急性毒性試驗(yàn)

1、關(guān)于急性毒性試驗(yàn)第一張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 急性毒性試驗(yàn)(單次給藥毒性試驗(yàn))主要觀察對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一次給藥后所產(chǎn)生的毒性癥狀及其程度，出現(xiàn)和消失的時(shí)間，死亡的發(fā)生率并計(jì)算出其最大給藥量，最小致死量、半數(shù)致死量(LD50)等。由于中藥毒性常較小，單次給藥往往不能表現(xiàn)明顯的毒性作用，我國(guó)藥政部門把一日內(nèi)多次給藥觀察受試藥物毒性的實(shí)驗(yàn)也稱作急性毒性實(shí)驗(yàn)。 急性毒性試驗(yàn)的目的是推測(cè)新藥對(duì)人的急性毒性的強(qiáng)弱。同時(shí)，它可以為長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)、生殖毒性試驗(yàn)、致突變?cè)囼?yàn)等試驗(yàn)設(shè)計(jì)提供劑量選擇依據(jù)和有關(guān)毒性信息，還可以推測(cè)受試藥物毒性發(fā)生的速度和持續(xù)時(shí)間，與半數(shù)有效量(ED50)比較判斷新藥的安全系

2、數(shù)。因此，急性毒性試驗(yàn)對(duì)了解新藥的毒性是非常必要的。 鑒于種種因素造成急性毒性試驗(yàn)結(jié)果(癥狀和致死量)在不同實(shí)驗(yàn)室內(nèi)有較大的差異，且耗費(fèi)大量動(dòng)物而所取得的動(dòng)物毒性的信息量相對(duì)較少，因此，各國(guó)目前都在修訂急性毒性試驗(yàn)的技術(shù)要求，希望能利用盡可能少的動(dòng)物數(shù)量而取得有價(jià)值的信息，同樣達(dá)到急性毒性試驗(yàn)的目的。第二張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 第一節(jié) 急性毒性試驗(yàn)方法的有關(guān)問(wèn)題 一、動(dòng)物 (一)動(dòng)物種 動(dòng)物種(或系)的差異是動(dòng)物急性毒性差異的主要原因，藥酶則是毒性種差的重要原因之一。為推測(cè)新藥對(duì)人的急性毒性，某些發(fā)達(dá)國(guó)家動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)要求包含非嚙齒類動(dòng)物(除家兔外)在內(nèi)的兩種動(dòng)物，我國(guó)對(duì)

3、此未作出明確規(guī)定。由于中藥已在臨床長(zhǎng)期使用，一般認(rèn)為，如尤特殊情況，使用一種動(dòng)物已基本上達(dá)到急性毒性試驗(yàn)的目的。目前雖常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是小鼠或大鼠。但在某些特殊情況下，例如受試物中已知含有強(qiáng)烈胃腸刺激物，就還應(yīng)再采用非嚙齒類大動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，否則，即使毒性較大(如巴豆)也并不能引起大、小鼠嘔吐反應(yīng)。第三張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 (二)動(dòng)物的年齡、性別、體重 急性毒性受動(dòng)物的健康狀態(tài)、年齡、性別、遺傳因素、體重、藥物的吸收、分布、代謝、排泄和內(nèi)分泌激素等的影響。未成年的動(dòng)物藥酶活性一般較低，對(duì)于經(jīng)代謝后減毒的藥物表現(xiàn)毒性較強(qiáng)。而且，年幼動(dòng)物藥物代謝功能和敏感度較易發(fā)生變化，性別間的

4、特性也尚未確立，因此，口服毒性通常使用年輕的性成熟的動(dòng)物，般小鼠68周齡，兩種性別，體重18-22g(同次試驗(yàn)體重相差不超過(guò)2g)，大鼠68周齡，兩種性別，體重120150g(同次試驗(yàn)體重相差不超過(guò)10g)。 (三)動(dòng)物數(shù)量 視不同試驗(yàn)而異。最小致死量或半數(shù)致死量，小動(dòng)物(大鼠、小鼠)試驗(yàn)組在三組以上，每組般至少10只動(dòng)物(雌雄各半)。一些國(guó)家對(duì)動(dòng)物數(shù)和組數(shù)不作規(guī)定，因此，有只用3只一組經(jīng)多組試驗(yàn)測(cè)得近似致死量或LD50者。大動(dòng)物(犬、猴)并不定要求得到LD50，可用少量動(dòng)物采用劑量遞增的方法觀察中毒癥狀，求近似致死量即可。最大給約量試驗(yàn)般要求用小鼠或大鼠20只即可。第四張，PPT共五十二頁(yè)，

