結(jié)核分枝桿菌Rv2389基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)

1、結(jié)核分枝桿菌Rv2389基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)【關(guān)鍵詞】分枝桿菌,結(jié)核；Rv2389；基因表達(dá)nstrutinandexpressinfeukarytiexpressinvetrfybateriutuberulsisRv2389【Abstrat】AI:TnstruttheeukarytiexpressinvetrendingybateriutuberulsisRv2389andexpressitinHells.ETHDS:ThegeneendingRv2389prtEinereaplifiedbyplyerasehainreatinPRfrgenefybateriutuberulsisH

2、37Rvstrain.Aftersequened,Rv2389genesegentseresublnedinteukarytiexpressinvetrpDNA3.1(-).TherebinantplasidpDNARv2389eretransfetedintHellsithlipse.TheexpressinsfRNAandprteinendedbythisgeneeredetetedrespetivelyithRTPRandindiretiunfluresenttehnlgy.RESULTS:Rv2389aslnedintpDNA3.1(-)rretly,anditsexpressinat

3、RNAandprteinlevelsasdetetedinHells.NLUSIN:RebinanteukarytiplasidendingRv2389asnstrutedsuessfully.TheexperientestablishedthebasisfrfurtherstudynthefuntinfRv2389.【Keyrds】ybateriutuberulsis;Rv2389;geneexpressin【摘要】目的：構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌Rv2389基因真核表達(dá)載體.方法：PR擴(kuò)增Rv2389基因，測(cè)序正確后克隆入真核表達(dá)載體pDNA3.1(-)，重組質(zhì)粒酶切鑒定正確后以陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)染H細(xì)

4、胞后,分別以RTPR方法檢測(cè)RNA表達(dá)和間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)目的蛋白的表達(dá).結(jié)果：構(gòu)建了重組質(zhì)粒pDNARv2389，RTPR結(jié)果證明Rv2389可在H細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，間接免疫熒光檢測(cè)證明，表達(dá)有Rv2389蛋白的細(xì)胞著染.結(jié)論：成功構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌Rv2389基因的真核表達(dá)載體pDNARv2389，Rv2389基因可以在H細(xì)胞中表達(dá).【關(guān)鍵詞】分枝桿菌，結(jié)核；Rv2389；基因表達(dá)0引言結(jié)核病是目前危害全球人類(lèi)安康的重要傳染病.這主要是因?yàn)榭ń槊鏐G對(duì)成年人結(jié)核病的預(yù)防效果不穩(wěn)定，保護(hù)力為0%70%；沒(méi)有特異性的診斷試劑；艾滋病等免疫缺陷個(gè)體的出現(xiàn)加快了本病的嚴(yán)重后果；耐藥菌株的大量出現(xiàn)1.因

5、此尋找更有效的替代卡介苗的疫苗已成為當(dāng)務(wù)之急.Rv2389蛋白是結(jié)核分枝桿菌ybateriutuberulsis,TB)復(fù)活促進(jìn)因子resusitatinprtingfatr,Rpf樣蛋白家族的一員，序列分析發(fā)現(xiàn)，它不僅與細(xì)菌的增殖有關(guān)，還有可能是宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別的一個(gè)靶抗原2.為此，我們?cè)赗v2389原核表達(dá)和純化的根底上，構(gòu)建了真核表達(dá)載體并在H(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞中進(jìn)展表達(dá)，同時(shí)從其表達(dá)程度和基因轉(zhuǎn)錄兩方面進(jìn)展鑒定，為其功能研究奠定根底.1材料和方法1.1材料TBH37Rv菌株,P815細(xì)胞由本室保存；真核表達(dá)載體pDNA3.1(-)由本室保存；含有Rv2389基因的重組質(zhì)粒pPrEXH

6、TRv2389由本室構(gòu)建保存；Rv2389蛋白多抗由本實(shí)驗(yàn)室制備；AV，RNA酶抑制劑和TRIzlPrega公司；限制性?xún)?nèi)切酶、T4DNA連接酶和核酸分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品寶泰克公司；質(zhì)粒提取試劑盒ega公司；梭華sft陽(yáng)離子聚合物廈門(mén)太陽(yáng)馬公司；羊抗鼠熒光抗體寶信公司.1.2方法1.2.1Rv2389基因片段的擴(kuò)增與測(cè)序結(jié)核分枝桿菌Rv2389全基因序列的特異性引物序列為：P1：5ggatgaatgagggtttgtta3，含BaH酶切位點(diǎn)，起始碼和zak序列；P2：5gaagttatgttgtgatga3，含Hind酶切位點(diǎn)和終止碼.PR反響條件：9440s，5630s，721in，共30個(gè)循環(huán)，

