DNA提取技術(shù)在法醫(yī)學(xué)的應(yīng)用與進(jìn)展

1、DNA提取技術(shù)在法醫(yī)學(xué)的應(yīng)用與進(jìn)展【摘要】dna鑒定技術(shù)在現(xiàn)代法醫(yī)物證檢驗(yàn)中有著廣泛的應(yīng)用，其應(yīng)用分子生物學(xué)的方法，對(duì)犯罪現(xiàn)場(chǎng)遺留的生物物證所含的dna與犯罪嫌疑人的dna樣本進(jìn)行比對(duì)，鑒定dna結(jié)構(gòu)是否相同，從而對(duì)生物物證是否來(lái)自于犯罪嫌疑人作出評(píng)價(jià)。不過(guò)大多犯罪現(xiàn)場(chǎng)遺留的生物樣本存在著許多不利于法醫(yī)提取的因素，比如腐敗、變質(zhì)、污染等。本文就現(xiàn)場(chǎng)dna提取純化技術(shù)方面來(lái)介紹當(dāng)今法醫(yī)學(xué)的技術(shù)進(jìn)展。【關(guān)鍵詞】dna提取硅珠磁珠自從20世紀(jì)80年代dna技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，改變了過(guò)去對(duì)生物物證的檢驗(yàn)只能“否定”不能“認(rèn)定”的歷史。利用dna鑒定技術(shù)，可以直接“認(rèn)定”犯罪現(xiàn)場(chǎng)的血跡、精斑、毛發(fā)、唾液斑等生

2、物檢材是否為犯罪嫌疑人所留，從而為案件的偵破、訴訟提供有力的證據(jù)。目前，dna鑒定技術(shù)在生物物證檢驗(yàn)中的應(yīng)用非常廣泛，在傷害、強(qiáng)奸、交通肇事、親子鑒定等刑事或民事案件中，現(xiàn)場(chǎng)遺留的血跡、精斑、骨骼、肌肉、毛發(fā)、唾液斑、尿斑、指(趾)甲、汗液指紋等生物物證都是dna鑒定的常見(jiàn)檢材，dna鑒定結(jié)論是許多刑事案件的重要證據(jù)之一。眾所周知，要想對(duì)dna進(jìn)行鑒定，必須得到足量且純凈的dna樣本，dna提取純化技術(shù)是法醫(yī)dna檢驗(yàn)的第一個(gè)步驟，也是最關(guān)鍵的步驟。從犯罪現(xiàn)場(chǎng)提取的血痕或精斑，或者是從嫌疑人或親緣鑒定中提取的血液樣本，這些生物檢材中除了dna外還包括許多物質(zhì)，在分析dna之前，必須將dna同其

3、他物質(zhì)分離開(kāi)來(lái)?？梢哉f(shuō)，能否成功進(jìn)行dna檢驗(yàn)取決于能否從生物檢材中獲得高質(zhì)量dna。尤其對(duì)于腐敗、變質(zhì)、污染等各種條件下的現(xiàn)場(chǎng)生物檢材，dna的提取質(zhì)量將直接關(guān)系到dna檢驗(yàn)的成敗。目前法醫(yī)dna實(shí)驗(yàn)室最常見(jiàn)的2種dna提取方法是：酚-氯仿提取法、helex提取法。雖然這些方法是被廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)檢材，但是不得不承認(rèn)，他們各自都有著不可避免的缺點(diǎn)。酚-氯仿提取法：在dna提取過(guò)程中，涉及到一些危險(xiǎn)的化學(xué)物質(zhì)，耗時(shí)。而且有些色素和泥土中能被醇沉的雜質(zhì)不易被去除。同時(shí)，由于操作中涉及到多次轉(zhuǎn)移樣本，這樣很容易造成dna丟失，dna提取率低，增加錯(cuò)誤或污染的幾率。2helex提取法：該方法雖然提取

