3-基因工程的酶學基礎(chǔ)

1、第二章 基因工程的酶學基礎(chǔ)Enzymes1本章節(jié)內(nèi)容第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶第二節(jié) DNA連接酶第三節(jié) DNA聚合酶第四節(jié) DNA修飾酶第五節(jié) 核酸外切酶第六節(jié) 單鏈核酸內(nèi)切酶2本章學習內(nèi)容 重點討論限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶在DNA切割和連接中的應(yīng)用，并簡要介紹其他與基因克隆有關(guān)的其它的重要的酶。 3一、限制性核酸內(nèi)切酶第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。 （Restriction endonuclease）42. 性質(zhì)內(nèi)切酶主要來源于原核生物即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶。形成5-P和3-OH末端 自我保護作

2、用3. 功能細菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）1. 來源56限制性內(nèi)切酶將侵入細菌體內(nèi)的外源DNA進行分解，切成小片斷。（1）限制（Restriction）7細菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識別切割。（2）修飾（Modification） Dam甲基化酶(DNA Adenine Methylase)GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 Dcm甲基化酶(DNA cytosine Methylase)CCAGG或CCTGG序列在第二個C上C5位置上引入甲基89（3）限制與修飾系統(tǒng)相關(guān)的三個基因 hsd R: 編碼限制性內(nèi)切酶 hsd M: 編碼限制性甲基化酶 h

3、sd S: 編碼限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的協(xié)同表達這類酶能識別DNA分子上的特定位點，并將雙鏈DNA切斷這類酶使DNA分子特定位點上的堿基甲基化，即起修飾 DNA的作用。作用是協(xié)同上述兩種酶識別特殊的作用位點。101973年H.O Smith和D. Nathans提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下：二、限制性內(nèi)切酶的命名用屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成3個字母的略語表示寄主菌的物種名，組成酶的基本名稱。大腸桿菌（Escherichia coli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示112. 如果酶存在于一種特殊的菌株中，則將該菌株名的第一個字母加

4、在基本名稱后，若酶的編碼基因位于噬菌體（病毒）或質(zhì)粒上，則用一個大寫字母表示此染色體外遺傳成分。如 Hind ：d菌株 EcoR I ：抗藥性R質(zhì)粒 123. 如果一種特殊的菌株內(nèi)有幾種不同的限制與修復系統(tǒng)，用羅馬字母表示該菌株中發(fā)現(xiàn)某種酶的先后次序。 如Hind ：d菌株中發(fā)現(xiàn)的第二個酶4. 所有的限制酶，除以上名稱外還要冠以系統(tǒng)名稱。限制性內(nèi)切酶的系統(tǒng)命名為R，甲基化酶為M。如 R.Hind 表示限制性內(nèi)切酶 M.Hind 表示相應(yīng)的甲基化酶實際應(yīng)用中，R常被省略。13 型限制性內(nèi)切酶 目前鑒定出四種不同類型的限制性內(nèi)切酶。主要的三種：三、限制性內(nèi)切酶的類型 型限制性內(nèi)切酶 型限制性內(nèi)切酶

5、 14首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年從大腸桿菌 B株和 K株分離的。（1）識別位點序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC1. 型限制性內(nèi)切酶的基本特性 如 EcoB和 EcoK。未甲基化修飾的特異序列。15需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）（3）輔助因子在距離特異性識別位點約10001500 bp處隨機切開一條單鏈，不產(chǎn)生特異片斷，應(yīng)用不大Recognize sitecut1-1.5kb（2）切割位點16首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來。（1）識別位點序列未甲基化修飾的雙鏈D

6、NA上的特殊靶序列（多數(shù)是呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型的回文結(jié)構(gòu)）。與DNA的來源無關(guān)，即沒有種的特異性。2. 類限制性內(nèi)切酶的基本特性 分離的第一個酶是Hind 基因工程用途最大17稀有切割限制酶（rare cutter）可以識別6個以上的核苷酸序列的少數(shù)的限制內(nèi)切酶。如Not I （GCGGCCGC）某些限制性內(nèi)切酶的識別序列中，某一個或兩個堿基并非嚴格專一。如Hind 可識別4種核苷酸序列： Y: C或T R: A 或GGTYRAC -35-18EcoR I 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5Pst I 5-CTGCAG-3 3-GACGTC-5 產(chǎn)生粘性末端EcoR V 5-GATATC