5、創(chuàng)作于2022年6月二、試驗(yàn)準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)應(yīng)在符合GLP的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)樣品質(zhì)量和穩(wěn)定性應(yīng)符合要求，與藥效學(xué)及臨床試驗(yàn)一致。 (一)樣品液的配制 中藥材町用濃縮煎劑或浸膏，中藥制劑可用不含輔料的提取物加水或用o5羧基纖維素鈉，05吐溫80，5阿拉伯膠等混懸劑、增溶劑配成混懸液等，盡可能配成水溶液，水不溶性成分可用植物汕配成油溶、乳濁液。也有用乙醇、聚乙醇等溶劑配成樣品液者，但溶劑本身的急性毒性能干擾試驗(yàn)結(jié)果，因此，急性毒性試驗(yàn)報(bào)告中應(yīng)對(duì)樣品液的配制方法加以詳細(xì)說(shuō)明，必要時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組。 (二)樣品液的濃度及給藥容量 為了求得最低致死且或半數(shù)致死量，需要設(shè)不同劑量組，使部分組反應(yīng)率在50以上，部

6、分組反應(yīng)率在50以下。不同劑量的設(shè)定有兩種方式，是濃度一定不同給藥容量，另種是容量一定不同給藥濃度，兩者各有所長(zhǎng)。 濃度一定適用于某些已經(jīng)固定濃度的制劑，其有利之處是避免了滲透、粘度、溶質(zhì)顆粒的分散狀態(tài)等理化性狀不致對(duì)毒性試驗(yàn)結(jié)果的影響，因此，濃度一定也可得到較好的結(jié)果，但由于動(dòng)物的投藥用量是有限的，范圍較窄，按體重給藥容量難以達(dá)到試驗(yàn)要求。因此，通常采用同容量不同濃度的給藥方法，注射給藥藥液濃度應(yīng)勺體液濃度等滲(至少不應(yīng)低滲)，口服液不必作特殊考慮，對(duì)毒性低的中藥制劑而言，應(yīng)以能保持一定流動(dòng)性的最大濃度作為口服樣品液。第五張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、給藥方法 (一)動(dòng)物禁食

7、 動(dòng)物購(gòu)入后應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室觀察1星期，口服給藥前，為減少吸收差異和大容量給藥造成胃急性擴(kuò)張，小鼠和大鼠至少應(yīng)停食4 -6h，要求一夜停食(不停水)，投藥后再停食3-4h。 (二)給藥途徑 中藥新藥除臨床給藥途徑外，、二類新藥還希望其他給藥途徑，水溶性藥 物應(yīng)同時(shí)采用靜脈給藥途徑，其他如油劑，混懸劑之類可采用皮下給藥途徑。腹腔汁射在人體極少用，中藥粗制劑成分復(fù)雜，動(dòng)物毒性試驗(yàn)中也盡可能少用，以避免腹腔刺激性的干擾。 各給藥途徑的容量一般為小鼠0405ml20g(體重)，大鼠lmll00g(體重)。小鼠口服最大容量不超過(guò)08ml20g(體重)，其他途徑不超過(guò)05ml20g(體重)。大鼠口服最大容量不超

8、過(guò)2mll00g(體重)，其他途徑不超過(guò)lmll00g(體重)。第六張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四、急毒試驗(yàn)觀察指標(biāo)和致死量的計(jì)算 (一)觀察指標(biāo) 不能把求得致死劑量看作是急性毒性實(shí)驗(yàn)的唯一要求。發(fā)現(xiàn)毒性癥狀及毒性反應(yīng)的靶器官同樣是急毒實(shí)驗(yàn)非常重要的目的。給藥前后應(yīng)觀察體重、進(jìn)食、進(jìn)水的狀況，密切觀察異常毒性癥狀，特別是給藥后的一、二日。以后1日至少觀察1次，觀察7 日觀察癥狀包括行動(dòng)：不安定、多動(dòng)、發(fā)聲；神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)：舉尾、振顫、痙攣、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、姿態(tài)異常；自主神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)：眼球突出、流涎、流汨、排尿、下瀉、豎毛、皮膚變色、呼吸；死亡。應(yīng)每日記錄體重、毒性反應(yīng)和死亡情況，瀕死動(dòng)物

