點目視比色A=Kbc標(biāo)準(zhǔn)系列復(fù)合光透過光強(qiáng)度比色管簡便易行 快速、準(zhǔn)確度低光電比色A=Kbc標(biāo)準(zhǔn)曲線單色光濾光片吸光度透光率光電比色計準(zhǔn)確度較高分光光度A=Kbc

14、標(biāo)準(zhǔn)曲線單色光棱鏡或光柵吸光度透光度分光光度計準(zhǔn)確度高應(yīng)用廣泛第二十九張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/6 光度分析儀器的基本部件無論是光電比色計或分光光度計，都是由以下基本部件組成： 光源 單 色 器 比色皿 光電轉(zhuǎn)換器 檢測器作用產(chǎn)生復(fù)合光 把復(fù)合光變 盛待測液 將透過光轉(zhuǎn) 測量光電流并 成單色光 變?yōu)楣怆娏?將其轉(zhuǎn)為A、T 常用 6-12v鎢絲燈 濾光片 光學(xué)玻璃 光電池、 光電管元件 棱鏡 或光柵 石英玻璃、 光電倍增管 光學(xué)玻璃第三十張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/6四、光度計及其基本部件 分光光度計第三十一張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2

15、022年6月2022/9/6分光光度計第三十二張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/6 基本組成光源單色器樣品室檢測器顯示第三十三張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/6 主要部件圖示：第三十四張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/61. 光源(Light source)：發(fā)出所需波長范圍內(nèi)的連續(xù)光譜，有足夠的光強(qiáng)度,穩(wěn)定。 可見光區(qū)：鎢燈，碘鎢燈(320 2500 nm) 紫外區(qū)：氫燈，氘燈(180 375 nm)2. 單色器(monochromator)：將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的裝置。棱鏡:玻璃350 3200 nm, 石英1

16、85 4000 nm光柵:波長范圍寬, 色散均勻,分辨性能好, 使用方便第三十五張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/635 單色器入射狹縫：光源的光由此進(jìn)入單色器；準(zhǔn)光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行 光束； 色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或 光柵；聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得 單色光聚焦至出射狹縫；出射狹縫：第三十六張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/636單色器棱鏡：依據(jù)不同波長光通過棱鏡時折射率不同800 600 500400第三十七張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/637光柵：在鍍鋁的玻璃表面刻有數(shù)量很大

17、的等寬度等間距條痕(600、1200、2400條/mm )。M1M2出射狹縫光屏透鏡平面透射光柵光柵衍射示意圖原理：利用光通過光柵時發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光.第三十八張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/638光柵第三十九張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/639光柵第四十張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/6第四十一張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/63. 樣品室 樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池。第四十二張，PPT共七

18、十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/64. 檢測系統(tǒng) 將光強(qiáng)度轉(zhuǎn)換成電流來進(jìn)行測量,用光電檢測器測量。要求：對測定波長范圍內(nèi)的光有快速、靈敏的響應(yīng)， 產(chǎn)生的光電流應(yīng)與照射于檢測器上的光強(qiáng)度成正比。第四十三張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/68.3顯色反應(yīng)及顯色條件的選擇顯色反應(yīng)：將待測組分轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩衔锏姆磻?yīng)。顯色劑：與待測組分形成有色化合物的試劑。8.3.1 顯色反應(yīng)的選擇：1)、顯色反應(yīng)的類型：配位反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)。第四十四張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/62)、對顯色反應(yīng)的要求：靈敏度足夠高:105 超高靈敏，=(610)104 高

19、靈敏,=(26)104中等，2104不靈敏選擇性好：顯色劑只與一組分（或少數(shù)組分）顯色顯色劑在測定波長處無明顯吸收，試劑空白小。對比度：兩有色物質(zhì)最大吸收波長之差=|MAXMR-MAXR|60nm化合物組成及化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定以及選擇性好干擾小。第四十五張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/62. 顯色劑無機(jī)顯色劑：硫氰酸鹽、鉬酸銨等。有機(jī)顯色劑：種類繁多偶氮類顯色劑：性質(zhì)穩(wěn)定、顯色反應(yīng)靈敏度高、選擇性好、對比度大，應(yīng)用最廣泛。雙硫腙、偶氮胂III、PAR等。 三苯甲烷類：鉻天青S、二甲酚橙等第四十六張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/63. 顯色條件的選擇cR

20、cRcR1). 顯色劑用量(cM、pH一定)Mo(SCN)32+ 淺紅;Mo(SCN)5 橙紅;Mo(SCN)6- 淺紅Fe(SCN)n3-n用量范圍寬用量范圍窄嚴(yán)格控制R量第四十七張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/62). 顯色反應(yīng)酸度（cM、 cR一定）pH1pH10 +H2D2 紅色 518 Pb2+ + pH8-9 +H2D2 粉色 510 Hg2+ + pH6 +H2D2 橙色 485 2.加入掩蔽劑 測Hg2+ +H2D2 + ( EDTA-Bi3+/KSCN-Ag+ ) Sr-mBCZm +硫脲 -Cu/磺基水揚(yáng)酸Al Fe 第五十一張，PPT共七十三頁，創(chuàng)