7、-3 3-CTATAG-5 產(chǎn)生平齊末端（2）切割位點切開雙鏈DNA，形成粘性末端（sticky end）或平齊末端（blunt end）。如：識別位點處19含有幾個核苷酸單鏈的末端。分兩種類型：GAATTC CTTAA GG AATTCCTTAAG5-33-55-33-51 粘性末端（sticky ends，cohensive ends） 5端凸出（如EcoR I切點）20CTGCAG GACGTC5-33-55-33-5CTGCA G G ACGTC） 3端凸出（如Pst I切點）21i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補就可以連接。ii）同一個DNA分子內(nèi)連接：通過兩個相同的粘性末端

8、可以連接成環(huán)形分子。這比連接兩個平齊末端容易得多。2 粘性末端的意義 連接便利2223B 末端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個多聚核苷酸的尾巴（如dA和dT），即同聚物加尾造成人工粘性末端。A 末端可用DNA多核苷酸激酶進行32P標記。粘性末端可以用DNA聚合酶補平成平齊末端。 末端標記 補平成平齊末端243 平齊末端（blunt end）在識別序列的對稱軸上同時切割5-GATATC -33-5CTATAG 如EcoR V254 平齊末端的特點連接困難，連接效率低，只有粘性末端連接效率的1%，這種連接常出現(xiàn)多聯(lián)體連接。粘性末端與平齊末端連接的處理方法）添補法： 利用DNA聚合酶 (klenow fr

9、agment）將堿基添補到目的基因的粘性末端上。26）削除(平)法 利用S1和Bal31等核酸酶將目的基因粘性末端的單鏈突出部分削去，使其成為平齊末端27不同來源的酶，識別相同的序列，切割方式相同或不同。識別位點和切點完全相同如Hind 和Hsu IHind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-55 同裂酶（Isoschizomer) 完全同裂酶：28Xma I 5-CCCGGG -3 3-GGGCCC-5Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5識別位點相同，但切點不同。如Xma I 和 Sma I。 不完全同裂酶：29識

10、別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5BamH IBcl I5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5 5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5Bgl 5-UGATCY-3 3-YCTAGU-5 Xho U代表嘌呤；Y代表嘧啶。6 同尾酶(Isocaudamers）305-GATC-3 3-CTAG-5 Sau 3A同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點一般不能再被原來的酶識別。5-G3-CCTAGGATCT-3 A-5BamH IBgl 5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5BamH IBgl S

11、au 3A31限制性內(nèi)切酶的識別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強度、pH等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力和位點的專一性。如果改變反應(yīng)條件就會影響酶的專一性和切割效率，稱為星號（*）活性。所以一般使用專一的反應(yīng)緩沖液。 7 限制酶的酶活性 星號（*）活性32EcoR I和BamH I等都有*活性。在低鹽、高pH（8）時可識別和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoR I：使用的時候要特別注意！733 誘發(fā)星號（*）活性的原因）高甘油含量）內(nèi)切酶用量過大）低離子強度）高pH）含有機溶劑，如乙醇）Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+等二價陽離子的存在酶量不宜過多，盡量遵循生產(chǎn)

12、商推薦的反應(yīng)條件34在離它的不對稱識別位點一側(cè)的特定距離處切割DNA雙鏈。移動切割（shifted cleavage):GACGCNNNNN Hga ICTGCGNNNNNNNNNN538s型限制性內(nèi)切酶35（3）型限制性內(nèi)切酶不具有甲基化功能型酶的甲基化修飾活性由相應(yīng)的甲基化酶承擔。它們識別相同的DNA序列，但功能不同。如 EcoR I限制性內(nèi)切酶和EcoR I甲基化酶前者：5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5后者：5-GAA*TTC-3 3-CTT*AAG-5作用的位點也不相同36（4） II型限制性內(nèi)切酶對單鏈DNA的切割定義為切割雙鏈DNA，但有一些還可以特異識別并切割單鏈DNA

