復旦大學基因診斷與基金治療教案07基因診斷的未來發(fā)展

1、第七章 基因診斷的未來發(fā)展未來的基因診斷將朝著三個主要方向發(fā)展：1 胚胎著床前診斷、2 母體外周血中胎兒細胞分析技術(shù)、3 對多發(fā)病、常見病進行準確的分析。一下就這三個方面分別詳述。1 胚胎著床前診斷 胚胎著床前診斷即在囊胚8細胞期，通過對細胞的染色體核型分析和原位雜交，對胚胎進行診斷，從而將人類的遺傳缺陷控制在最早期階段。相關(guān)技術(shù)（1）聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù):1989年，通過PCR擴增了Y染色體位點特異序列，判定攜帶有X連鎖隱性疾病雙親的子代胚胎性別。隨著PCR技術(shù)的完善,巢式PCR、引物延伸預擴增PCR、熒光PCR等技術(shù)可以準確預測單基因疾病的胚胎著床前診斷（2）熒光原位雜交(fluor

2、escent in situ hybridization,FISH):是研究人類胚胎染色體異常的較好方法,它可以對染色體和DNA進行準確的研究,可以進行性判定、核型普查和染色體結(jié)構(gòu)分析。此外,FISH可以對間期細胞核進行染色體計數(shù),不需要象核型分析那樣培養(yǎng)細胞或制備分裂中期細胞。采用單細胞快速制備中期染色體的方法,結(jié)合多種FISH技術(shù),如多重雜交FISH技術(shù)、光譜核型分析、比較基因組雜交等，大大地提高了診斷的準確性和有效性。FISH依賴于熒光標記的探針,目前僅能獲得綠、紅、藍3種可見的熒光色素,選擇聯(lián)合探針可以增加染色體的檢測數(shù)目，同時檢測多個染色體。胚胎著床前診斷常選擇在囊胚8細胞期進行(胚

3、胎發(fā)育的第3天)，此時對胚胎的影響最小。超過8細胞期，胚胎細胞之間形成緊密聯(lián)接,使活檢操作比較困難。盡管胚胎著床前診斷已經(jīng)成為輔助生殖的常規(guī)技術(shù),但目前仍然不能對所有的遺傳異常做出明確診斷。胚胎著床前診斷示例取8細胞囊胚期胚胎的1-2個細胞，進行FISH檢測，并核型分析。胚胎著床前診斷的應(yīng)用（1）篩檢遺傳異常的胚胎。（2）通過PCR進行單細胞檢測的診斷，確診遺傳病囊性纖維化病是1992年Handyside采用PGD確診的第一個遺傳疾病,10年后囊性纖維化仍然是國外PGD發(fā)現(xiàn)最多的疾病。PGD已成功地應(yīng)用于檢測脊髓性肌萎縮。地中海貧血。家族性黑蒙性白癡。血友病。脆性X綜合征。鐮狀細胞病。視網(wǎng)膜色

4、素炎。1-胰蛋白酶缺陷。馬凡綜合征。享廷頓舞蹈病。范可尼貧血。色素失調(diào)癥等遺傳性疾病。（3）對可能有遺傳異?；蚋呶＿z傳因素的病例進行檢測。（4）可在生殖醫(yī)學研究中對精子。卵子以及早期胚胎的發(fā)育過程提供有意義的信息胚胎著床前診斷展望胚胎著床前診斷技術(shù)目前已得到廣泛應(yīng)用，其必將成為重要的臨床檢測手段。隨著人類基因組計劃研究的進展、DNA診斷分析技術(shù)以及其他技術(shù)的不斷發(fā)展，人們能夠針對個別家庭的獨特的染色體異位或已知的基因突變而設(shè)計探針，進行有效的診斷，采用熒光色素探針，對含有數(shù)百或數(shù)千標記物進行雜交，可以檢測任何一條染色體缺失。易位。重復,以及數(shù)目異常等等。隨著科技發(fā)展，應(yīng)用胚胎著床前診斷早期確診