21、作于2022年6月2022/9/6513.利用氧化還原反應(yīng),改變干擾離子價態(tài) 鉻天青S+Al3+Vc-Fe3+Fe2+消除Fe3+的干擾 4.利用生成惰性絡(luò)合物 Ni2+ pH=2 NiR 分解 Ni2+ Fe3+ Zn2+ 5.分離干擾元素 6.利用校正系數(shù) 7.利用參比液消除顯色劑, 試劑帶入的干擾 8.選擇適當(dāng)?shù)臏y量波長 第五十二張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/652化學(xué)法 Co2, Fe3+Co2+FeF63-Co(SCN)2 (藍(lán))NaFSCNCo2+Fe2+,Sn4+(2)Sn2+Co(SCN)2SCN測Co2(含F(xiàn)e3+)掩蔽法氧化還原法例:第五十三張，P

22、PT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/6測Co2 (生成絡(luò)合物性質(zhì)不同)Co2+, Zn2+,Ni2+, Fe2+ CoR,ZnR NiR,FeRCoR, Zn2+ ,Ni2+ , Fe2+ 鈷試劑RH+如不能通過控制酸度和掩蔽的辦法消除干擾，則需采取分離法。測Fe3(控制pH)Fe3+, Cu2+FeSS （紫紅）Cu2+pH 2.5SS磺基水楊酸第五十四張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/6 8.4 測量條件的選擇 8.4.1. 選擇適當(dāng)?shù)臏y定波長515655釷-偶氮砷III A絡(luò)合物試劑415500鈷-亞硝基紅鹽 A絡(luò)合物試劑第五十五張，PPT共七十三頁，

23、創(chuàng)作于2022年6月2022/9/62）參比溶液(空白溶液)的選擇：注：采用空白對比消除因溶劑和容器的吸收、光的散射和界面反射等因素對透光率的干擾第五十六張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/68.4.3:吸光度讀數(shù)范圍的選擇選A=0.20.8 T 在 20%65% 之間時, 濃度相對誤差較小， 最佳讀數(shù)范圍濃度相對誤差最小時的透射比Tmin為： Tmin 36.8%, Amin 0.434 通過改變吸收池厚度或待測液濃度，使吸光度讀數(shù)處在適宜范圍。普通分光光度法不適于高含量或極低含量物質(zhì)的測定。第五十七張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/6標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

24、1、制作依據(jù)：比爾定律 A =bc吸光度與吸光物質(zhì)的含量呈正比關(guān)系2、制作方法：在選擇的實驗條件下，從低濃度到高濃度分別測量一系列（不少于5）不同含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測組分的含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，得到一條通過原點的直線，稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線（或工作曲線）。此時再測量待測溶液的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上就可以查到與之相對應(yīng)的被測物質(zhì)的含量。3、標(biāo)準(zhǔn)曲線不通過原點原因：參比選擇不當(dāng)；吸收池厚度不等；吸收池位置不妥；吸收池不清潔等。8.5 吸光光度法的應(yīng)用第五十八張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/6第五十九張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/

25、6一、天然水中亞鐵離子的測定二、飲用水中二氧化氯的測定第六十張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/9/6雙硫腙分光光度法測鎘在強(qiáng)堿性介質(zhì)中，鎘離子與雙硫腙反應(yīng)，生成紅色螯合物，用CHCl3萃取分離后，于518nm處測定其吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。第六十一張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月汞（日本水俁病）（一）雙硫腙分光光度法（二）冷原子吸收法 （三）冷原子熒光法第六十二張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月采樣時，每采集1升水樣應(yīng)立即加入10ml硫酸或7ml硝酸，使水樣pH值低于或等于1。若取樣后不能立即進(jìn)行測定，向每升樣品中加入5%高錳酸鉀溶液4ml，必要時多加一些，使其呈現(xiàn)持久的淡紅色。樣品貯存于硼硅酸玻璃瓶中，廢水樣品應(yīng)加酸至1%。測汞水樣的保存與處理第六十三張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 雙硫腙分光光度法測汞原理有機(jī)汞無機(jī)汞H+,氧化劑95測其吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線定量Hg2+雙硫腙溶液485nm橙色螯合物CCl4 萃取酸性介質(zhì)第六十四張，PPT共七十三頁，創(chuàng)作于2022年6月4-氨基安替比林分光光度法測定微量酚測定原理：pH10.00.2的介質(zhì)中，在鐵氰化鉀的存在下，酚類化合物與4-氨基安替比林（4-AAP）反應(yīng)，生成橙紅色的吲哚酚安替比林染料，在510nm波長處有最大吸收，用比色法定量。該法所測酚類不是總酚，而只是與4-AAP顯色的