13、的相應(yīng)位點，只是切割效率比較低如：Hha切割單鏈DNA比切割雙鏈DNA效率低50373. 類限制性內(nèi)切酶 在完全肯定的位點切割DNA，但反應(yīng)需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。在基因工程操作中用途不大。EcoP1: AGACCEcoP15: CAGCAG38核酸限制性內(nèi)切酶的類型及主要特性特性 類內(nèi)切酶類內(nèi)切酶類內(nèi)切酶限制和修飾活性單一多功能的酶內(nèi)切酶和甲基化酶分開共同亞基的雙功能酶內(nèi)切酶的蛋白結(jié)構(gòu)3種不同的亞基單一成分2種不同的亞基限制作用所需要的輔助因子ATP、 Mg2+和SAMMg2+ATP、 Mg2+和SAM寄主特異性位點識別序列EcoB：TGA(N)8TGCT EcoK

14、：AAC(N)6GTGC 回文序列（ s型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG39切割位點在距離識別位點至少1000bp處隨機切開一條單鏈位于寄主特異性位點或其附近距寄主特異性位點3端2426bp處酶催轉(zhuǎn)換不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位點寄主特異性位點寄主特異性位點寄主特異性位點識別未甲基化的序列進行切割能能能序列特異的切割不是是是基因工程中的用途無用十分有用用處不大40四、限制性內(nèi)切酶酶解反應(yīng)條件1. 標準酶解體系的建立 一個單位（U）的限制性內(nèi)切酶定義： 在合適的溫度和緩沖液中，在20l的反應(yīng)體系中，1h完全酶解1gDNA所需要的酶量。推薦：稍過量的酶（2

15、-5倍）和較長的反應(yīng)時間412. 酶解過程 配酶解體系 混勻 反應(yīng)終止 酶解結(jié)果鑒定42 酶解體系一般20l，保證酶液體積不超過反應(yīng)總體積的10%前提下，盡量降低反應(yīng)總體積。加樣順序一般是：ddH2O buffer DNA 酶 43大部分II 型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應(yīng)條件：Tris-HCl50 mM pH 7.5MgCl210 mMNaCl0 - 150 mMDTT1 mM0 - 50 mM 低鹽酶100 mM 中鹽酶150 mM 高鹽酶Volume20 - 100 mlT T37 1 - 1.5 hr44 混勻移液槍吹打或手指輕彈管壁若底物分子很大（如基因組DNA），應(yīng)避免強烈振蕩?；靹蚝?/p>

16、微量高速離心機進行短暫離心，使管壁液體全部下沉。45反應(yīng)終止三種方法：）加乙二胺四乙酸（EDTA）至終濃度 10mmol/L; 加十二烷基硫酸鈉（SDS） 至終濃度0.1%(W/V)）65加熱20min或者70加熱10min）酚/氯仿抽提46 酶解結(jié)果鑒定快速進行微型瓊脂糖凝膠電泳觀察然后決定是否終止反應(yīng)47酶切后發(fā)現(xiàn)除了目的DNA條帶外，還有其它條帶酶存在“星號”活性，造成非特異性切割；不正確的操作，導致其它內(nèi)切酶污染；底物DNA中可能存在其它DNA污染。電泳后電泳條帶擴散，電泳條帶移動距離異常 底物DNA不純；內(nèi)切酶不純；酶蛋白自身或其它雜蛋白與DNA結(jié)合在一起使電泳條帶移動距離異常483

17、. 限制性內(nèi)切酶對DNA分子的消化 1986年J.A. McClarin等通過X射線晶體衍射發(fā)現(xiàn)型限制酶是以同型二聚體的形式與靶序列結(jié)合。CTTAAGGAATTC（1）內(nèi)切酶與識別序列的結(jié)合模式 49內(nèi)切酶在DNA上的所有識別位點都被切開12341234（2） 完全消化50只有有限數(shù)量的酶切位點被切開通過縮短保溫時間、降低反應(yīng)溫度、增大反應(yīng)體積或減少酶量可達到局部消化的目的。123414（3） 局部消化51（4） 幾種常用限制酶識別位點5253AATT ACGT AGCT ATAT CATG CCGG * *MaeII HpacMspIc * Alu I *A*T Nla A*T ApoI H