5、多基因疾病，如腫瘤、糖尿病、冠心病也將成為可能。值得注意的是，胚胎著床前診斷仍應(yīng)提高準確性和可靠性，從而達到更廣泛的應(yīng)用。2 母體外周血中胎兒細胞分析技術(shù)通過檢測母體外周血中胎兒細胞而非通過羊膜穿刺或采集絨毛進行產(chǎn)前診斷，是一種非常有潛力的無創(chuàng)傷產(chǎn)前診斷方法人們很早就發(fā)現(xiàn)，胎兒的細胞可以進入母體循環(huán)中，在母體外周血中檢測出來。孕婦外周血中胎兒細胞的檢測是一種無創(chuàng)性的產(chǎn)前檢測手段。近年來，隨著分子生物學技術(shù)和胎兒細胞分離富集技術(shù)的發(fā)展，可以從孕婦外周血中得到一定比例的胎兒細胞應(yīng)用于某些基因病診斷，也為其在法醫(yī)學相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了可能。孕婦外周血中的胎兒細胞早在十九世紀末，德國科學家就在死于子癇

6、的孕婦肺組織中發(fā)現(xiàn)過滋養(yǎng)細胞。隨著胎兒特異性單克隆抗體的不斷出現(xiàn)和細胞分離技術(shù)的發(fā)展，人們從孕婦外周血中主要發(fā)現(xiàn)了三種胎兒細胞： 滋養(yǎng)細胞（trophoblasts）：是胎兒早進入母體循環(huán)的細胞。 淋巴細胞（lymphocytes）：在母體外周血中出現(xiàn)較晚，但存活時間可長達分娩后6個月27年，下次妊娠時可再次出現(xiàn)，故不太適合于診斷或鑒定。 有核紅細胞（nucleated red blood cell，NRBC）：有核紅細胞在成人血循環(huán)中罕見，而在胎兒循環(huán)中普遍存在。它有獨特的抗原成分，如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（CD71）、血型糖蛋白A（GPA）等，可被用來分離富集胎兒細胞。其存活壽命短，一般不超過90天

7、，不影響下次妊娠的診斷。因此，有核紅細胞被認為是較適于診斷的胎兒細胞。孕婦外周血中胎兒細胞的富集富集（enrichment）技術(shù)是指從母體外周血中分離濃縮胎兒細胞的方法，富集母體外周血可以增加PCR對胎兒細胞的檢出率。在實踐中應(yīng)用的富集方法主要有：密度梯度離心（density-gradient centrifugation）用聚蔗糖-泛影酸鈉混合物作分離介質(zhì)，加入孕婦外周血后離心，提出有核細胞層，其中包括胎兒有核細胞。流量細胞計數(shù)儀（flow cytometry）揀選：胎兒有核細胞可基于即細胞大小、細胞的顆粒程度、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和細胞表面糖蛋白分子4個參量被選擇出來?，F(xiàn)已普遍應(yīng)用，并與熒光免疫染

8、色抗原標記等揀選方法聯(lián)合應(yīng)用。磁活化細胞揀選（magnetic activated cell sorting，MACS）：在細胞懸液中加入單核細胞抗體與靶細胞結(jié)合，再加入連接著IgG抗體的磁珠與單核細胞抗體結(jié)合，置于磁場下，便可聚集出靶細胞。電荷流式分離（charge flow separation，CFS）：CFS設(shè)備為一個水平槽，其中液體的梯度與電場方向相反。細胞垂直于液體梯度和電場流動，根據(jù)細胞表面電荷密度的特點，不同類型的細胞被彼此分離并集中，通過不同的管道進入收集管。孕婦外周血中胎兒細胞的檢出在染色體水平檢測胎兒細胞,主要是采用熒光原位雜交(fluorescence in situ

9、hybridization, FISH )的方法，診斷18三體、21三體、47，XXY等染色體病。技術(shù)步驟同本章前述胚胎著床前診斷。PCR技術(shù)在檢測微量胎兒細胞進行基因診斷方面表現(xiàn)出很大的潛力。通過擴增母體外周血細胞的DNA，用PCR方法擴增胎兒特異性DNA片斷，可檢測到胎兒基因。PCR雖然不是細胞分離技術(shù)，但它能檢測到母體血中極少量的胎兒DNA，在應(yīng)用孕婦外周血進行胎兒遺傳物質(zhì)檢測方面，是極其有價值的方法。3 對常見病、多發(fā)病進行準確的分子診斷對心血管系統(tǒng)疾病、糖尿病、精神疾病、乙型肝炎、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、哮喘、近視眼等常見病和多發(fā)病，進行準確的分子診斷，是科學家長期以來的目標。由于許