7、72延伸10in.回收PR產(chǎn)物，用T4連接酶將PR產(chǎn)物與pGETeasy載體連接，轉(zhuǎn)化E.liDH5，隨機(jī)挑取5個(gè)克隆提取質(zhì)粒進(jìn)展雙酶切鑒定，取2個(gè)鑒定正確的克隆進(jìn)展測(cè)序3.1.2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定將測(cè)序正確的Rv2389基因克隆至真核表達(dá)載體pDNA3.1(-)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pDNARv2389.連接轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取均按文獻(xiàn)進(jìn)展3.以BaH和Hind酶切pDNARv2389，10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質(zhì)粒.1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染將5105個(gè)H細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞數(shù)量達(dá)孔底約2/3時(shí)進(jìn)展轉(zhuǎn)染.轉(zhuǎn)染前用不含抗生素的1640培養(yǎng)液洗2次，以0.5L1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞.pDNARv238

8、9重組質(zhì)粒10L和陽(yáng)離子聚合物5L各用80L無(wú)血清的1640培養(yǎng)液稀釋?zhuān)瑑烧呋靹蚝笫覝刈饔?0in，緩慢參加到細(xì)胞中.培養(yǎng)24h后搜集細(xì)胞，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照.1.2.4RTPR檢測(cè)RNA表達(dá)搜集重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的H細(xì)胞，2000r/in離心10in.參照Gib的TRIzl試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞RNA.在上述10LRNA溶液中，參加1Llig(dT)12-18引物，70水浴5in后立即置于冰上，加10buffer4L，gS44L，10l/LdNTPs2L，RNAinhibitr0.6L，AV0.8L，H210.4L.混勻，42作用1h，7015in終止反響.PR反響時(shí)參加DNA第1鏈2L，反響條件為

9、94預(yù)變性5in，94變性30s，55復(fù)性30s，72延伸40s，共進(jìn)展30個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)72延伸2in，擴(kuò)增產(chǎn)物以10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).1.2.5間接免疫熒光檢測(cè)目的基因表達(dá)將轉(zhuǎn)染pDNARv2389質(zhì)粒的H細(xì)胞爬片，用純化的Rv2389交融蛋白制備的免疫血清作為一抗，間接免疫熒光法檢測(cè)H細(xì)胞中交融蛋白的表達(dá)4.2結(jié)果2.1目的基因的擴(kuò)增、克隆及酶切鑒定用PR方法從H37Rv中擴(kuò)增出Rv2389的DNA片段，被順利克隆入pGETeasy載體，測(cè)序證實(shí)所克隆的基因完全正確.序列分析與GenBank報(bào)道的一致圖1.：DL2000arker；1：PR產(chǎn)物.圖1Rv2389基因的PR結(jié)果略

10、2.2重組質(zhì)粒的酶切鑒定重組質(zhì)粒pDNARv2389被BaH和HindIII雙酶切后可得到約475bp的片段，與預(yù)期的大小相一致圖2.：DL2000arker;13：pDNARv2389被BaH和Hind雙酶切.圖2重組質(zhì)粒的酶切鑒定略2.3RTPR檢測(cè)RNA表達(dá)在約475bp處擴(kuò)增出特異性基因圖3，說(shuō)明pDNARv2389重組質(zhì)?？梢栽贖細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄.：DL2000arker；1：RTPR產(chǎn)物.圖3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H細(xì)胞的RTPR結(jié)果略2.4間接免疫熒光檢測(cè)目的基因表達(dá)轉(zhuǎn)染細(xì)胞在經(jīng)過(guò)間接免疫熒光染色后，陽(yáng)性細(xì)胞有較強(qiáng)的熒光著染，表達(dá)蛋白定位于細(xì)胞膜上，而對(duì)照組細(xì)胞沒(méi)有著染圖4.A：Rv2389交融