18、ind Afl III AgeIBsrFI A*T A*T SspI A*T （5）限制性內(nèi)切酶識別序列的交叉列表 54AATT ACGT AGCT ATAT CATG CCGG A*T Nsp7524 C*G NcoIStyIDsa I XmaIAvaI C*G NdeI C*G Pml IBsaAI PvuIINspBII SmaI C*G C*G G*C EcoRIApoI NgoMIBsrFI 55AATT ACGT AGCT ATAT CATG CCGG G*CBseHI G*CEcl136II EcoRV NaeI G*CG*C AatII SacIBanIIHgiAIBsp128

19、6 SphINsp7524 T*A BspHI BspMII T*A T*A SnaBIBsaAI T*A T*A 56CGCG CTAG GATC GCGC GGCC * MboIcSau3AIc *BfaI HinpI * BstUI DpnI HaeIII *HhaIA*T A*T MluIAfl III SpeI Bgl IIBstYI A*T A*T Eco47III StuI A*T 57CGCG CTAG GATC GCGC GGCC A*T HaeIIC*G DsaI AvrIIStyI EagIEaeIGdiII C*G C*G NspBII C*G SacII PvuI C

20、*G BsiEI BsiEI G*C BssHII NheI BamHIBstYI KasIBanI Bsp120I 58CGCG CTAG GATC GCGC GGCC G*CNarIBsaHI G*CG*CG*C T*A BbeIHaeII ApaIBanIIBsp1286 T*A XbaI Bcl I EaeI T*A NruI FspI MscI T*A T*A 59GTAC TATA TCGA TGCA TTAA * *Csp61 TaqI MseI * RsaI *A*T A*T A*T ClaI AseI A*T ScaI A*T 60GTAC TATA TCGA TGCA TT

21、AA A*T Nsi I C*G Bsi WI SfcI XhoI AvaI AvaI SfcI C*G C*G C*G C*G PstI G*C Asp718BanI Sal I ApaLI 61GTAC TATA TCGA TGCA TTAA G*CAccI AccI G*CBsrl107I HincII HpaIHincII G*C G*C KpnI Bsp1286HgiAI T*A T*A BstBIT*A DraI T*A T*A 624. 限制性內(nèi)切酶酶解反應(yīng)中的注意事項 大多數(shù)廠家供應(yīng)的限制內(nèi)切酶為濃縮液1U的酶液足以在1h內(nèi)消化10g DNA，酶和底物比例2-10U/ug DN

22、A,避免使用過高的酶濃度 濃縮液使用前可用1限制酶緩沖液稀釋 限制性內(nèi)切酶在含50%的甘油的緩沖液 中，于-20穩(wěn)定保存63 酶分裝成小份，避免反復凍融 反應(yīng)中盡可能少加水，使反應(yīng)體積減到最低 通常增加反應(yīng)時間，可降低酶量64DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會影響酶的活性。1. DNA的純度 五、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素純化DNA加大酶的用量，1ugDNA用10U酶延長保溫時間擴大反應(yīng)體積（ 20l）一般采取65需要合適的底物：底物（DNA）純度要高.不能含有RNA和蛋白質(zhì);也不能含有過高的EDTA。更不能含有酚、氯仿、乙醇、SDS和其他有機試劑。DNA的濃度不宜

23、過高，高濃度的DNA會使溶液的粘度增加從而抑制酶分子的擴散導致酶切反應(yīng)不徹底。常為50ul內(nèi)含1ug DNA。66大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質(zhì)粒：2. DNA的甲基化程度 DNA腺嘌呤甲基化酶（DNA adenine methylas ,dam) （修飾GATC中的A）；DNA胞嘧啶甲基化酶（DNA cytosine ethylas ,dcm)（修飾CCA/TGG的C）?；蚬こ讨斜仨毷褂眉谆甘Щ钔蛔兊木?。67不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37 oC，少數(shù)要求40-65 oC。每微克DNA用15單位的酶，保溫12小時。 酶最適溫度oC酶最適溫度oC酶最適溫度oCApa