9、應(yīng)單獨(dú)飼養(yǎng)，死后及時(shí)解削進(jìn)行肉眼觀察和病理組織學(xué)觀察。試驗(yàn)結(jié)束存活動(dòng)物也進(jìn)行解剖，如有病變進(jìn)行組織學(xué)觀察。(二致死劑量計(jì)算 可用Bliss點(diǎn)斜法、簡(jiǎn)化機(jī)率法、改進(jìn)寇氏序貫法等計(jì)算最小致死量或半數(shù)致死量。Bliss法嚴(yán)謹(jǐn)精確，缺點(diǎn)是計(jì)算非常繁復(fù)。但近代有計(jì)算機(jī)軟件，汁算方法可推薦Bliss法。各種方法原則基本相同，如：劑量劉數(shù)值應(yīng)為等差，即劑量應(yīng)按等比級(jí)數(shù)排列；各組動(dòng)物數(shù)應(yīng)相等；死亡率應(yīng)在50上下基本對(duì)稱分布等。但各種方法還各有特殊設(shè)計(jì)要求，如有的要求Dm和Dn必須為100和0死亡率等，可參考有關(guān)專著，此處不贅述。如受試物毒性低，測(cè)不出LD50，可求得最大給藥量。第七張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于

10、2022年6月 第二節(jié) 急性毒性試驗(yàn)方法 一、LD50的測(cè)定 最小致死量是使動(dòng)物剛好致死的藥物劑量，但由于藥物的性質(zhì)，給藥方法和個(gè)體差異，每只動(dòng)物的最小致死量確很大的差異，實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)訓(xùn)學(xué)原理表明一群動(dòng)物最小致死量的平均值相當(dāng)于半數(shù)致死量。半數(shù)致死量測(cè)定方法很多，但實(shí)驗(yàn)沒(méi)計(jì)大同小異，所不同者為算方法的不同，其試驗(yàn)方法如下： 預(yù)試驗(yàn)：目的是找出0及100估計(jì)致死量。更確田地說(shuō)是找到個(gè)0死亡的最大劑量和100死亡的最小劑量的估值以決定實(shí)驗(yàn)中采用的最大劑量(Dm)和最小劑量(Dn)，這在測(cè)定中非常重要，是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。可用雌或雄性動(dòng)物，設(shè)四組以上，每組3-4只，先用1；10的劑量比給藥(如5mgkg、

11、50mgkg、500mgkg、5000mgkg固定劑量)。觀察7日，記錄死亡動(dòng)物數(shù)。然后在死亡數(shù)44和04兩組之間按1；2(如50mg/kg、100mg/kg、200mgkg、400mgkg)以下的劑量比進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，以此測(cè)得近似的0和100死亡率。第八張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月正式試驗(yàn)：在預(yù)試驗(yàn)Dn和Dm劑量范圍內(nèi)按等比設(shè)三個(gè)以上劑量組，其組間劑量的比值，一般在1；06至1：09范圍內(nèi)。購(gòu)入動(dòng)物試驗(yàn)前應(yīng)馴化1星期，隨機(jī)或按體重分組，每組10只以上，雌雄各半，分別編號(hào)，給藥前應(yīng)禁食(不禁水)過(guò)夜。各給藥組和溶劑對(duì)照組按體重給藥后，試驗(yàn)當(dāng)日應(yīng)多次觀察，第二日至最后日應(yīng)每日有二人以

12、上同時(shí)觀察1次并及時(shí)詳細(xì)汜錄毒性反應(yīng)癥狀，癥狀出現(xiàn)和消失的時(shí)間，死亡時(shí)間，第七日全部動(dòng)物測(cè)量體重處死并剖檢，肉眼觀察病變情況。有毒性反應(yīng)、體重減輕或臟器有病變的動(dòng)物應(yīng)在剖檢后立即進(jìn)行主要臟器的病理組織學(xué)觀察。 LD50和最小致死量及其可信限的汁算可采用Bliss法，改進(jìn)寇氏法、點(diǎn)斜法、簡(jiǎn)化概率單位法或其他的計(jì)算方法。汁算結(jié)果對(duì)比表明，不同的汁算方法，結(jié)果間一般無(wú)明顯差異，而不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)同一樣品試驗(yàn)結(jié)果卻常見(jiàn)有顯著差異。岡此，采用較簡(jiǎn)單的計(jì)算方法完全可以滿足LD50計(jì)算的準(zhǔn)確性。第九張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、最大給藥量試驗(yàn) 如同受試藥物的濃度或體積限制，無(wú)法測(cè)出半數(shù)致死量(L

