二附院病毒性角膜炎

1、受理：山東省高校中抗協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目可行性項(xiàng)目名稱：從肝論治性角膜炎臨床療效評(píng)價(jià)及機(jī)制研究項(xiàng)目責(zé)任：山東中大學(xué)眼科：項(xiàng)目項(xiàng)目年限： 2015 年 01 月 至 2016 年 12 月填報(bào)日期： 2015 年 01 月 30日填 寫 說 明為建立、規(guī)范的協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目信息管理制度，加強(qiáng)項(xiàng)目信息的管理，特設(shè)計(jì)山東省高校中抗協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目可行性（申報(bào)書）格式和填寫要求。一、請(qǐng)嚴(yán)格按照表中要求填寫各項(xiàng)。二、項(xiàng)目可行性可以由一家組織，也可以由多家聯(lián)合組織，牽頭為項(xiàng)目組織實(shí)施的責(zé)任。每個(gè)項(xiàng)目只能有一家責(zé)任和一個(gè)組長(zhǎng)。三、項(xiàng)目可行性由項(xiàng)目責(zé)任編寫，并報(bào)中抗協(xié)同創(chuàng)新中心管理匯總；四、項(xiàng)目可行性中第一次出現(xiàn)外文

2、名詞時(shí)，要寫清全稱和縮寫，再出現(xiàn)同一詞時(shí)可以使用縮寫。五、組織機(jī)構(gòu)代碼是指項(xiàng)目責(zé)任組織機(jī)構(gòu)代碼證上的標(biāo)識(shí)代碼，它是由組織機(jī)構(gòu)代碼管理中心所賦予的唯一法人標(biāo)識(shí)代碼。六、編寫應(yīng)客觀、填報(bào)材料，尊重他人知識(shí)，遵守國(guó)家有關(guān)知識(shí)。在項(xiàng)目可行性中他人研究成果時(shí)，必須以腳注或其他方式注明出處，目的應(yīng)是介紹、評(píng)論與自己的研究相關(guān)的成果或說明與自己的研究相關(guān)的技術(shù)問題。對(duì)于、篡改科學(xué)數(shù)據(jù)，他人著作、或者剽竊他人科研成果等科研不端行為，一經(jīng)查實(shí)，將記入信用。七、此表為項(xiàng)目可行性的基本信息，請(qǐng)務(wù)必填寫正確。一、項(xiàng)目基本信息項(xiàng)目名稱從肝論治性角膜炎臨床療效評(píng)價(jià)及機(jī)制研究預(yù)計(jì)完成時(shí)間2016 年 12 月預(yù)期成果類型論

3、著、專利責(zé)任信息名稱山東中大學(xué)眼科性質(zhì)事業(yè)通訊地址山東省濟(jì)南市山路 48 號(hào)250002所在地區(qū)濟(jì)南主管部門山東中大學(xué)組織機(jī)構(gòu)代碼68592281-6傳真號(hào)碼成立時(shí)間2009.02電子信箱項(xiàng)目組長(zhǎng)信息男出生日期1960.02教授最高學(xué)位博士從事專業(yè)中西醫(yī)結(jié)合眼科固定移動(dòng)傳真號(hào)碼電子信箱h證件類型證件號(hào)碼聯(lián)合信息序號(hào)1山東中大學(xué)第二附屬醫(yī)院2山東中大學(xué)3項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)來源（萬元）總經(jīng)費(fèi)60 萬項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)60 萬企業(yè)投資0其他0二、項(xiàng)目簡(jiǎn)介簡(jiǎn)述項(xiàng)目目標(biāo)和內(nèi)容，限 500 字以內(nèi)性角膜炎(HSK)是世界性致盲性眼病，是世界上危害嚴(yán)重的性疾病之一，發(fā)病率占角膜病的首位。本病的臨床特點(diǎn)為反復(fù)發(fā)作，目前尚無有效控

4、制復(fù)發(fā)的藥物，其治療，已成為眼科最棘手。介導(dǎo)的免疫、炎性反應(yīng)及潛伏是其主要的發(fā)病機(jī)制，目前治療仍是醫(yī)學(xué)界的一題。隨著抗皰疹藥物的廣泛、反復(fù)使用，關(guān)于耐藥株的 也越來越多。至今尚無一種物能從根本上消除HSV的潛伏和復(fù)發(fā)，且單純抗顯然已不再適應(yīng)當(dāng)前的治療。中低，毒副作用少，為性角膜炎的治療帶來光明的前景。祖國(guó)醫(yī)學(xué)對(duì)角膜稱之為黑睛，屬五輪學(xué)說中的風(fēng)輪，內(nèi)應(yīng)于肝，其病變主要表現(xiàn)為黑睛生翳，故從肝論治，辨證求因，審因退翳，清肝、疏肝、柔肝、 暖肝等多可達(dá)到退翳明目之功效。我院以中醫(yī)學(xué)辨證論治為基礎(chǔ)，歷經(jīng)20余年，從肝論治性角膜炎取得了顯著的臨床療效。本研究從臨床（內(nèi)治+外治）及實(shí)驗(yàn)研究探討中從肝論治病毒

5、性角膜炎的療效及機(jī)制，以期闡明中防治性角膜炎的作用機(jī)制，為其在臨床廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。二、項(xiàng)目立項(xiàng)的必要性分析2.1 立項(xiàng)的意義單純皰疹 (h es simplex , HSV)引起的角膜 稱為單純皰疹 性角膜炎，簡(jiǎn)稱單皰角膜炎(h es simplex keratitis, HSK)。HSK 是 世界上危害嚴(yán)重的 性疾病之一，發(fā)病 率占角膜病的首位1。流行病學(xué) 表明 性角膜炎以單純皰疹 最為常見（占門診患者的50以上），其中單純皰疹 型（h es simplex , HSV-I）致病率高達(dá)90以上，是皰疹 中，引起眼疾最多的病原體。本病的臨床特點(diǎn)為病程長(zhǎng)、反復(fù)發(fā)作，最終導(dǎo)致角膜白斑、角膜新

6、生 增生、角膜潰瘍甚至穿孔等而嚴(yán)重危害患者的視功能2-4。目前尚無有效控制復(fù)發(fā)的藥物，其治療 ，已成為眼科最棘手 5。反復(fù)發(fā)作后角膜混濁逐漸加重，最終導(dǎo)致失明。目前國(guó)內(nèi)用于治療HSK的首選藥物是無環(huán)鳥苷（ACV），它能夠選擇性的作用于HSV 的細(xì)胞，阻滯 DNA的 。但隨著抗皰疹 藥物的廣泛、反復(fù)使用，關(guān)于耐藥株的 也越來越多。國(guó)外已大量 從臨床標(biāo)本中分離出耐藥株，并有學(xué)者用藥物誘導(dǎo)的方法培養(yǎng)出耐藥株 6?？?藥物只能對(duì)急性發(fā)病期的 有效，而不能有效治愈HSV的 ，故至今尚無報(bào)道有哪一種 物能從根本上消除HSV的潛伏 和復(fù)發(fā) ，且單純抗 顯然已不再適應(yīng)當(dāng)前的治療。祖國(guó)醫(yī)學(xué)中，根據(jù)HSK損傷程度

7、和范圍不同，HSK相當(dāng)于“銀星獨(dú)現(xiàn)”、“聚星障”、“花翳”、“凝脂翳”、“混晴障”的范疇7。本病發(fā)于黑睛，中醫(yī)眼科理論中，黑睛屬于五輪輪，內(nèi)應(yīng)于肝，其病變主要表現(xiàn)為黑睛生翳，故從肝論治，辨證求因，審因退翳，清肝、疏肝、柔肝、暖肝等多可達(dá)到退翳明目之功效?！案沃髂俊蹦酥嗅t(yī)眼科之理論津梁，靈樞脈度篇說:“肝氣通 ，肝和則目能辨五色矣?！彼貑柦饏T真 :“東方青色，入通于肝，開竅 ，藏精于肝?！膘`樞大惑論說:“五臟六腑之精氣皆上注 而為之精?！彼貑栁迮K生成篇說: “人臥，血?dú)w于肝，肝受血而能視。”肝的功能，能主持目的生理功能活 包含有“肝開竅 ”之含義，而且包含有“肝氣通生克制化，臟腑經(jīng)絡(luò)陰陽貫通之理