24、 IBcl IMae IITaq I30505065Apy IBstE IIMae III306055Ban IMae ISma I5045253. 溫度 68是影響限制酶活性的重要因素4. 緩沖液(Buffer) （1）緩沖液的化學組成MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和離子強度Tris-HCl： 維持pH,大多數(shù)為7-7.6二硫蘇糖醇（DTT）： 防止酶氧化,保持酶穩(wěn)定性牛血清白蛋白（BSA）等：中性蛋白質(zhì),防止酶在低 濃度的蛋白質(zhì)溶液中變性商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液69（2）兩種或兩種以上的酶切割DNA樣品 在相同的緩沖液中反應(yīng)同時進行 若需要不同的緩沖液,采用3種方法

25、)先用要求低離子強度的酶切割（低鹽酶）,再加NaCl調(diào)節(jié) 離子強度,并用第二種酶切割（高鹽酶）；)先用一種酶切割,然后用2.5倍體積的乙醇沉淀酶解產(chǎn)物, 再重懸于另一種緩沖液中進行第二種酶切割；)使用所有限制性酶的通用buffer,如KGB(谷氨酸鉀 buffer),經(jīng)適當稀釋可達到各種限制性酶要求的buffer條件。70練習題何為限制性內(nèi)切酶？有哪些類型，各有什么作用和特點什么是限制性內(nèi)切酶的星號活性？受哪些因素影響？限制性核酸內(nèi)切酶是由細菌產(chǎn)生的，其生理意義是 【 】 修復自身的遺傳缺陷 促進自身的基因重組 強化自身的核酸代謝 提高自身的防御能力 補充自身的核苷酸消耗 71從細菌DNA環(huán)化

26、現(xiàn)象推測，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。第二節(jié) DNA 連接酶一、DNA連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)DNA復制一定有斷口72DNA連接酶:一種能夠催化在兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶1967年，世界上數(shù)個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)了一種能夠催化在2條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶，即DNA連接酶。 73（1）大腸桿菌連接酶1. 兩種共價連接DNA限制片段的DNA連接酶只能連接粘性末端，背景低，準確性高二、DNA ligase的特點（2）T4噬菌體的連接酶不但能連接粘性末端；還能連接齊平末端74（1）必須是兩條雙鏈DNA（2）DNA3端有游離的-OH， 5端有一個磷酸基團（P）（3）

27、需要能量動物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中： NAD+2. 連接條件75（4）DNA連接酶的反應(yīng)條件Tris-HCl50 - 100 mM，pH 7.5MgCl210 mMATP0.5 - 1 mMDTT5 mMVolume10 - 20 mlT T 4 - 15 ， 4 - 16 hr 1 U DNA連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下15 反應(yīng) 1 小時，完全連接 1 mg l-DNA（Hind 片段）所需的酶量。761. ATP（NAD+)提供激活的AMP。三、連接反應(yīng)的機理2. AMP與連接酶形成共價“連接酶-AMP”復合物，并釋放出焦磷酸PPi （NMN） 。3. AMP與連接酶的賴氨酸-

28、氨基相連。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+H3NAMPATPPPi774. AMP隨后從連接酶的賴氨酸-氨基轉(zhuǎn)移到DNA一 條鏈的5端 P 上，形成“DNA-腺苷酸”復合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMP785. 3-OH對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二酯鍵，釋放出AMP。79如何連接由限制性內(nèi)切酶切割形成片斷的末端 ？80連接酶反應(yīng)的最佳溫度是37C。四、連接反應(yīng)的溫度1. 最佳溫度但在37下粘性末端的結(jié)合很不穩(wěn)定。2. 實用溫度所以一般采用 416C81增加插入片段與載體的接觸機會，減少同一個分子末端自我連接的現(xiàn)象。1. DNA末端的濃度五、影響連接反應(yīng)的因素1

29、020倍2. 插入片段與載體的濃度比例 兩種構(gòu)型：線狀分子和環(huán)狀分子與DNA濃度及DNA分子長度相關(guān)823. 反應(yīng)溫度黏性末端：1216平頭末端：10204. ATP濃度一般，ATP最適的終濃度為0.5mmol/L.ATP濃度高至5mmol/L，影響平頭末端的連接ATP濃度高至7.5mmol/L，抑制粘性末端及平頭末端的連接。83六、DNA連接的反應(yīng)體系酶切純化后的DNA片斷連接緩沖液DNA連接酶84從分子動力學的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢得多。七、平頭雙鏈DNA片段的連接操作85加大連接酶用量（1