13、D50)時(shí)，作最大給藥量試驗(yàn)。試驗(yàn)選用擬推薦臨床試驗(yàn)的給藥途徑，以動(dòng)物能耐受的最大濃度(溶液仍有較好的流動(dòng)性)，最大體積的給藥量1次或1日內(nèi)23次給予動(dòng)物。以小鼠口服為例：動(dòng)物數(shù)不得少于20只，雌雄各半，容量次不超過(guò)04ml/10g(體重)，多次給藥間隔時(shí)間不低于4h，觀察7日，汜錄毒性反應(yīng)和體重變化。如仍未見(jiàn)毒性反應(yīng)或體重正常增加，則可認(rèn)為該藥物小鼠最大給藥量未見(jiàn)毒性反應(yīng)，或LD50大于最大給藥量。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，該劑量不可能大于LD14。如用10只動(dòng)物未見(jiàn)毒性反應(yīng)或死亡則該劑量不可能大于LD26。 第十張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、近似致死量試驗(yàn) 國(guó)外近年來(lái)有采用少量動(dòng)物進(jìn)行

14、近似致死量測(cè)定的方法。其中有的類似LD50的預(yù)試驗(yàn)或霍恩氏法。每組用34只動(dòng)物，設(shè)多組，詳細(xì)觀察并汜錄動(dòng)物毒性反應(yīng)井進(jìn)行血液學(xué)，血液生化以及病理組織學(xué)觀察。有的采用劑量遞增法即只動(dòng)物一個(gè)劑量以幾何級(jí)數(shù)遞增，根據(jù)前個(gè)劑量的反應(yīng)，決定下個(gè)劑量。或采用劑量累積法，同一批動(dòng)物間隔一定時(shí)間、劑量由小到大給藥，觀察毒性反應(yīng)，同時(shí)結(jié)合血藥濃度的測(cè)定，確定動(dòng)物的急性毒性反應(yīng)、靶器官、中毒或致死劑量、毒性反應(yīng)時(shí)的血藥濃度。劑量遞增法類似于LD50測(cè)定的階梯法(或稱序貫法、上下法)，適用小動(dòng)物而且毒性反應(yīng)出現(xiàn)快的試驗(yàn)，1020只動(dòng)物即可測(cè)定。劑量累積法則適用大動(dòng)物，利用大約6只合格動(dòng)物即可進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)的全面觀

15、察。另外，國(guó)外還有采用固定劑量給藥觀察近似致死劑量，以決定藥物毒性大小者。第十一張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 四、急毒試驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià) (一)可靠性評(píng)價(jià) 為保證急毒結(jié)果，實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)符合GLP的要求，供試品質(zhì)量穩(wěn)定，動(dòng)物合格，實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)原始記錄，標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，總結(jié)報(bào)告應(yīng)符合要求。總結(jié)報(bào)告中應(yīng)包括摘要、供試品、試驗(yàn)動(dòng)物，試驗(yàn)環(huán)境、給藥方法、觀察方法、毒性反應(yīng)癥狀、體重變化、病理組織學(xué)變化、雄性反應(yīng)和死亡出現(xiàn)的時(shí)間、LD50和LD5及其可信限的計(jì)算方法、結(jié)果討論等。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果對(duì)急性毒性進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。 第十二張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 (二)安全性評(píng)價(jià) (1)根據(jù)急性毒