8、，說明眼之生理，并引伸其病理。肝之經(jīng)脈通暢無阻、肝志調(diào)達(dá)、肝之疏泄、儲(chǔ)藏、調(diào)節(jié)血?dú)狻⒀康墓δ苷?，肝氣通目無礙，肝藏之氣血奉心有制，目中肝氣調(diào)和，目中五臟之精氣才能協(xié)調(diào)不紊。則目視精明。故經(jīng)云“肝主目”。所以臨床診治目病，莫 不首先考慮從肝論治也。近年來應(yīng)用中治療性角膜炎，在辨證、選方、制劑以及對(duì) HSK 復(fù)發(fā)的認(rèn)識(shí)和治療上，有了長(zhǎng)足的發(fā)展。中治療性角膜炎療效可靠，治愈時(shí)間短，復(fù)發(fā)率低，毒副作用少，為性角膜炎的治療帶來光明的前景。中治療 HSK，不僅能顯著提高臨床療效，還能有效降低復(fù)發(fā)8。雖然中醫(yī)以整體調(diào)理、辨證 治療HSK取得了一定進(jìn)展，但還存在著以下幾點(diǎn)：中 抗HSK 復(fù)發(fā)的研究多為臨床

9、療效的觀察，缺少基礎(chǔ)研究的佐證，研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性也受到 認(rèn)識(shí)水平和客觀條件差異的影響。療效機(jī)理研究不夠深入。因此，要想進(jìn)一步探討HSK 復(fù)發(fā)機(jī)制，提高抗HSK 復(fù)發(fā)療效，必須結(jié)合現(xiàn)代前沿技術(shù)開展中 抗療效和機(jī)理研究，在臨床觀察的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究中藥方劑抗HSK 復(fù)發(fā)的免疫學(xué)機(jī)制，為中西醫(yī)結(jié)合預(yù)防HSK 復(fù)發(fā)提供科學(xué)的理論依據(jù)。本研究以中醫(yī)基礎(chǔ)理論為指導(dǎo)，從肝論治 性角膜炎，從臨床臨床療效評(píng)價(jià)（隨機(jī)、雙盲對(duì)照臨床試驗(yàn)）到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究（構(gòu)建 的細(xì)胞及動(dòng)物模型）進(jìn)行中 治療 性角膜炎的系統(tǒng)研究，以期闡明其防治 性角膜炎的作用機(jī)制，為其在臨床廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)中醫(yī)認(rèn)

10、識(shí)在祖國(guó)醫(yī)學(xué)，根據(jù) HSK 損傷程度和范圍不同相當(dāng)于“銀星獨(dú)現(xiàn)”、“聚星障”、“”、“凝脂翳”、“混晴障”的范疇。認(rèn)為病發(fā)于黑睛，在五輪學(xué)說中病屬風(fēng)輪，在臟屬肝。本病多為風(fēng)熱之邪誘發(fā)，起初毒邪尚淺，黑睛出現(xiàn)星點(diǎn)狀翳稱“銀星獨(dú)現(xiàn)”。如風(fēng)熱之邪更進(jìn)一步則生簇狀片狀樹枝狀云翳，稱聚星障，隨著外邪的進(jìn)一步熾盛，向內(nèi)深入，易產(chǎn)生，凝脂翳、混睛障等重癥。也有認(rèn)為，本病反復(fù)發(fā)作則“久病必虛”。主要病因是伏邪內(nèi)傷，新感即發(fā)，病機(jī)為氣留，邪熱內(nèi)伏，是在邪侵正虛的基礎(chǔ)上，演變?yōu)檎龖俚幕セ贾畡?shì)，治宜益氣扶正，清熱解毒。古人對(duì)本病病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)著重從內(nèi)外兩個(gè)方面入手，在外強(qiáng)調(diào)風(fēng)熱、火熱為病，在內(nèi)為臟腑功能失調(diào)。其中原

11、機(jī)啟微深刻闡述本病的病因病機(jī)為“風(fēng)熱不制”， 風(fēng)的來源雖然有二，或自外來，或自內(nèi)生，唯病則一。因此，至今諸多醫(yī)家仍抓住 這一特點(diǎn)，始終以祛風(fēng)為主。目前對(duì) HSK 的病因病機(jī)已基本完善，主要認(rèn)為是外感風(fēng)熱或風(fēng)寒之邪外侵，上犯 ；或外邪入里化熱，肝經(jīng)伏火，復(fù)受，熏蒸黑睛；或肝腎陰虛，熱病后陰津虧耗，虛火上炎導(dǎo)致。本屬風(fēng)輪，內(nèi)應(yīng)于肝，肝膽互為表里。故本當(dāng)可引起“從肝論治本病發(fā)于黑睛，中醫(yī)眼科理論中，黑睛屬于五輪輪，內(nèi)應(yīng)于肝，其病變主要表現(xiàn)為黑睛生翳，故從肝論治，辨證求因，審因退翳，清肝、疏肝、柔肝、暖肝等多可達(dá)到退翳明目之功效。辨證論治是中醫(yī)治療性角膜炎的優(yōu)勢(shì)所在。在治療該病時(shí)采用辨病與辨證相結(jié)合的

12、方法，根據(jù)患者的體質(zhì)、病程長(zhǎng)短、病變的深淺及臨床表現(xiàn)等進(jìn)行辨證論治。本病早期（急性期）多為實(shí)證，采用疏風(fēng)清熱、清肝瀉火治療。主方以銀翹散清熱解毒祛風(fēng)，、連翹、桑葉具有疏散風(fēng)熱、透散衛(wèi)分表邪之功用；薄荷、牛蒡子 ，具有清利頭目、解毒之功；荊芥、防風(fēng)、淡豆鼓、蘆根、竹葉具有解表祛 、生津之功。諸藥合用，當(dāng)奏清熱解毒疏風(fēng)之功，并隨證加減。由于HSK的復(fù)發(fā)主要是全身或局部免疫功能下降而引起，中醫(yī)中藥治療單純皰疹性角膜炎的效果是肯定的。本病反復(fù)發(fā)作則“久病必虛”。主要病因是伏邪內(nèi)傷，新感即發(fā)，病機(jī)為氣留，邪熱內(nèi)伏，是在邪侵正虛的基礎(chǔ)上，演變?yōu)檎?在更昔洛韋滴眼液點(diǎn)眼的基礎(chǔ)上聯(lián)合銀翹散加減治療HSK，隨訪

13、1 年，有效率為83.33%，復(fù)發(fā)率為5.00%，對(duì)照組有效率和復(fù)發(fā)率為78.33%和13.33%。等10運(yùn)用玉屏風(fēng)散聯(lián)合抗病物治療復(fù)發(fā)性HSK，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的平均治愈時(shí)間及復(fù)發(fā)率較對(duì)照組明顯降低（實(shí)驗(yàn)組復(fù)發(fā)率為10.3%，對(duì)照組為40.0%）。中醫(yī)外治中藥外治法是中醫(yī)眼科治療眼病，尤其是外障眼病的重要，外用中藥在治療HSK 及控制其復(fù)發(fā)上具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。中藥熏洗及離子導(dǎo)入 治療原理是通過電極回流在病灶周圍形成局部電流場(chǎng)，產(chǎn)生生理、生化、生物藥效的集中效應(yīng)，達(dá)到改善局部血液循環(huán)、促進(jìn)組織滲出物的吸收、增加局部藥效的目的。魏寶豐等11運(yùn)用復(fù)方制劑清熱解毒湯，通過超聲霧化給藥治療HSK，以韋（a