30、0倍大于粘性末端的連接） 加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機會 加入10% PEG8000，促進大分子之間的有效作用 加入單價陽離子（NaCl），最終濃度150-200 mM提高平頭末端連接效率的方法包括：86第三節(jié) DNA聚合酶DNA聚合酶（DNA polymerase)能在引物和模板的存在下，把脫氧核糖多核苷酸連續(xù)地加到雙鏈DNA分子引物鏈的3OH末端，催化核苷酸的聚合作用.87一、基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶2. Klenow fragment3. T7 DNA聚合酶4. T4 DNA聚合酶5. 修飾過的T7 DNA聚合酶6. 逆轉(zhuǎn)錄酶7.Taq DNA聚合酶8

31、81. 共同特點把dNTPs連續(xù)地加到引物的3OH端2. 主要區(qū)別T7 DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個dNTPs而不從模板上掉下來。其它幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個dNTPs就會從模板上解離下來。二、常用的DNA聚合酶的特點持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。89DNA聚合酶35外切酶活性53外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中低Klenow fragment低無中低T4 DNA聚合酶高無中低T7 DNA聚合酶高無快高化學修飾T7 DNA聚合酶低無快高遺傳修飾T7DNA聚合酶無無快高逆轉(zhuǎn)錄酶無無低中Taq DNA聚合酶無有快高3. 常用DNA聚合酶的特性比較90三、DNA聚合

32、酶在基因工程中的用途1. 大腸桿菌DNA聚合酶 主要用來制備帶放射性標記的DNA探針（32P標記）。（1）大腸桿菌DNA聚合酶的性質(zhì)一條單鏈多肽53外切酶活性位于N端用枯草桿菌蛋白酶處理可以切掉N端的53外切酶活性部分,就成為Klenow fragment。91 底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） Mg2+ 帶有3-OH游離端的引物 DNA模板（2）DNA聚合酶I（Pol I）的反應(yīng)條件-OH53dNTPs92標記 核酸探針（probe）能夠同某種被研究的核酸序列特異性結(jié)合的，帶有標記的寡聚核酸分子。（3）用DNA聚合酶制備探針已知序列的核酸片斷顯示位置與互補的待測序列

33、雜交93標記已知序列的核酸片斷 探針的標記方式標記已知序列的核酸片斷帶有放射性的已知序列的核酸片斷5394 DNA聚合酶I 對探針序列的標記切口平移法(nick translation )：放射性同位素標記：當存在dNTP時，DNA聚合酶 I 同時具備53外切酶活性和53的聚合酶活性。9553外切酶活性從DNA缺口的下一段DNA5端除去一個核苷酸后，聚合酶活性就會在缺口的上一段DNA的3一側(cè)補上一個新的核苷酸。缺口缺口5533535396純化的DNA片斷DNase I制造單鏈缺口DNA Pol I進行切口轉(zhuǎn)移一種-32P-dNTP和dNTPs555555553333333332P-dNTP32

34、P-dNTP從頭至尾都被標記972. Klenow fragment具有53聚合酶活性和35外切酶活性。（失去了53外切酶活性）。（1）Klenow fragment的性質(zhì)DNA Pol I Klenow fragment (76KD） 枯草桿菌蛋白酶98 3端補平55klenow DNA 3末端標記補平限制性內(nèi)切酶切后形成的3隱蔽端。在3隱蔽端加上放射性標記的dNTP。klenow（2）主要用途993隱蔽末端的DNA片斷Klenow fragment補平根據(jù)末端的順序選擇一種 -32P-dNTPs末端標記的DNA限制性內(nèi)切酶切5-G33-CTTAA55-GAA33-CTTAA55-GAATT