16、性試驗(yàn)結(jié)果判斷供試藥物毒性的強(qiáng)弱、類型。國(guó)內(nèi)尚無(wú)統(tǒng)規(guī)定。 (2)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果對(duì)臨床研究有指導(dǎo)意義，可以為臨床研究時(shí)探索安全有效劑量避免出現(xiàn)急性不良反應(yīng)提供依據(jù)。 但是，鑒于人體與各種動(dòng)物對(duì)各類化合物的吸收、分布、代謝、排泄以及各類型毒性反應(yīng)的差異，尚無(wú)規(guī)律可循，現(xiàn)有化學(xué)藥品統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，在進(jìn)行臨床研究時(shí)，仍應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果參考文獻(xiàn)資料報(bào)道進(jìn)行由低到高的安全治療劑量的探索。 (3)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果對(duì)推測(cè)長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)劑量具重要意義，、不同種動(dòng)物之間的差異，急性毒性結(jié)果無(wú)論用體重劑量還是體表面積劑量計(jì)算常見(jiàn)有差異而尚無(wú)規(guī)律。如果急性毒性試驗(yàn)與長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)采用同種動(dòng)物，則急性毒性試驗(yàn)的劑量對(duì)長(zhǎng)毒有更

17、大的參考價(jià)伉。即使如此，還應(yīng)考慮該藥的蓄積作用。不同種動(dòng)物間雖然也可以進(jìn)行劑量推測(cè)但僅可作為參考仍需要長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)前進(jìn)行必要的預(yù)試驗(yàn)。第十三張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、動(dòng)物規(guī)格和數(shù)量 長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)一般由雌雄各半、健康無(wú)病、檢疫合格的動(dòng)物組成。各組平均體重相似，體重變異不超過(guò)20。對(duì)照組動(dòng)物數(shù)，可以與給藥組相同，也可按公式計(jì)算：對(duì)照組動(dòng)物數(shù)：給藥組動(dòng)物數(shù)x劑量組數(shù)的平方根。 試驗(yàn)周期3個(gè)月之內(nèi)的，嚙齒類宜用68周齡的大鼠，每組數(shù)量不少于20只；非嚙齒類可用610月齡的犬，每組數(shù)量6只；試驗(yàn)周期3個(gè)月以上的，嚙齒類宜用5、6周齡的大鼠，每組數(shù)量應(yīng)增至30-40只。非嚙齒類可用4-

18、6月齡的犬，每組數(shù)量6只。確定每組動(dòng)物數(shù)的原則，主要考慮藥物毒性致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡數(shù)，實(shí)驗(yàn)中處死動(dòng)物的批次和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)及停藥后觀察恢復(fù)狀況所需能用于統(tǒng)計(jì)分析的動(dòng)物數(shù)。第十四張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四、飼養(yǎng)條件 (1)通風(fēng)良好：動(dòng)物飼養(yǎng)室的換氣次數(shù)和氣流速度能控制在1015次h和1318cms較好，目的是利于動(dòng)物的散熱及排除臭氣、粉塵和微生物，又不明顯影響室內(nèi)的溫、濕度和動(dòng)物的耗能。 (2)光照規(guī)律：因生物節(jié)律對(duì)動(dòng)物的反應(yīng)性有明顯的影響，光照會(huì)影響動(dòng)物的生物節(jié)律從而影響不同批次之間的毒性對(duì)比。大鼠、小鼠應(yīng)為12h明，12h暗；倉(cāng)鼠應(yīng)是14h明，l0h暗。 (3)環(huán)境清潔：微生物或寄

19、生蟲感染等，均叫能影響毒性試驗(yàn)的結(jié)果。有條件者應(yīng)盡可能選用清潔級(jí)、SPF級(jí)試驗(yàn)設(shè)施。 (4)溫、濕度適中且穩(wěn)定：常溫動(dòng)物在1533C下，體溫波動(dòng)在1. 5C以內(nèi)。濕度是種潛熱，宜控制在3070。溫度、濕度的突然變化，體溫雖然變化不大，但并不意味著動(dòng)物的生理狀況未受影響，同樣可以導(dǎo)致動(dòng)物對(duì)外環(huán)境變化的抵抗力降低，影響毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 (5)室內(nèi)噪聲最好在50dB以下：雌雄分養(yǎng)，不宜擁擠，必要時(shí)(如摻飼給藥或需精確測(cè)定飲食量時(shí))單籠飼養(yǎng)，但要注意單養(yǎng)和群養(yǎng)的動(dòng)物劉藥物的反應(yīng)是有差異的。各劑量組和對(duì)照組的飼養(yǎng)條件應(yīng)等同。室內(nèi)飼養(yǎng)另種動(dòng)物，或其他飼養(yǎng)條件的突然改變，均可引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)，從而影響毒性