14、ciclovir，ACV）為對(duì)照，結(jié)果治療組有效率（94.73%）明顯高于對(duì)照組（77.50%），隨訪1 年，治療組的復(fù)發(fā)率相對(duì)較低（治療組10.00%，對(duì)照組23.33%）。針灸 常用穴：睛明、四白、絲竹空、攢竹、合谷、足三里、光明、肝俞等，每次取局部1-2穴，遠(yuǎn)端1-2穴，1次，視病情酌用補(bǔ)瀉手法。方法：毫針針刺一次，留針30分鐘，留針期間行針3-5次（精明穴除外）。中藥復(fù)方滴眼液 由于血液與眼之間存在著血-眼屏障，加之外眼炎癥本身就增加了組織的通透性，所以作用于眼的藥物多數(shù)情況下以局部給藥效果較好，滴眼劑以其吸收快、刺激性小、使用方便等特點(diǎn)而在臨床中廣為運(yùn)用。從臨床觀察，復(fù)藥滴眼液對(duì)HS

15、K 有明顯的治療作用，有望加快抗HSV 中藥眼藥制劑提前進(jìn)入市場(chǎng)。嚴(yán)謹(jǐn)?shù)那罢靶钥蒲性O(shè)計(jì)，篩選和驗(yàn)證出可重復(fù)性強(qiáng)的有效或高效方藥。重視中藥復(fù)方滴眼液的開發(fā)，加強(qiáng)臨床及實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)研究，開展規(guī)范化的臨床科研觀察，為闡明中治療性角膜炎的作用機(jī)理，提供客觀科學(xué)依據(jù)。機(jī)制研究單純皰疹 性角膜炎( h es simplex keratitis, HSK) 是 最嚴(yán)重的角膜 性疾病之一，在 的 約為11.8/105 。目前已知可致HSK 的病原體為單純皰疹 -1型( h es simplex -1, HSV-1) 與單純皰疹 -2 ( h es simplex -2, HSV-2) ，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明

16、晰。HSV-1HSV-1 引起的HSK 占主要部分，為國(guó)內(nèi)外最常見的致盲眼病之一。Shimeld12于1982 年首次從人類角膜中分離出HSV-1，后Easty 等13于1987 年從慢性基質(zhì)型角膜炎中分離出HSV-1。其發(fā)病機(jī)制與的侵入、轉(zhuǎn)移、潛伏、復(fù)發(fā)等環(huán)節(jié)有關(guān)，同時(shí)與的免疫應(yīng)答相關(guān)。 初次與HSV-1 一般通過直接接觸進(jìn)入宿主黏膜組織，其最具可能的宿主是口腔，此后HSV-1 也可通過飛沫 接觸眼表結(jié)構(gòu)或通過角膜移植造成。HSV-1 進(jìn)入角膜的過程由粘連蛋白-1 ( nectin-1) 、皰疹侵入載體(h esentry mediator, HVEM) 以及配對(duì)免疫球蛋白樣2 型受體- (

17、paired immunoglobulin-like type 2 receptor , PILR-) 介導(dǎo)。HSV-1 對(duì)角膜的易感性與HSV-1 株的來源及其被 者 、免疫應(yīng)答、淚膜結(jié)構(gòu)與功能的完整性有關(guān)14, 15。HSV-1 初次 角膜時(shí)，其快速、有效的 能力一定程度上幫助延長(zhǎng)了HSK 的病程，并為之后的潛伏和復(fù)發(fā)做了準(zhǔn)備。 潛伏與再活化 HSV 有存在于宿主特定部位同時(shí)不進(jìn)行蛋白-即潛伏的能力，HSK也隨即進(jìn)入潛伏期。HSV-1在神經(jīng)系統(tǒng)最常見的潛伏部位是三叉神經(jīng)節(jié)，此外還有脊髓、膝狀體、神經(jīng)、迷走神經(jīng)的神經(jīng)節(jié)以及睫狀神經(jīng)節(jié)等部位。目前HSV-1 潛伏的機(jī)制為、神經(jīng)元、 CD8 +

18、T細(xì)胞三者互相作用的過程。整個(gè)過程大體可分建立潛伏、維持潛伏、再活化3 個(gè)階段16。HSV 在潛伏的維持期不 新的蛋白，因而難以被免疫系統(tǒng)識(shí)別，因此患者處于潛伏期時(shí)幾乎無任何癥狀。HSV-1 的再活化可以自然產(chǎn)生，也可以由某些 誘發(fā)。目前已知能夠誘發(fā) 內(nèi)的HSV-1 再活化的環(huán)境 有發(fā)熱、風(fēng)、暴曬、 以及三叉神經(jīng)節(jié)相關(guān)的外科措施等17。 復(fù)發(fā)與再次再活化的HSV-1 和HSV-2 在角膜所誘發(fā)的免疫應(yīng)答迅速而頻繁；雖然其中大多次數(shù)的免疫應(yīng)答不會(huì)引起明顯的臨床癥狀，但再活化的HSV 還是可以導(dǎo)致HSK 的復(fù)發(fā)。角膜及其附近感覺神經(jīng)分布較為密集，因而角膜是HSV-1 相關(guān)疾病復(fù)發(fā)最頻繁的場(chǎng)所之一。

19、由于復(fù)發(fā)引起的免疫應(yīng)答屬于獲得性免疫應(yīng)答，因此HSK 開始復(fù)發(fā)的過程較為短暫，并且能夠?qū)е陆悄せ|(zhì)層不可逆的損傷，造成嚴(yán)重且反復(fù)發(fā)作的臨床癥狀，包括角膜混濁、新生形成等，甚至導(dǎo)致失明。能夠增加HSK 復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的，有先前的基質(zhì)型角膜炎史；而與 、性別、種族、季節(jié)、心理，甚至上皮型角膜炎和非眼部的HSV-1史都無關(guān)。HSV-2HSV-2 引起的HSK雖低于HSV-1，但由于HSV-2 可通過性及母嬰，因而能 夠引起新生兒HSV性疾病。顯示13%20%HSV 的新生兒有眼部的表現(xiàn)。而對(duì)于嬰幼兒而言，HSV-2 比HSV-1 更具神經(jīng)毒性。此外，由于HSV-2 的與人類免疫缺陷病毒的密切相關(guān)，因而HS

20、V-2性疾病又被歸為一種性疾病。HSV-2 的及宿主應(yīng) 答的機(jī)制與HSV-1 極為相似，同樣分為的侵入、轉(zhuǎn)移、潛伏、復(fù)發(fā)等環(huán)節(jié)。和HSV-1 類似， HSV-2 也可以直接進(jìn)入角膜，這一過程可能由HVEM 介導(dǎo)。關(guān)于HSV-2 能否潛伏于三叉神經(jīng)節(jié)仍然沒有結(jié)論； 相比之下，脊神經(jīng)節(jié)是公認(rèn)的HSV-2 最常潛伏的神經(jīng)節(jié)。2.2.5 HSK 模型和評(píng)價(jià)建立理想的動(dòng)物模型是進(jìn)行 HSK 的發(fā)病研究的先決條件。HSV擁有廣泛的宿主范圍，能夠多種種屬的動(dòng)物和細(xì)胞。理想的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛻?yīng)易于建立潛伏 不會(huì)自發(fā)復(fù)發(fā)。兔眼球大小與人類相似易于建立潛伏 和觀察但存在自發(fā) 毒 和自發(fā)復(fù)發(fā)，因而不是理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型