4、dna量較多，但對(duì)微量、污染的檢材效果欠佳。而且該方法提取的dna中常存在pr擴(kuò)增抑制物，且不宜長(zhǎng)期保存，這些都可能使擴(kuò)增效率下降或擴(kuò)增失敗。1-3由此看到，雖然這些方法可以提取出較多的dna樣本，但是由于提取純度較低，含有較多pr抑制物，影響了接下來(lái)的擴(kuò)增過(guò)程，這樣也就影響了dna的檢驗(yàn)。所以如何能提取出較純凈的dna顯得十分的必要。在此，我想介紹兩種更為有效的dna提取純化技術(shù)。1以二氧化硅為基礎(chǔ)的提取純化法這種方法是近幾年才發(fā)展起來(lái)的高通量dna提取純化方法。其中最多見(jiàn)的就是以硅珠或硅膜為基礎(chǔ)的提取方法。其基本原理是4-6，核酸在高濃度高離液鹽例如氫氯酸胍、硫氰酸胍、碘化鈉和高氯酸鈉環(huán)境

5、中，通常用的是硫氰酸胍，選擇性地吸附在類似玻璃珠的硅支持物上。這些高離液鹽可破壞液態(tài)水中的氫鍵網(wǎng)格，使變性的蛋白質(zhì)和核酸比其在折疊或配對(duì)結(jié)構(gòu)的情況下更具有熱力學(xué)穩(wěn)定性7。由于硫氰酸胍是高性能的蛋白質(zhì)變性劑，可以使蛋白質(zhì)與dna分離，在硅支持物吸附前高速離心可以將變性的蛋白質(zhì)、雜質(zhì)等不容物除去，吸附后漂洗可以將溶液中的pr抑制物除去，因此提取的dna比較純，速度快，且不會(huì)受檢材條件影響。實(shí)驗(yàn)表明8，0.5-1l新鮮血液就可以提取出足以成功擴(kuò)增的dna。在不同的檢材，如新鮮腦組織、皮膚、泥土上血跡、深色布血跡、火場(chǎng)尸體骨松質(zhì)、深色布混合斑中提取的dna均可成功擴(kuò)增，不受檢材種類的影響。同時(shí)，通過(guò)對(duì)

6、helex法，酚-氯仿法和二氧化硅膜法3種dna提取法在污染嚴(yán)重混合斑分型中的應(yīng)用效果的比較2，發(fā)現(xiàn)二氧化硅膜純化技術(shù)可以有效去除pr抑制物，提取的dna擴(kuò)增效果明顯優(yōu)于helex法和酚-氯仿法，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。2納米磁珠法納米科技是近年來(lái)國(guó)際上最為活躍的研究領(lǐng)域之一，取得了諸多舉世矚目的成就，尤其是在解決生物學(xué)、醫(yī)學(xué)難題上展示了廣闊的應(yīng)用前景。磁性納米技術(shù)是納米技術(shù)的一個(gè)分支，對(duì)于dna提取技術(shù)而言，磁性納米技術(shù)將具有常規(guī)提取方法所無(wú)法比擬的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，因此將磁性納米技術(shù)應(yīng)用在法醫(yī)學(xué)界將有著廣泛的前景。而磁珠提取法就是其中最常見(jiàn)的方法。磁珠的主要制作步驟是這樣的9：首先制備5-8n的磁性納

7、米粒子，使其具有很高的磁場(chǎng)響應(yīng)能力和超順磁特性，能夠通過(guò)改變外磁場(chǎng)實(shí)現(xiàn)納米調(diào)控；然后利用包覆技術(shù)，對(duì)磁性納米粒子進(jìn)行包覆，為進(jìn)一步修飾功能團(tuán)提供載體，減少與生物組織的非特異性作用，對(duì)內(nèi)部的磁性納米粒子起到保護(hù)作用；接著利用表面化學(xué)修飾技術(shù)，連接可特異地與dna發(fā)生作用的功能團(tuán)10，修飾的功能團(tuán)必須具有對(duì)dna可逆吸附的特性，從而實(shí)現(xiàn)控制dna吸附、解離和減少與其它雜質(zhì)非特異性吸附的目的；最后通過(guò)表面修飾和溶液中離子強(qiáng)度、ph等條件的控制，使每次操作均能獲得準(zhǔn)確數(shù)量dna，保證后續(xù)檢測(cè)分析的高成功率。磁珠法提取純化dna的原理與硅珠相近11,13，先利用硫氰酸胍等強(qiáng)烈蛋白變性劑，破壞細(xì)胞膜及核膜