35、33-CTTAA55-G33-CCTAG55-GG33-CCTAG55-GGATC33-CCTAG5EcoR IBamH I-32P-dATP-32P-dGTP25oC 1h100 cDNA第二鏈的合成mRNAcDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA第二鏈klenow533553引物101（1） T4 DNA聚合酶的性質(zhì)3. T4 DNA聚合酶從T4噬菌體感染后的大腸桿菌培養(yǎng)物中分離純化，由噬菌體基因43編碼。有53聚合酶活性和35外切酶活性（降解單鏈更快）。 來源 酶活性102 特點A 當沒有dNTP時，T4 DNA聚合酶行使35外切酶功能，制造出3隱蔽端。B 如果只有一種dNTP，則降解到該dNTP的

36、位置。C 在四種dNTP均存在時，聚合活性占主導地位。10355335533T4 DNA聚合酶無dNTPsT4 DNA聚合酶有dNTPs55104（2） T4 DNA聚合酶的用途標記末端（取代合成法或置換合成法）用35外切酶活性作用于所有末端形式的3端（平端、3隱蔽端、5隱蔽端）制造出3隱蔽端。再利用它的53聚合酶活性補平，并加入放射性標記的dNTP。 補平隱蔽末端 DNA 3末端標記105酶切中間產(chǎn)生兩個末端標記加入某種32P-dNTP和dNTPsT4 DNA聚合酶（35外切） DNA酶切片斷T4 DNA聚合酶（53聚合）55335533553355335533內(nèi)切酶切無dNTPs106a.

37、 放射性標記的優(yōu)缺點：制作簡單高比放射性放射自顯影效果好優(yōu)點：缺點：半衰期短（32P只有14.3天）不易保存對人體有害要求在專門實驗室操作107b. 非放射性標記i）生物素標記生物素（biotin），又稱維生素H、輔酶R可以與dNTP酰化結(jié)合成為biotin -1,6-dUTP、 biotin -1,4-dATP、 biotin -1,1-dUTP等。CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH也可以被生物素連接酶（biotin ligase）催化與蛋白質(zhì)共價結(jié)合。108純化的DNA片斷DNase I 制造單鏈缺口DNA Pol I 進行缺口轉(zhuǎn)移biotin -dTTP和dNT

38、Ps5555555533333333生物素-dTTP生物素-dTTP利用切口轉(zhuǎn)移法將生物素摻入DNA探針中109ii）地高辛標記：可以與dNTP連接成地高辛-dUTP等，參入DNA合成過程，形成地高辛標記的DNA探針。生物素和地高辛標記的探針都有商品化的試劑盒 (kit)。地高辛的結(jié)合物是抗地高辛抗體。1104. T7 DNA聚合酶（1）來源從T7噬菌體感染大腸桿菌細胞中純化出來的，由兩個亞基組成： T7噬菌體基因5編碼的大亞基：T7噬菌體5蛋白。有53聚合酶和35外切酶活性。 大腸桿菌編碼的小亞基：硫氧還蛋白。增加大亞基對模板的親和性。111（2）T7 DNA聚合酶的特點 持續(xù)合成能力強一旦

39、與模板結(jié)合就會不間斷地合成互補鏈。 35外切酶活性高單鏈和雙鏈都能降解。 不受DNA二級結(jié)構(gòu)的影響其它DNA聚合酶受DNA二級結(jié)構(gòu)的阻礙112 進行末端標記 催化大分子量DNA為模板的合成如M13噬菌體 補平隱蔽末端（3）T7 DNA聚合酶的用途合成補平3隱蔽末端；水解修平3突出末端。1135. 修飾后的T7 DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化學修飾去除35外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修飾后的T7 DNA聚合酶的用途 DNA測序雙脫氧法。 標記DNA 3隱蔽末端 更有效地補平末端1146. 逆轉(zhuǎn)錄酶最普遍使用的是來源于鳥類骨髓母細胞瘤病毒（avian myelo

40、blastosis virus, AMV）：依賴RNA的DNA聚合酶（RNA指導的DNA聚合酶）。（1）來源RNA腫瘤病毒。（2）AMV的性質(zhì)由和兩條多肽鏈組成，最適反應(yīng)溫度為4145115 鏈有反轉(zhuǎn)錄活性和 RNaseH活性。RNaseH：以53或35方向特異地水解RNA-DNA雜交雙鏈中的RNA鏈。RNaseHRNADNARNADNA116（3）逆轉(zhuǎn)錄酶的用途 鏈RNA-DNA雜交雙鏈中53DNA外切酶活性。 合成cDNA以oligo dT為引物（與mRNA的polyA尾巴互補結(jié)合）。AAAAATTTTT53mRNA 5cDNA117 合成DNA探針用隨機引物（random primer）