21、，大鼠也是較常用的建模動(dòng)物，但在 潛伏 的過程中，往往伴有 的自發(fā)性再激活，因而常用來進(jìn)行 HSV-I自發(fā)性再激活的研究。相對(duì)于以上其他動(dòng)物，小鼠則有其不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，小鼠既易建立起潛伏 ，也不易復(fù)發(fā)，目前被國(guó)際上公認(rèn)為是理想的研究 HSK 的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。此外，目前有關(guān)小鼠的免疫學(xué)試劑的大量開發(fā)應(yīng)用，也為研究 HSK 的免疫病理機(jī)制提供了保障。HSV 潛伏 的建立方法也是多種不一的，鼻內(nèi)接種、腳趾接種、角膜劃痕接種、尾靜脈接種甚至拔牙接種，不同的接種途徑在潛伏 建立的成功率以及動(dòng)物的 率上存在著差異，角膜劃痕接種易操作，且急性期角膜 癥狀明顯可靠，相對(duì)于上述其他方法引起的全身癥狀較輕，尤其是

22、腦炎的 較低，但潛伏 的發(fā)生率較高，不失為一理想、可靠的方法。目前用的最多的是近交系 NIH 小鼠和純系 BALB/c 小鼠。2.2.6 治療西醫(yī)治療抗藥物 無環(huán)鳥苷(ACV)：Schwartz 等研究發(fā)現(xiàn)，服用無環(huán)鳥苷的 HSK緩解效果良好，所有均能很好的適應(yīng)無環(huán)鳥苷，無不良反應(yīng)，認(rèn)為口服無環(huán)鳥苷對(duì)治療 HSK 效果好，有利于治療和預(yù)防HSV 對(duì) ACV 極易產(chǎn)生耐藥性18，且 ACV 水溶性較差，臨床多用眼膏制劑，但眼膏使視物有模糊感，舒適性差，尤其不適合于老年人及兒童；丙氧鳥苷(DHPG)：丙氧鳥苷是 1982 年的一種核苷類抗制劑， 對(duì) HSV 的作用可能與 ACV 相同， 即通過特異

23、性胸腺嘧啶核苷激酶 (TK) 被磷酸化，然后選擇性的抑制DNA 合成；復(fù)方無環(huán)鳥苷：復(fù)方無環(huán)鳥苷含有環(huán)胞苷與無環(huán)鳥苷兩類抗藥物。環(huán)胞苷是非選擇性抗藥物，在體內(nèi)代謝為阿糖胞苷，然后三磷酸化，抑制 DNA 聚合酶，阻礙DNA而發(fā)揮作用。但它對(duì)正常宿主細(xì)胞 DNA 的也有作用。無環(huán)鳥苷是選擇性抗藥物，它與誘導(dǎo)的特異性酶的底物結(jié)構(gòu)相似，從而消耗特異酶，影響DNA 的， 但對(duì)正常細(xì)胞DNA無影響。兩類藥物聯(lián)合應(yīng)用，降低了藥物用量，提高了藥物療效，減少了對(duì)正常細(xì)胞 DNA 復(fù)制的影響，因此大大提高了抗 能力，減少了副作用；干擾素( erferon, IFN)： IFN 分子與受體相結(jié)合，活化 25 寡聚糖

24、 酶與蛋白激酶，最終阻礙 蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，的繁殖。較早期 Sundmacher 以 IFN- 和 IFN- 聯(lián)合其他抗藥物治療樹枝狀角膜炎取得了較好的療效。低濃度皮質(zhì)類固醇 HSK 盤狀角膜炎，若激素，可引起樹枝狀角膜潰瘍。但等研究發(fā)現(xiàn)，局部使用抗炎性皮質(zhì)類固醇，對(duì)HSK 的影響，取決于其劑量的大小及使用頻率。低濃度類固醇，在使用少的情況下是安全的?？顾幬锱浜系蜐舛绕べ|(zhì)類固醇治療，效果良好。鋅劑局部治療 鋅離子具有抑制 HSV 的作用，硫酸鋅滴眼劑治療 HSK 有效。鋅離子透入法對(duì)眼部無刺激，可通過適當(dāng)強(qiáng)度的電流刺激被 HSV 損傷的角膜末梢神經(jīng)，促進(jìn)神經(jīng)代謝，增加神經(jīng)對(duì)角膜的營(yíng)養(yǎng)供給。局部補(bǔ)鋅

25、可彌補(bǔ)淚液量 ，抑制 HSV 的 ，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和促進(jìn)病灶恢復(fù)。人重組白細(xì)胞介素 2 (hrIL-2) 無環(huán)鳥苷能抑制 HSV 的 ，控制發(fā)病，但停藥后復(fù)發(fā)率較高，原因主要是無環(huán)鳥苷不能徹底清除 ，而徹底清除 則主要依靠自身的免疫功能來完成。為此有學(xué)者選擇了 hrIL-2 與無環(huán)鳥苷聯(lián)合治療 HSK，病程比單用無環(huán)鳥苷明顯縮短，效果顯著。手術(shù)治療 Tanure 等觀察了 15 例 性角膜移植術(shù)治療的 HSK 患者。50 個(gè)月后，86 .7%的術(shù)眼角膜仍保持透明，53.3 %的患眼視敏度達(dá) 20/100 或更好，證明穿透性角膜移植有效。其中，加強(qiáng)術(shù)后護(hù)理與治療、保持經(jīng)常的潤(rùn)滑及術(shù)后為了保護(hù)角膜表

26、皮而采用的眼瞼縫合在手術(shù)成功與否中有重要作用。中 治療目前，西醫(yī)對(duì)HSK 的治療以化學(xué)的核苷類抗藥物為主， 但由于此類藥物易產(chǎn)生耐藥性。臨床應(yīng)用效果欠佳，尤其對(duì)反復(fù)不愈的HSK 療效更不理想。為研制低毒、高效和不易產(chǎn)生耐藥的新藥， 中藥研究是不可忽視的重要途徑。中藥制劑抗機(jī)制一方面可能與直接滅活或誘生干擾素，減少或阻斷mRNA 的翻譯有關(guān)；另一方面調(diào)整免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫功能，而后者顯得更為重要19。國(guó)內(nèi)的一些學(xué)者已把研制治療HSK 新藥的重點(diǎn)放在了中草藥上，并取得了一些重要成果。復(fù)明2號(hào)是一種中藥復(fù)方制劑，主要成分為:連翹、黃芩、 、黃芪、白術(shù)、黨參等，具有廣譜的抗菌抗 作用。 不僅能滅活 ，

27、而且可以延緩 引起的細(xì)胞病變。此外，復(fù)明2 號(hào)中含有多種氨基酸、亞麻酸及葡萄糖，可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)HSV-1 的抵抗力，對(duì)維持細(xì)胞的壽命有一定作用。復(fù)明2 號(hào)這種綜合調(diào)整的功能是其優(yōu)于其他抗 藥物的主要特征。單純皰疹造成角膜實(shí)質(zhì)病變，并非本身所致，機(jī)體免疫功能的改變對(duì)單純皰疹性角膜炎發(fā)病有十分重要的作用，而內(nèi)服中藥治療單純皰疹性角膜炎，主要是提高機(jī)體免疫力，而發(fā)揮其獨(dú)特的作用。外用中藥治療單純皰疹性角膜炎及控制復(fù)發(fā)有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)已被眼科界認(rèn)同。中藥內(nèi)服、外用治療單純皰疹性角膜炎，對(duì)減少?gòu)?fù)發(fā)、縮短療程、提高視力具有較好的療效。根據(jù)中整體調(diào)節(jié)理論，辨證論治，可望明顯縮短病程，甚至大大降低復(fù)發(fā)率。中西醫(yī)結(jié)合

28、治療HSK已顯示出其優(yōu)越的療效，近年來已越來越受到眼科界的重視。加強(qiáng)有效藥物、方劑的篩選，開發(fā)具有知識(shí)的新藥，將為治療HSK開辟更為廣泛的前景。參考文獻(xiàn)：1.,. 眼科學(xué). 第 7 版.:人民衛(wèi)生, 2008:116.2. Duan R, van Dun JM, Remeijer L, et al. Prevalence of hes simplextype 1 glycoprotein G (gG) and gI genotypes in patients with hetic keratitis. Br J Ophlmol 2008; 92(9): 1195-1200.3. 單純皰疹 性角