8、蛋白，釋放dna，并使核酸酶失活；然后加入磁珠通過(guò)表面的化學(xué)集團(tuán)與dna特異性吸附，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不被吸附而留在容夜里；接著在磁場(chǎng)的作用下，磁性顆粒與液體分開(kāi)，回收顆粒；最后再用純水或te洗脫吸附的dna，在溶解液中進(jìn)行dna與磁珠的解離，將dna重新溶出。與其他常見(jiàn)提取方法比較，磁珠法有著顯著的優(yōu)勢(shì)9,12:1納米材料具有小尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)，能夠用于高效dna提取，滿足微量生物樣本dna提取的要求，實(shí)驗(yàn)表明，即使是0.5l血仍能得到dna分型，而同樣的血量用helex提取dna優(yōu)勢(shì)不能得到分型，甚至當(dāng)溶液中dna含量?jī)H為100pg時(shí)，dna回收率仍然達(dá)到90%以上13；2納米材料表面能夠進(jìn)

9、行化學(xué)修飾，從而與dna進(jìn)行特異性吸附，去除樣品dna溶液中的pr抑制物質(zhì)，如有機(jī)溶劑、去污劑、金屬離子、染料等；3納米粒子表面功能團(tuán)數(shù)量可以控制，獲得所提取dna溶液的濃度信息，實(shí)現(xiàn)定量的要求；4磁性納米材料可以通過(guò)特殊的合成工藝，使其具有超順磁特性，因此能夠通過(guò)儀器進(jìn)行自動(dòng)化操作，滿足數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)大批量樣本提取的需要，減少人為因素影響14；5用時(shí)少，操作簡(jiǎn)單，適用于大多數(shù)生物檢材。對(duì)于經(jīng)驗(yàn)較少的初學(xué)者而言，按照簡(jiǎn)單的程序化操作，也能夠獲得滿意的dna提取結(jié)果；6價(jià)格低廉，便于廣泛應(yīng)用。由于納米材料合成采用的都是低價(jià)無(wú)機(jī)和有機(jī)原料，無(wú)須特殊的儀器設(shè)備，使得最終的合成和研發(fā)成本都很便宜。dna鑒

10、定技術(shù)作為法醫(yī)鑒定的重要手段，它的科學(xué)性和實(shí)用性已得到廣大司法部門和社會(huì)各界的一致認(rèn)可和高度重視。目前運(yùn)用dna技術(shù)在刑事案件以及各種案件中進(jìn)行檢驗(yàn)已經(jīng)是常用手段之一。而以上介紹的技術(shù)也只是整個(gè)鑒定技術(shù)的一環(huán)，樣本的收集、str分型等一系列步驟的每個(gè)因素都可能影響dna分析結(jié)果。不過(guò)相信在科學(xué)技術(shù)迅猛發(fā)展的今天，國(guó)內(nèi)外學(xué)者會(huì)研究出更多更靈敏，更簡(jiǎn)便，更經(jīng)濟(jì)的方法，來(lái)未法醫(yī)學(xué)界或者更大的領(lǐng)域服務(wù)。參考文獻(xiàn)1董林芳,裴黎,余政,彭健雄,馮濤.聯(lián)合應(yīng)用helex100和磁珠法檢測(cè)霉變皮上衣微量dna1例j.刑事技術(shù).2008;6:68-69.2莫耀南,薛小琦,劉良.3種dna提取法在污染嚴(yán)重混合斑分

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