10、多疾病發(fā)病原因不明，由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用所致，導致分子診斷不能夠作為診斷指標，而處于輔助診斷的地位。隨著科學的發(fā)展和對疾病病理的明確，對常見病、多發(fā)病的分子診斷將成為簡便、迅捷的主要診斷方法。下面我們列舉乙肝、腫瘤和原發(fā)性高血壓的分子診斷方法。3.1 乙型肝炎病毒據(jù)統(tǒng)計約有75%的人類感染性疾病是由病毒引起的。有超過400種不同的病毒可感染人類，包括一些常見的病毒如乙型肝炎病毒、人類缺陷免疫病毒、人類乳頭瘤病毒、皰疹病毒。雖有一些病毒的疫苗研制成功，但沒有一種針對病毒的特效藥。隨著全球化的進程，病毒感染的地域界限越來越模糊，傳播范圍廣、危害更大，如SARS等。因此，對病毒性疾病的快速早

11、期診斷顯得尤為迫切和必要。分子診斷技術(shù)因其快速、簡便、特異、敏感，對病毒的檢測較其他傳統(tǒng)方法有顯著優(yōu)勢，在臨床上得到廣泛應(yīng)用。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus HBV），簡稱乙肝病毒，是一種DNA病毒，引起人類病毒性肝炎的主要病原體之一。慢性乙肝病毒能導致嚴重的肝臟疾病，最終可發(fā)展為肝硬化、肝癌。目前檢測HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe、抗HBc等免疫學指標的方法已被臨床廣泛應(yīng)用，為乙型肝炎的檢測提供了一種簡便快速的工具。但是，免疫學檢測不能反映病毒有無復制、復制程度、傳染性強弱及預后等信息。而HBV的基因檢測可為臨床醫(yī)生提供更多的信息，輔助HBV感染的診斷和治療。分

12、子診斷方法：定量檢測血液中HBV DNA可以采用靶分子擴增技術(shù)（PCR法），HBV的PCR檢測采用的引物序列是依據(jù)其S、C、P、X基因中的高度保守序列來設(shè)計。在擴增時嚴格設(shè)置陰性和陽性對照，確保實驗結(jié)果可靠。常用引物序列見下表：擴增位置引物序列擴增片段大小（bp）P、X基因特異片段5-ATACTGCGGAACTCCTAGC-35-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3278C基因特異片段5-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-35-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3477C基因特異片段5-GCTTTGGGGCATGGACATTGACC

13、CCTATAA-35-ATGGGATCCCTGGATGCTGGGTCTTCCAAA-32583.2 腫瘤腫瘤的發(fā)病機制至今未明，所以對大多數(shù)腫瘤，還缺乏相關(guān)的早期診斷技術(shù)。腫瘤發(fā)展過程中，有多種基因和蛋白質(zhì)水平的改變，其特定的遺傳變異與人類腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個階段相關(guān)。這種遺傳變異作為對正常組織細胞的一種損傷性改變，是許多人類腫瘤形成最主要的內(nèi)在因素。腫瘤是一種以基因異常表達為特點的疾病，基因表達模式改變，導致細胞生理特性的變化，如增殖、侵襲等。因此，特定腫瘤的基因表達標記，可用于腫瘤診斷、分型和對治療反應(yīng)性的預測。關(guān)注最多的基因是癌基因與抑癌基因。癌基因是一類能引起細胞惡性轉(zhuǎn)化的基因，最初在逆

14、轉(zhuǎn)錄病毒基因組中發(fā)現(xiàn)，后發(fā)現(xiàn)許多動物正常細胞中存在與病毒癌基因相似的DNA序列，稱為原癌基因（proto-oncogene）。在腫瘤發(fā)生中，原癌基因會轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂兄掳┳饔玫陌┗颉０凑站幋a蛋白的結(jié)構(gòu)功能，癌基因可分為：1.生長因子類，2.酪氨酸激酶類，3.GTP結(jié)合蛋白類，4.核蛋白類，5.端粒酶類抑癌基因：一對等位基因由于其功能喪失，使得細胞過度生長增殖，導致腫瘤形成。這一對等位基因即為抑癌基因。常見的抑癌基因有：1.Rb基因，2.p53基因，3.APC基因，4.BRCA1基因，5.WT1基因，6.erbA基因，7.INK4基因等等早期分子診斷的策略通過分析一些原癌基因的點突變、插入突變、基因擴增和染色體易位、抑癌基因的丟失、突變和異常甲基化改變，可以輔助對惡性腫瘤的早期診斷。早期診斷中，選擇含有患者腫瘤細胞來源基因信息的體液、分泌物、排泄物做為檢測標本，并對其進行相關(guān)的處理，用分子檢測技術(shù)對相關(guān)癌基因、抑癌基因進行定性、定量檢測分析。3.3 原發(fā)性高血壓原