29、膜炎. : 人民衛(wèi)生 2005: 1220-4.4. Kaye S, Choudhary A. H es simplex keratitis. Prog Retin Eye Res 2006; 25(4): 355-80. 5. 主編. 眼科學(xué). : 人民衛(wèi)生 , 2005:184-6.Cooper D, Mester JC, Guo M, et al. topemap of full21length glycoprotein D from HSV22 reveals a novel CD4+ CTL tope 2 located at the transmembrane 2 cytoplas

30、mic junction. Cell Immunol, 2006, 239(2):113-20.,. 環(huán)香酮滴眼液治療家兔單純皰疹 性角膜炎.眼科雜志, 2009; 19(5): 255-9.,云. 中西醫(yī)結(jié)合治療單純皰疹 性角膜炎研究進(jìn)展. 遼寧中 大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 11(10): 77-79. 中西醫(yī)結(jié)合治療單純皰疹性角膜炎臨床體會(huì)J. 世界中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2010, 5(9): 780-781., 席興華. 玉屏風(fēng)散聯(lián)合抗治療復(fù)發(fā)性單純皰疹性角膜炎29 例療效觀察J. 2009, 19(2): 103-104.魏寶豐, 鄭, 等. 中藥超聲霧化眼浴治療單純皰疹性角膜炎臨床觀察J.

31、 天津中, 2009, 26（2）: 106-107.Shimeld C, Tullo AB, Easty DL, et al. Isolation of hes simplexfrom the cornea in chronic stromal keratitis. Br J Ophlmol 1982; 66 (10): 643-647.Easty DL, Shimeld C, Claoue CM, et al. Hes simplexisolation in chronic stromal keratitis: human and laboratory studies. Curr Eye

32、Res 1987; 6 (1): 69-74.Al-Dujaili LJ, Clerkin PP, Clement C, et al. Ocular hes simplex: how are latency， reactivation，recurrent disease and therapyerrelated. Future Microbiol, 2011, 6( 8) : 877-907Rowe AM, St Leger AJ, Jeon S, et al. Hes keratitis. Prog Retin Eye Res, 2013, 32: 88-101Perng GC, Jones

33、 C. Towards an understanding of the hes simplextype 1 latency-reactivation cycle.erdiscip Perspect Infect Dis, 2010, 2010: 262415.Al-Dujaili LJ, Clerkin PP, Clement C, et al. Ocular hes simplex: how are latency, reactivation, recurrent disease and therapyerrelated. Future Microbiol, 2011, 6( 8) : 87

34、7-907Collins P, Darby G. Laboratory studies of hes simplexstrains resistant to acyclovir. Rev Med Virol. 1991, 1: 19-28.19.,.性角膜炎的中治療. 吉林中, 2012, 32 (4): 362-363.三、項(xiàng)目?jī)?nèi)容和研究方案研究目標(biāo)和考核指標(biāo)進(jìn)行中 從肝論治 性角膜炎的隨機(jī)、雙盲臨床療效評(píng)價(jià)試驗(yàn)，科學(xué)評(píng)價(jià)從肝論治性角膜炎的可靠療效；探討本病的發(fā)病與復(fù)發(fā)與免疫調(diào)節(jié)平衡的聯(lián)系、辨證分型與免疫調(diào)節(jié)的聯(lián)系、辨證論治方藥對(duì)免疫調(diào)節(jié)作用及對(duì)免疫調(diào)節(jié)平衡的影響，篩選出能選擇性作用于免疫系

35、統(tǒng)各亞群細(xì)胞的中藥和方劑，為中 防治 性角膜炎奠定理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究結(jié)果預(yù)計(jì) 影響因子 2.0 以上SCI 4 篇；申請(qǐng)發(fā)明專利 2 項(xiàng)；建設(shè)中藥抗作用機(jī)制創(chuàng)新團(tuán)隊(duì) 1 個(gè)；培養(yǎng)技術(shù)骨干 3 名；培養(yǎng) 3 名。研究?jī)?nèi)容、研究方案內(nèi)容 1: 從肝論治性角膜炎臨床研究。 臨床療效評(píng)價(jià) 隨機(jī)、雙盲對(duì)照臨床試驗(yàn)。中醫(yī)治療組：生理鹽水滴眼液+中藥湯劑（辨證論治：急性期：清肝疏風(fēng)解毒/復(fù)發(fā)期：柔肝解毒+中醫(yī)外治（中藥復(fù)方滴眼液、中藥熏洗、針灸）；西醫(yī)對(duì)照組：韋滴眼液+中藥安慰劑。進(jìn)行系統(tǒng)臨床評(píng)價(jià)：臨床癥狀評(píng)價(jià)；臨床療效評(píng)價(jià)；復(fù)發(fā)率評(píng)價(jià)。 HSK 患者淚液標(biāo)本中HSV 的DNA 提取 取50 L 淚液加

36、入50 L 裂解液，55處理60 min，95處理5 min，16000 r/min 離心5 min，吸取2 L 上清液作DNA 模板。 多重PCR檢測(cè) 兩個(gè)多重PCR 反應(yīng)體系體積均為30 L。體系1 成分包括:20PCR Buffer 1.5L, 50 mmol/L MgCl2 1.0 L, 3 對(duì)特異性引物各6 pmol, TaqDNA 聚合酶1U, DNA 模板2 L,以雙蒸去離子水補(bǔ)足體積。體系2 成分除下游引物改為體系2 五條特異性引物各6 pmol 外，其他成分不變。體系1 的PCR 反應(yīng)參數(shù):預(yù)變性94 5 min；變性94 60 s，退火68 60 s，延伸 72 45 s,

37、 35 個(gè)循環(huán)；終延伸72 5 min。體系2 除將退火溫度改為56 外，其他參數(shù)不變。 PCR 產(chǎn)物經(jīng)2 % 瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈觀察，凝膠成像系統(tǒng)下照相 結(jié)果。 淚液免疫球蛋白（IgG、IgA） 淚液 治療前及治療療程結(jié)束后各 一次淚液， 具體為:取醫(yī)用清涼油少許涂于受檢眼下瞼距瞼緣 1 cm 的皮膚上，待產(chǎn)生淚液后，用 20 ul 吸管微量吸取結(jié)膜囊內(nèi)的淚液 80100 ul，置于無菌靜脈輸液管中，管端加熱封閉，待檢。檢測(cè)：采用免疫透射比濁法，將 10 ul 待檢淚液標(biāo)本與試劑加入生化儀，由生化分析儀自動(dòng)完成分析，記錄測(cè)定數(shù)據(jù)。內(nèi)容 2: 從肝論治 性角膜炎藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。 體外抗 實(shí)驗(yàn)（

38、 藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)）細(xì)胞培養(yǎng)和繁毒 Vero 細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)用來繁殖 和進(jìn)行 滴度滴定實(shí)驗(yàn)。具體的步驟為 Vero 在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)成單層細(xì)胞，待 90%密度時(shí)，棄去將適宜濃度的 懸液接種于細(xì)胞上，37吸附孵育 2 h；補(bǔ)加培養(yǎng)液至適宜體積(終濃度 2% FBS)，在 37 培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔一定時(shí)間觀察細(xì)胞是否發(fā)生病理變化(細(xì)胞 成團(tuán)、細(xì)胞變圓、空泡細(xì)胞形成等)，有明顯病理變化后，將細(xì)胞和細(xì)胞懸液放置于-80低溫冰箱中，反復(fù)凍融 3 次，離心收集上清液，用 0.22m 濾器過濾后分裝于-8保存待用。 TCID50 的檢測(cè)方法 將Vero 細(xì)胞鋪在 96 中，每孔 23l05 左右，于