20、實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 (6)食物應(yīng)清潔，無(wú)霉變：食物中的脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)成分要符合各種動(dòng)物的生理需求目恒定，因有時(shí)營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)藥物的毒性也有很大的影響。飲水要潔凈，防止病源微生物、重金屬或其他有毒物質(zhì)的污染。第十五張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)第十六張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 本書的長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)與國(guó)際現(xiàn)行的反復(fù)給藥的毒性實(shí)驗(yàn)概念是基本一致的，包含了過(guò)去“亞急性毒性實(shí)驗(yàn)”、“亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)”、“慢性毒性實(shí)驗(yàn)”及“終身毒性實(shí)驗(yàn)”等稱謂。 長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)的主要目的有：是觀察藥物在選定時(shí)間內(nèi)反復(fù)給予動(dòng)物的情況下，動(dòng)物出現(xiàn)損害的靶組織或器官及劑量效應(yīng)關(guān)系和可逆性等

21、；二是了解實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)藥物能耐受的劑量范圍和對(duì)人來(lái)說(shuō)可能無(wú)毒的安全劑量。 組成長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)的三個(gè)主要部分是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、受試藥物和觀察指標(biāo)。長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)贊時(shí)、費(fèi)力，故必須根據(jù)新藥類別、受試物性質(zhì)和用途、療程長(zhǎng)短、急性毒性試驗(yàn)和長(zhǎng)期毒性預(yù)試驗(yàn)結(jié)果等周密考慮，精心設(shè)計(jì)，以避免難以彌補(bǔ)的缺失。長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)一般需要重點(diǎn)考慮以下幾個(gè)方面。第十七張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 一、動(dòng)物種類 (1)我國(guó)對(duì)中藥三、四類新藥，處方中各味藥材均符合法定標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)毒性藥材，無(wú)十八反、十九畏等配伍禁忌，又未經(jīng)化學(xué)處理(水、乙醇粗提者除外)，難以測(cè)出LD50，而給藥量大于20g(生藥)kg(體

22、重)，臨床用藥期為1星期以內(nèi)者可免做長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)。 (2)符合上述條件，用藥1星期以上者及需反復(fù)應(yīng)用的藥物，規(guī)定可只選用大鼠進(jìn)行長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)。 (3)對(duì)一、二類新藥以及含有毒藥材、非法定標(biāo)準(zhǔn)藥材，或有十八反、十九畏等配伍禁忌的三、四類中藥新藥，我國(guó)及各國(guó)藥政部門普遍規(guī)定，長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)應(yīng)用嚙齒類和非嚙齒類二種動(dòng)物進(jìn)行。嚙齒類中，大鼠公認(rèn)為首選動(dòng)物，其次是小鼠、地鼠或豚鼠等；非嚙齒類中，常用的是犬，也可根據(jù)需要選用猴、貓、兔或小型豬等。第十八張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、動(dòng)物品系 實(shí)驗(yàn)應(yīng)選用封閉群動(dòng)物，如嚙齒類的Wistar或Sprague Dewley品系大鼠，非嚙齒類的Beag

23、le犬。既易得、易養(yǎng)、易于操作，又接近實(shí)際用藥人群的基因組成情況。除非有特殊目的，一般不用近親繁殖的動(dòng)物。也有認(rèn)為雜交第一代鼠兼有對(duì)藥物反應(yīng)波動(dòng)少和接近人群基因組成情況的優(yōu)點(diǎn)而提倡選用的，尚未被普遍接受。由于不同國(guó)家、不同實(shí)驗(yàn)室的動(dòng)物經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期傳代，其品系基因已發(fā)生了很大的變化，因此長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須來(lái)源清楚，并有繁殖生產(chǎn)合格證號(hào)。第十九張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、動(dòng)物規(guī)格和數(shù)量 長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)一般由雌雄各半、健康無(wú)病、檢疫合格的動(dòng)物組成。各組平均體重相似，體重變異不超過(guò)20。對(duì)照組動(dòng)物數(shù)，可以與給藥組相同，也可按公式計(jì)算：對(duì)照組動(dòng)物數(shù)：給藥組動(dòng)物數(shù)x劑量組數(shù)的平方根。 試驗(yàn)周