11、蛋白在H細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；B：對(duì)照.圖4間接免疫熒光測(cè)定交融蛋白在H細(xì)胞中的表達(dá)400略3討論ukalvaGV等5研究發(fā)現(xiàn)藤黃微球菌irusluteus,.luteus)可分泌一種Rpf，該因子可刺激該菌休眠體復(fù)活和生長(zhǎng)，也可促進(jìn)繁殖體生長(zhǎng)，研究證實(shí)Rpf作用與真核細(xì)胞的細(xì)胞因子相似，具有自我刺激作用又稱(chēng)細(xì)菌因子.同時(shí)進(jìn)一步研究證實(shí)該因子也可以刺激其他種類(lèi)的高G+%的革蘭陽(yáng)性菌，包括結(jié)核分枝桿菌.結(jié)核分枝桿菌全基因序列分析說(shuō)明，其中Rv1884；Rv2450，Rv0867，Rv1009，Rv2389和基因與luteus菌Rpf基因同源，其中4個(gè)基因編碼的蛋白是分泌蛋白，推測(cè)結(jié)核桿菌這些基因編碼的蛋白

12、可能也具有Rpf作用，但尚無(wú)直接證據(jù)5-6.Sassetti等7采用大規(guī)模插入突變分析發(fā)現(xiàn)Rpf樣蛋白并不是H37Rv株生長(zhǎng)所必需，而且這5種Rpf樣蛋白在功能上有一定的重疊.因?yàn)橥蛔僐v1009基因可明顯減緩TB的生長(zhǎng)速度，提示其在TB的生長(zhǎng)中可能發(fā)揮著較為重要的作用.以往研究8說(shuō)明，TBH37Rv株的幾種Rpf樣蛋白與luteus的Rpf蛋白一樣，都屬于膜蛋白，因此這些蛋白或者這些蛋白中的某個(gè)或某幾個(gè)蛋白有可能會(huì)被宿主的免疫系統(tǒng)所識(shí)別，從而有可能作為亞單位疫苗的備選組分.近年來(lái)，國(guó)外在TB新型疫苗或增強(qiáng)BG免疫效果方面已作了大量的研究工作，并正在進(jìn)展大規(guī)模的候選疫苗挑選工作.由于結(jié)核分枝桿

13、菌Rpf家族蛋白不僅可以促進(jìn)結(jié)核休眠菌復(fù)活，而且還具有多種生物學(xué)活性如自溶素和/或青霉素結(jié)合蛋白的功能、細(xì)胞學(xué)方面的功能等9，此外這幾種Rpf樣蛋白與luteus的Rpf蛋白一樣，都屬于膜蛋白，因此這些蛋白或者這些蛋白中的某個(gè)或某幾個(gè)蛋白有可能會(huì)被宿主的免疫系統(tǒng)所識(shí)別，從而有可能作為亞單位疫苗的備選組分.在本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)赗v2389原核表達(dá)和純化的工作根底上構(gòu)建了真核表達(dá)載體并在H細(xì)胞中進(jìn)展表達(dá)，同時(shí)從其表達(dá)程度和基因轉(zhuǎn)錄兩方面進(jìn)展鑒定，為其在新型疫苗的應(yīng)用中奠定了根底.【參考文獻(xiàn)】1KuarH,alhtraD,GsaiS,etal.Hfarhaveereahedintuberulsisva

14、inedevelpent?J.ritRevirbil,2022,29(4):297-312.2ukalvaGV,KaprelyantsAS,YungDI,eta.lAfailyfautrinegrthfatrsinybateriutuberulsisJ.lirbil,2002,46(3):623-635.3高雪，薛瑩，姜泓，等.結(jié)核分枝桿菌furA基因片段的克壟表達(dá)和別離純化J.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2022,2518：1637-1640.4師長(zhǎng)宏，范雄林，徐志凱，等.交融表達(dá)Ag85BESAT6的結(jié)核分枝桿菌真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其免疫原性J.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2022,252：121-124.5

15、ukalvaGV,KaprelyantsAS,YungDI,etal.AbaterialytkineJ.PrNatlAadSiUSA,1998,95(15):8916-8921.6artinG,NihlasHK,AngharadPD,etal.ResusitatinprtingfatrspssessalyszyelikedainJ.TrendsBiheSi,2022,29(1):7-10.7Sassetti,BydDH,RubinEJ.GenesrequiredfrybaterialgrthdefinedbyhighdensityutagenesisJ.lirbil,2022,48(1):77-86.8Tjalsa