39、恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 后，待 90%密度時(shí)將待測(cè) 液倍比稀釋 (10 倍梯度稀釋)，將稀釋好的 液接種到 96 中，每一個(gè)稀釋度接種 1 排，每孔接種 100 l (可自己選擇接種量)，用培養(yǎng)液補(bǔ)加到 200 l 進(jìn)行培養(yǎng)。每組設(shè)置對(duì)照組 (即正常的細(xì)胞不接種 )，觀察 35 天，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。對(duì)有細(xì)胞病變出現(xiàn)的孔確定為陽性孔，計(jì)算每個(gè)稀釋度下的陽性率。最后用 Reed-Nuench 兩氏法或 Karber 法進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。 中藥抗 復(fù)方 藥理學(xué) 中藥復(fù)方含藥 和 ACV 對(duì) HSV-I 作用在同一塊 96中同時(shí)進(jìn)行。傾去已形成單層的 Vero 細(xì)胞培養(yǎng)上清液，加入 TCID50 HSV

40、-I ，每孔 100 L，37 吸附 1 h 后吸去上清液，用 PBS 洗 2 次，洗去游離病毒。選用上述藥物的 TC0 為第一孔，以無 的 改良細(xì)胞培養(yǎng)基 (Dulbeccos modified eagle medium, DMEM) 作連續(xù) 2 倍系列稀釋 6 個(gè)濃度，每個(gè)濃度均做 5 孔，分別加入上述已感染 的Vero 細(xì)胞內(nèi)，每孔 100 L，37 5% CO2 培養(yǎng)，同時(shí)分別設(shè)立正常細(xì)胞對(duì)照及 對(duì)照。各培養(yǎng)板培養(yǎng) 7 d，每天觀察 CPE 1 次。CPE 分級(jí)與藥物細(xì)胞毒性測(cè)定相同，以 CPE 完全被抑制( 0 級(jí)) 的藥物最低濃度為抗 效果判斷終點(diǎn)。CPE 達(dá)“+”時(shí) 結(jié)果( 病變

41、范圍每孔 CPE25%為+, 50% 為+, 75% 為+, 75%為+) 。酶標(biāo)讀數(shù)儀比色 (波長(zhǎng) 570 nm) ，測(cè)吸光度(A 值) 后，按 Reed-Muench 方法計(jì)算細(xì)胞存活率、藥物半數(shù)抑制 濃度 ( IC50) ，以治療指數(shù)( ther utic index，TI) 評(píng)價(jià)藥物抗 HSV-I 的效果，TI=TC50/IC50。 體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn) HSK 小鼠模型 及給藥 所有HSK 小鼠模型隨機(jī)分為中藥組、中藥+、 、空白對(duì)照組四組，每組25只。另外只劃痕不接種HSV-I的 25只小鼠作為正常對(duì)照組。各組在接種 4 開始分別給予相應(yīng)的藥物和等量生理鹽水灌胃治療。給藥量按每100 g

42、體重1 ml計(jì)算，每天l 次，并每周稱1次體重，以調(diào)整給藥劑量。治療起止時(shí)間為HSV-I 接種第28天開始至第49天結(jié)束，連續(xù)3周。各模型組小鼠分組 喂養(yǎng)； 角膜炎癥評(píng)分； 指標(biāo)檢測(cè)（real-time PCR, Flow cytometric ysis, Histopathology)：炎性因子表達(dá)、T細(xì)胞亞群的比例變化、組織病理學(xué)改變。內(nèi)容 3: 從肝論治 性角膜炎免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究。 HSK小鼠模型 及判定標(biāo)準(zhǔn) HSK小鼠模型 及判定標(biāo)準(zhǔn)：Balb/c 小鼠適應(yīng)環(huán)境1wk 期間給予每只小鼠雙眼點(diǎn)滴2.5g /L 氯霉素滴眼液，2次/d。接種 前用10g /L 熒光素鈉對(duì)小鼠角膜進(jìn)行染色，并

43、在裂隙燈顯微鏡下檢查角膜情況，排除存在角膜或結(jié)膜病變者。 10g /L 水合氯醛( 0.04mL /10g) 腹腔注射麻醉下，顯微鏡下用5 號(hào)手術(shù)刀片背面尖端于右眼角膜呈“#”字劃痕，以 角膜上皮層為宜，再用吸管將5L 含或者不含2106PFU HSV- 的DMEM 滴于右眼角膜表面，閉合眼瞼后輕輕30s，以使液充分接觸角膜。模型制作后次 日，各組小鼠右眼繼續(xù)給予2.5 g/L 氯霉素滴眼液滴眼，2 次/d，連續(xù)2 wk。并于次日開始連續(xù)3d，每天用10g /L熒光素鈉染色后在裂隙燈顯微鏡下觀察角膜病變的發(fā)生情況，同時(shí)用棉拭子取右眼角膜表面淚液進(jìn)行HEK293T細(xì)胞檢測(cè)以確定有無。如接種眼在接

44、種后角膜出現(xiàn)點(diǎn)狀、樹枝狀或地圖狀病灶，而且角膜擦拭液HEK293T細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病理學(xué)改變(cell pathological effects，CPE )，即表現(xiàn)為HEK293T 細(xì)胞變大、變圓、呈葡萄狀改變，并使原本貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞部分脫離漂浮在DMEM 中，則判定為HSK模型制作成功； HSV潛伏模型的及判定標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)上述HSK小鼠模型右眼在2.5 g/L 氯霉素滴眼基礎(chǔ)上，增加1 g/L韋滴眼液，2次/d，連續(xù)2 wk，以促進(jìn)HSK 模型小鼠的急性上皮性角膜炎愈合，并使在三叉神經(jīng)節(jié)或角膜內(nèi)建立潛伏 。然后各組隨機(jī)抽取3 只模型小鼠，水合氯醛腹腔注射麻醉下 其角膜和三叉神經(jīng)節(jié)，進(jìn)行PCR 檢測(cè)。

45、如急性上皮性角膜炎 ，而角膜和三叉神經(jīng)節(jié) PCR 檢測(cè) 陽性，則確定為HSK 潛伏 模型建立； HSK 復(fù)發(fā) 小鼠模型 及判定標(biāo)準(zhǔn)：取 接種后7wk 并經(jīng)角膜和三叉神經(jīng)節(jié)樣本PCR 檢測(cè)證實(shí)為HSK 潛伏 期小鼠模型，將其右眼表面麻醉后， 在波長(zhǎng)為302 nm 的紫外線下照射3 min。紫外線透照儀功率為1.4 mW/cm2，照射強(qiáng)度為250 MJ/cm2。紫外線B 光照射后次日開始連續(xù)7 d，每天用10 g/L 熒光素鈉染色并在裂隙燈顯微鏡下觀察角膜是否再次出現(xiàn)點(diǎn)狀、樹枝狀、地圖狀病灶，并用蘸有DMEM 的棉拭子擦拭右眼角膜后進(jìn)行HEK293T 細(xì)胞培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞病理學(xué)改變(CPE)，以判

46、斷模型小鼠角膜擦拭液中是否有單純皰疹 存在。如在紫外線B 光照射后角膜再次出現(xiàn)點(diǎn)狀、樹枝狀或地圖狀角膜病變，且角膜擦拭液培養(yǎng)出現(xiàn)CPE 者即確定為HSK 復(fù)發(fā)期模型建立。 T 淋巴細(xì)胞亞群及其 的細(xì)胞因子與 HSK Th1 淋巴細(xì)胞與 HSK；Th2 淋巴細(xì)胞與 HSK；Th17 細(xì)胞與 HSK；Treg 細(xì)胞與HSK。 模型小鼠細(xì)胞因子檢測(cè)HSK各組隨機(jī)抽取5 只模型小鼠， 100 gL-1水合氯醛腹腔注射麻醉后無菌操作抽取下腔靜脈血0.50.6 mL (無需抗凝) ， 低溫離心( 3000 rm in-1) 10 min后收 集， 置- 20 冰箱保存?zhèn)溆?。將獲取的各組不同時(shí)期模型小鼠分別