24、期3個(gè)月之內(nèi)的，嚙齒類宜用68周齡的大鼠，每組數(shù)量不少于20只；非嚙齒類可用610月齡的犬，每組數(shù)量6只；試驗(yàn)周期3個(gè)月以上的，嚙齒類宜用5、6周齡的大鼠，每組數(shù)量應(yīng)增至30-40只。非嚙齒類可用4-6月齡的犬，每組數(shù)量6只。確定每組動(dòng)物數(shù)的原則，主要考慮藥物毒性致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡數(shù)，實(shí)驗(yàn)中處死動(dòng)物的批次和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)及停藥后觀察恢復(fù)狀況所需能用于統(tǒng)計(jì)分析的動(dòng)物數(shù)。第二十張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 四、飼養(yǎng)條件 (1)通風(fēng)良好：動(dòng)物飼養(yǎng)室的換氣次數(shù)和氣流速度能控制在1015次h和1318cms較好，目的是利于動(dòng)物的散熱及排除臭氣、粉塵和微生物，又不明顯影響室內(nèi)的溫、濕度和動(dòng)物的耗能。

25、 (2)光照規(guī)律：因生物節(jié)律對(duì)動(dòng)物的反應(yīng)性有明顯的影響，光照會(huì)影響動(dòng)物的生物節(jié)律從而影響不同批次之間的毒性對(duì)比。大鼠、小鼠應(yīng)為12h明，12h暗；倉(cāng)鼠應(yīng)是14h明，l0h暗。 (3)環(huán)境清潔：微生物或寄生蟲感染等，均叫能影響毒性試驗(yàn)的結(jié)果。有條件者應(yīng)盡可能選用清潔級(jí)、SPF級(jí)試驗(yàn)設(shè)施。 (4)溫、濕度適中且穩(wěn)定：常溫動(dòng)物在1533C下，體溫波動(dòng)在1. 5C以內(nèi)。濕度是種潛熱，宜控制在3070。溫度、濕度的突然變化，體溫雖然變化不大，但并不意味著動(dòng)物的生理狀況未受影響，同樣可以導(dǎo)致動(dòng)物對(duì)外環(huán)境變化的抵抗力降低，影響毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 (5)室內(nèi)噪聲最好在50dB以下：雌雄分養(yǎng)，不宜擁擠，必要時(shí)(如摻

26、飼給藥或需精確測(cè)定飲食量時(shí))單籠飼養(yǎng)，但要注意單養(yǎng)和群養(yǎng)的動(dòng)物劉藥物的反應(yīng)是有差異的。各劑量組和對(duì)照組的飼養(yǎng)條件應(yīng)等同。室內(nèi)飼養(yǎng)另種動(dòng)物，或其他飼養(yǎng)條件的突然改變，均可引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)，從而影響毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 (6)食物應(yīng)清潔，無(wú)霉變：食物中的脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)成分要符合各種動(dòng)物的生理需求目恒定，因有時(shí)營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)藥物的毒性也有很大的影響。飲水要潔凈，防止病源微生物、重金屬或其他有毒物質(zhì)的污染。第二十一張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 第二節(jié) 受試藥物 一、藥物形式 應(yīng)與臨床試驗(yàn)用制劑完全致(除可以不含賦形劑外)。三類以下的中藥新藥復(fù)方制劑，體積較大，以不含賦形劑如中藥

27、浸膏作受試物為宜。固體制劑灌胃給藥，不溶于水的可制成餛懸液。混懸液要均勻，固體物先磨成80目以上的細(xì)粉，再加1左右的羧甲基纖維素鈉或10左右阿拉伯膠助懸，冰箱放置，臨用前搖勻，短期內(nèi)用完，以免受試物活性下降。第二十二張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、給藥途徑和方法 給藥途徑應(yīng)盡量與臨床一致?？诜幬锟晒辔富驌斤暯o藥。灌胃給藥有血藥高峰期：摻飼給藥血藥濃度波動(dòng)較小，維持時(shí)間較長(zhǎng)。靜脈注射或肌內(nèi)注射給藥可以肌內(nèi)注射或皮下注射。腹腔注射時(shí)大部分藥物依然是首先入肝，因此不能完全代替臨床注射給藥途徑。 皮下注射，大鼠每l00g體重不超過(guò)1ml，小鼠為0103mll0g(體重)。肌內(nèi)注射，大鼠