41、或oligo dT做引物。隨機引物：隨機順序形成的寡聚DNA片斷。（理論上它能與各種序列的模板結(jié)合）118第四節(jié) DNA修飾酶一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶1. 來源小牛胸腺。2. 組成大小兩個亞基。3. 特性53DNA聚合酶活性（terminal transferase）119 不需要模板！ 需要3OH、二甲胂酸緩沖液。 底物可以是單鏈DNA、是3OH突出的雙鏈DNA、平末端需Co2+激活，但反應(yīng)效率低。 隨機添加的dNTPs。 如果只有一種dNTP，就添加上同聚物。DNA 53TTTdTTP ，末端轉(zhuǎn)移酶1204. 末端轉(zhuǎn)移酶的用途（1）同聚物加尾給外源DNA片斷和載體分子分別加上互補的同聚物尾

42、巴，以使它們有效地連接。外源DNA載體DNA5353CCCCCCGGGGGGdGTPdCTP末端轉(zhuǎn)移酶121（2）再生酶切位點便于回收克隆片斷。AAGCTTTTCGAA55Hind酶切ATTCGAAGCTT AKlenow補平122AAGCTTTCGAAGCTTTCGAAAAGCATTTTTCGA AGCTTTTTTCGAA末端轉(zhuǎn)移酶dTTPAAAAAA外源DNA123（3）DNA3OH末端標記AAGCTTTTTTCGA AGCTTTTTTCGAAAAAAAAHind位點Hind位點連接催化非放射性或放射性標記物摻入DNA片斷的3端。 （生物素-11-dUTP等）124二、T4多核苷酸激酶1.

43、 來源T4噬菌體的pseT基因編碼。從T4感染大腸桿菌細胞中分離出來。多種哺乳動物細胞中也發(fā)現(xiàn)這種酶。2. 功能其激酶活性位于N端附近，磷酸酶活性位于C端附近。催化-磷酸從ATP轉(zhuǎn)給雙鏈或單鏈DNA或RNA的5-OH端。不論5-OH端突出與否。12553HO-OH53HO-OH3P-OH53HO-P5ATPT4多核苷酸激酶如果ATP的-磷酸帶有32P標記，就可見被轉(zhuǎn)移到DNA的5端。但天然的DNA的5端都是磷酸化的。1263. 多核苷酸激酶的用途DNA 5-OH端磷酸化、標記DNA的5端。53HO-OH53HO-OH332P-OH53HO-32P5(-32P)ATP多核苷酸激酶3P-OH53H

44、O-P5堿性磷酸酶（1）正向反應(yīng)（forward reaction）127（2）交換反應(yīng)標記法反應(yīng)混合物中具有超量(-32P)ATP和ADP時，多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的-32P與DNA5端的磷酸交換。3P-OH53HO-P5332P-OH53HO-32P5(-32P)ATP、ADP多核苷酸激酶反應(yīng)效果不理想。128 三、堿性磷酸酶1. 堿性磷酸酶種類從大腸桿菌中分離出來。Bacterial alkaline phosphatase，BAP（1）細菌性堿性磷酸酶（2）小牛腸堿性磷酸酶Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP從小牛腸中純化出來。具有抗熱性。SDS中加熱68oC可完全失活。1292. 堿性磷酸酶的特性催化脫掉DNA（或RNA）5端的磷酸根。3P-OH53HO-P553HO-OH53HO-OH堿性磷酸酶3. 堿性磷酸酶的功能（1）防止線性化的載體份子自我連接130單一酶切口的載體的粘性末端容易自我連接。AAGCTTTTCGAAHind酶切A-OHTTCGA-PP-AGCTT HO-A堿性磷酸酶555131A-OHTTCGA-OHHO-AGCTT HO-AOH與OH不能形成磷酸二酯鍵，所以不能自我連接。同一酶切后的外源DNA的5端有P，能與脫磷酸的載體OH連接。132ATTCGAAGCTT AAG