47、按照IL-2、IL-4、 IL-10、C-IFN 試劑盒的說明書要求操作， 進(jìn)行各樣本中IL-2、IL-4、IL-10、C-IFN 含量檢測(cè)。 模型小鼠T淋巴細(xì)胞的提取與測(cè)定 100 gL-1水合氯醛腹腔注射麻醉模型小鼠后無菌操作其脾臟、淋， 在無菌超凈工作臺(tái)內(nèi)分別置于尼龍網(wǎng)上研磨后加入5 mL 小鼠淋巴細(xì)胞分離液。收集分離液于離心管內(nèi)緩慢注入500 L 1640培養(yǎng)基， 低溫離心( 2400 rm in-1) 30 min后用微量移液器吸出淋巴細(xì)胞層， 再加入PBS液至10 mL 混勻。再次低溫離心( 1200 rm in-1) 5 min使淋巴細(xì)胞沉于底層， 收集細(xì)胞后加入PBS液12 m

48、L于微量振蕩器上震蕩混勻后吸取100 L加入流式管內(nèi)， 并加入T 淋巴細(xì)胞抗體， 另外吸取100 L淋巴細(xì)胞加入各型抗體的同型對(duì)照。于流式細(xì)胞分析儀上檢測(cè)各型T淋巴細(xì)胞占T 淋巴細(xì)胞總數(shù)的百分比。項(xiàng)目預(yù)期解決的關(guān)鍵問題分析 T 細(xì)胞亞群的免疫失衡與單純皰疹性角膜炎發(fā)病及復(fù)發(fā)的關(guān)系，分析相關(guān) T 細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子的表達(dá)變化，探討 T 細(xì)胞亞群的表達(dá)失衡在單純皰疹性角膜炎發(fā)病中的分子機(jī)制，明確 T 細(xì)胞亞群表達(dá)失衡在單純皰疹性角膜炎發(fā)病過程中的意義。從臨床試驗(yàn)到動(dòng)物模型研究，進(jìn)一步證實(shí)中藥復(fù)方在防治單純皰疹性角膜炎中的作用，從體外、體內(nèi)直接抗作用到中藥復(fù)方對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)方面進(jìn)行系統(tǒng)、全面評(píng)價(jià)。

49、分析從肝論治單純皰疹性角膜炎的客觀指標(biāo)，揭示中醫(yī)辨證論治的實(shí)驗(yàn)學(xué)基礎(chǔ)。年度計(jì)劃與任務(wù)分解2015.01-2015.06: 完成體外抗實(shí)驗(yàn)及部分臨床實(shí)驗(yàn)。2015.07-2015.12: 完成單純皰疹性角膜炎動(dòng)物造模及部分臨床實(shí)驗(yàn)。2016.01-2016.06: 完成T 淋巴細(xì)胞亞群及其的細(xì)胞因子檢測(cè)分析、完成臨床實(shí)驗(yàn)。2016.07-2016.12: 數(shù)據(jù)分析，文章投稿。3.4 項(xiàng)目年度任務(wù)和考核指標(biāo)年度年度任務(wù)年度考核指標(biāo)重要任務(wù)的時(shí)間節(jié)點(diǎn)2015 年開展臨床療效評(píng)價(jià)研究開展體外抗實(shí)驗(yàn)開展免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究完成動(dòng)物體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)1 篇中文的撰寫及投稿1 篇SCI 文章的撰寫及投稿1 項(xiàng)發(fā)明專

50、利的申請(qǐng)2015.122016 年完成臨床療效評(píng)價(jià)研究完成體外抗實(shí)驗(yàn)完成免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究3 篇SCI 文章撰寫及投稿1 項(xiàng)發(fā)明專利的申請(qǐng)培養(yǎng) 2 名培養(yǎng)中抗創(chuàng)新團(tuán)隊(duì) 1 個(gè)2016.123.4 聯(lián)合任務(wù)分工情況注：可根據(jù)內(nèi)容自行調(diào)整任務(wù)名稱聯(lián)合任務(wù)負(fù)責(zé)人目標(biāo)研究?jī)?nèi)容考核指標(biāo)重要任務(wù)的時(shí)間節(jié)點(diǎn)建議經(jīng)費(fèi)（萬元）免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究山東中大學(xué)眼科研究所明確T 細(xì)胞亞群表達(dá)失衡在單純皰疹性角膜炎發(fā)病過程中的意義。分析T 細(xì)胞亞群的免疫失衡與單純皰疹性角膜炎發(fā)病及復(fù)發(fā)的關(guān)系SCI2 篇、申請(qǐng)發(fā)明專 利 1 項(xiàng)2016.1225 萬臨床療效評(píng)價(jià)研究山東中大學(xué)第二附屬醫(yī)院明確從肝論治性角膜炎的確切療效開展隨機(jī)、

51、雙盲臨床 對(duì)照實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行臨床 療效評(píng)價(jià)中文1 篇SCI1 篇2016.610 萬抗藥效學(xué)研究山東中大學(xué)明確中醫(yī)藥能在體內(nèi)外直接滅活從肝論治中藥體外及體內(nèi)的直接抗病毒作用SCI1 篇、申請(qǐng)發(fā)明專 利 1 項(xiàng)2016.1215 萬四、項(xiàng)目技術(shù)路線、知識(shí)對(duì)策及市場(chǎng)分析項(xiàng)目技術(shù)路線及其先進(jìn)性和可行性分析（說明其主要技術(shù)創(chuàng)新點(diǎn)）技術(shù)路線：可行性分析：理論條件：本課題是在閱讀大量相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上制定，并結(jié)合臨床實(shí)踐進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和相關(guān)研究 。本課題所需要的技術(shù)：申請(qǐng)者與主要參與者已掌握了實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎大鼠模型的制作方法，能夠熟練進(jìn)行動(dòng)物觀察拍照及標(biāo)本的取材，可應(yīng)用于本項(xiàng)目的研究；申請(qǐng)者與本項(xiàng)目

52、的實(shí)驗(yàn)也熟練掌握了流式細(xì)胞儀、RT-PCR、免疫組化、等分子生物學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)技能，可以為本項(xiàng)目的實(shí)施提供保障。技術(shù)水平：山東中大學(xué)及眼科內(nèi)設(shè)有國(guó)家中管理局視覺分析三級(jí)科研 一個(gè)，擁有一整套完整的國(guó)際先進(jìn)的眼科和視光學(xué)檢查設(shè)備。擁有獨(dú)立的眼科分子生物學(xué) 、眼科免疫 、眼科藥理 、眼科病理室、眼科顯微手術(shù) 。 擁有本項(xiàng)目研究相關(guān)的大部分生化、細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)、藥理學(xué)等方面的各種儀器設(shè)備，整套 檢測(cè)系統(tǒng)，如層流無菌室、流式細(xì)胞儀、溫度梯度 PCR 儀、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀、高速臺(tái)式離心機(jī)、熒光顯微鏡、倒置顯微鏡、高速雙波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、凝膠成像系統(tǒng)、多功能電泳儀、-80C 超低溫冰箱等，為本項(xiàng)目開

53、展提供了儀器、技術(shù)支持和信息 。知識(shí)和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)分析及對(duì)策（含國(guó)內(nèi)、國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力分析）知識(shí)分析及對(duì)策國(guó)內(nèi)外未檢索到關(guān)于中藥和中藥復(fù)方抗 作用機(jī)制方面的專利。通過本研究擬對(duì)從肝論治中藥復(fù)方申請(qǐng)專利，所以本項(xiàng)目不存在新藥、專利及行政保護(hù)方面 。技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)分析及對(duì)策目前缺乏中藥和中藥復(fù)方抗 的免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗凋亡等作用機(jī)制研究，尚無此類研究的國(guó)家和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。通過本項(xiàng)目的順利實(shí)施，可起草制定中藥或中藥復(fù)方抗 性角膜炎標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范，指導(dǎo)和規(guī)范抗 中藥和復(fù)方的研究與開發(fā)。由于本課題具有較好的先期工作基礎(chǔ)，從肝論治 性角膜炎療效可靠， 認(rèn)為達(dá)到本課題目標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)較小。預(yù)期產(chǎn)品的市場(chǎng)分析或技術(shù)成果應(yīng)用分析性角膜炎在

54、角膜病中致盲率占第一位，是由 引起的角膜炎癥，以單純皰疹病毒性角膜炎最為常見，且嚴(yán)重危害視功能。目前國(guó)內(nèi)用于治療 HSK 的首選藥物是無環(huán)鳥苷，國(guó)外已大量 從臨床標(biāo)本中分離出耐藥株，單純抗 顯然已不再適應(yīng)當(dāng)前的治療。中 治療 性角膜炎療效可靠，治愈時(shí)間短，復(fù)發(fā)率低，毒副作用少，為 性角膜炎的治療帶來光明的前景。由于中藥和中藥復(fù)方抗 的作用機(jī)制不清，目前國(guó)內(nèi)尚無治療 性角膜炎的中藥制劑。本課題利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和免疫技術(shù)，從免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗凋亡等方面研究從肝論治 性角膜炎的作用機(jī)制，研究成果應(yīng)具有較好的市場(chǎng)前景。五、基礎(chǔ)條件和優(yōu)勢(shì)項(xiàng)目責(zé)任和聯(lián)合、團(tuán)隊(duì)的基本情況（包括與項(xiàng)目實(shí)施相關(guān)的實(shí)力和基礎(chǔ)，

55、以往的業(yè)績(jī)和成就，承擔(dān)相關(guān)項(xiàng)目情況）責(zé)任 簡(jiǎn)介項(xiàng)目責(zé)任 山東中 大學(xué)現(xiàn)在有 4 個(gè)國(guó)家中 管理局三級(jí) ，2 個(gè)國(guó)家中管理局 。共有大型儀器 36 套，包括色譜室(高效液相色譜室、氣相色譜室)、光譜室(紫外光譜室、721 室、751 室)、ShimazuU-2550 紫外可見分光光度計(jì)、日立U-2800 紫外可見分光光度計(jì)、Agilent CE-MS、Agilent1200 HPLC-6300MS、Agilent5895 GC-MS、激光共聚焦掃描顯微鏡、紅外光譜儀、流式細(xì)胞儀、功能性磁 成像儀等大型科研儀器，為本課題研究的開展提供硬件支持。項(xiàng)目責(zé)任 山東中 大學(xué)眼科 內(nèi)設(shè)有山東省 一個(gè)。 擁有

56、獨(dú)立的分子生物學(xué)藥物 室、藥理、病理室、顯微手術(shù)、儀器分析室、電泳分析室、動(dòng)物以及資料室等相關(guān)科室。擁有本項(xiàng)目研究相關(guān)的生化、細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)等方面的各種儀器設(shè)備，如層流無菌室、培養(yǎng)箱、高效液相色譜儀、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀、流式細(xì)胞儀、冷凍切片機(jī)、電腦全自動(dòng)脫水機(jī)、石蠟切片機(jī)、染色機(jī)、高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)、激光共聚焦顯微鏡、高速雙波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、凝膠成像系統(tǒng)、多功能電泳儀、-80C 超低溫冰箱等，為本項(xiàng)目開展提供了必要的儀器、技術(shù)支持和信息。研究實(shí)力和前期基礎(chǔ)研究實(shí)力：近年來先后主持承擔(dān)國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家科技支撐計(jì)劃、部 專項(xiàng)等國(guó)家和 科研項(xiàng)目 20 余項(xiàng)，先后獲得省、部、廳、局級(jí)科技

57、進(jìn)步獎(jiǎng) 22 項(xiàng)次， 國(guó)內(nèi)外核心期刊、SCI 學(xué)術(shù) 200 余篇， 十幾部著作及 、申請(qǐng)國(guó)家專利 4 項(xiàng)，獲省科技進(jìn)步一等獎(jiǎng) 2 項(xiàng)、二等獎(jiǎng) 3 項(xiàng)，三等獎(jiǎng) 5 項(xiàng)，在專項(xiàng)研究上已達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。前期基礎(chǔ)：免疫調(diào)節(jié)研究 祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為陰陽失衡是致病的根源，疾病的發(fā)生取決于邪長(zhǎng)正消，機(jī)體免疫功能 、破壞。中藥由于其 的優(yōu)勢(shì)，毒副作用小，在增強(qiáng)或抑制免疫力方面有著西藥無可比擬的優(yōu)點(diǎn)，臨床采用中藥對(duì)證治療能扶正祛邪， 滋陰，實(shí)現(xiàn)陰陽平衡，確保機(jī)體健康。 前期研究發(fā)現(xiàn)，清開靈眼用凝膠可有效改善眼部的免疫微環(huán)境，提高 T 細(xì)胞的比值、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，恢復(fù)眼免疫微環(huán)境的平衡，對(duì)眼免疫微環(huán)境具有較好

58、的免疫調(diào)節(jié)作用；龍膽瀉肝湯可對(duì)葡萄膜炎大鼠的炎癥反應(yīng)具有明顯的抑制作用，其作用機(jī)理與龍膽瀉肝湯的免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。龍膽瀉肝湯通過提高抗炎細(xì)胞因子 IL-10 的表達(dá)、降低炎癥因子 TNF- 和 IL-17、污- 的表達(dá)，并可顯著改善 T 細(xì)胞的功能以達(dá)到免疫調(diào)節(jié)、抑制炎癥的作用?？寡籽芯垦装Y是機(jī)體對(duì)病原體防御反應(yīng)的一種表現(xiàn)，是機(jī)體在各種有害因子作用下誘導(dǎo)的一種以防御和保護(hù)為主的綜合理過程。前期研究發(fā)現(xiàn)，清開靈眼用凝膠點(diǎn)眼可減輕大鼠葡萄膜炎炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)理主要是抑制 CD4+細(xì)胞的增生和分化，降低 CD4+ CD8+T 細(xì)胞比值，并抑制Thl、Thl7 效應(yīng)細(xì)胞的分化，減少相應(yīng)細(xì)胞因子的；研

59、究還發(fā)現(xiàn)，龍膽瀉肝湯能有效減輕 EAU 大鼠前房炎癥，減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn) IL-10 表達(dá)水平、抑制 IL-17，IFN- 表達(dá)水平、保護(hù)眼部組織結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫狀態(tài)，顯著改善眼內(nèi)免疫微環(huán)境、促進(jìn)全身免疫環(huán)境平衡?？沟蛲鲅芯?細(xì)胞凋亡是細(xì)胞受到生理或病理信號(hào)刺激后通過啟動(dòng)自身機(jī)制，主要是通過內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活而發(fā)生的細(xì)胞過程。中藥具有較好的抗細(xì)胞凋亡作用，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖能抑制藍(lán)光誘導(dǎo)損傷的hRPE 細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制細(xì)胞線粒體產(chǎn)生活性氧有關(guān)； 黃芪多糖對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的氧化損傷有保護(hù)作用，可抑制其誘發(fā)的

60、細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與黃芪多糖降低 Cascase-3 的表達(dá)水平有關(guān)。5.1.3 相關(guān)課題和研究成果衛(wèi)生行業(yè)科研專項(xiàng)：常見功能性眼病的診療、防控和康復(fù)技術(shù)體系研究（201302015）；國(guó)家自然科學(xué)基金：眼炎康顆粒治療葡萄膜炎關(guān)鍵機(jī)制的研究（81303081）；國(guó)家自然科學(xué)基金：清開靈眼用凝膠對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎 Th1、Th17 作用的研究（81072961）；國(guó)家自然科學(xué)基金： gamma/delta T 細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)對(duì)自身免疫性葡萄膜炎的影響（81100658）；山東省自然科學(xué)基金：抗原特異性 T 細(xì)胞與眼內(nèi)實(shí)質(zhì)細(xì)胞相互作用在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎病理機(jī)制中的作用（ZR201