28、每腿不超過(guò)05ml，小鼠每腿不超過(guò)03ml。注射給藥應(yīng)嚴(yán)格消毒，并需經(jīng)常變換注射點(diǎn)以減少對(duì)局部的刺激，還應(yīng)考慮藥液的酸堿度和滲透壓。 灌胃容積，大鼠一般每100g體重12ml，小鼠為01-0. 3mll0g(體重)。犬等大動(dòng)物常采用口服或摻飼給藥。從營(yíng)養(yǎng)考慮摻飼藥量不宜超過(guò)攝食量的5。摻飼給藥(摻入飼料或飲水中給藥)應(yīng)有保證攝入規(guī)定藥量的措施，還應(yīng)有均勻混合、穩(wěn)定性及質(zhì)量檢杳等措施。對(duì)中藥復(fù)方制劑很難做到這點(diǎn)，必須摻飼，給藥時(shí)，采用現(xiàn)喂現(xiàn)摻的方法較好。 長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)的給藥量應(yīng)根據(jù)動(dòng)物體重的變化不斷調(diào)整，一般每期稱量體重并調(diào)整藥量1次。各劑量組應(yīng)采用等容量不同濃度給藥。第二十三張，PPT共五十二

29、頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 三、給藥分組 (1)應(yīng)設(shè)3個(gè)或9個(gè)以上的劑量組。高劑量組應(yīng)有少數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)嚴(yán)重毒性反應(yīng)或死亡(不超過(guò)20)，低劑量組應(yīng)相當(dāng)或略高于藥效學(xué)試驗(yàn)的有效劑而不出現(xiàn)毒性反應(yīng)，中劑量組在高低劑量組之可以等比關(guān)系排列。中藥般毒性較低，體積較大。在即使最大限度提高劑量(技術(shù)上能投給的最高劑量)仍不能使動(dòng)物中毒死亡的情況下，高劑量組應(yīng)相當(dāng)于臨床用量50倍以上，雖低不能低于臨床劑量的30倍(按千克體重計(jì)算)，且必須高于藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)的高劑量組。 (2)如采用臨床試驗(yàn)用制劑，對(duì)照組應(yīng)給等容量的賦形劑，應(yīng)注意有時(shí)賦形劑或溶劑的種類和用量會(huì)影響藥物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如采用不含賦形劑制劑，對(duì)照組可給等容量

30、的水等溶劑。如賦形劑或溶劑可能產(chǎn)生毒性時(shí)，還需另設(shè)空白對(duì)照組。第二十四張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四、給藥周期 不應(yīng)少于臨床療程的1倍。新藥審批辦法中藥藥理毒理研究的技術(shù)要求中規(guī)定：中藥三、四類新藥，處方中各味藥材均符合法定標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)毒性藥材，無(wú)十八反、十九畏等配伍禁忌，又未經(jīng)化學(xué)處理(水、乙醇粗提除外)，難以測(cè)出LD50而給藥量大于20g生藥kg(體重)，臨床用藥期為1早期以內(nèi)者町免做長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)。1星期以上者及需反復(fù)應(yīng)用的藥物，可選用大鼠進(jìn)行長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)。對(duì)一、二類新藥以及含有毒藥材、非法定標(biāo)準(zhǔn)藥材或有十八反、十九畏等配伍禁忌的三、四類中藥新藥，長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)應(yīng)用嚙齒類和非嚙齒類

31、兩種動(dòng)物進(jìn)行。給藥周期：嚙齒類一般不超過(guò)6個(gè)月，非嚙齒類不超過(guò)9個(gè)月。第二十五張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 第三節(jié) 觀察指標(biāo) 一、檢測(cè)次數(shù) 試驗(yàn)周期在3個(gè)月以內(nèi)的，末次給藥后24h，每組活殺部分動(dòng)物(1223)，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，余下動(dòng)物停藥繼續(xù)觀察24星期之后，同樣活殺全面檢測(cè)，以了解可能出現(xiàn)的遲緩性毒忭和毒性反應(yīng)的可逆程度。試驗(yàn)周期在3個(gè)月以上的，可增加在實(shí)驗(yàn)中期活殺少量動(dòng)物(如高劑量組和對(duì)照組)檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。第二十六張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、檢查項(xiàng)目 (一)一般檢查 (1)長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)的癥狀發(fā)生得快慢不。因此，在給藥開(kāi)始l星期內(nèi)須嚴(yán)密觀察，以后每日至少觀察一

32、次行為活動(dòng)、外觀體征、糞便性狀等。非嚙齒類動(dòng)物還可以觀察劉刺激的反應(yīng)等更高一層的行為變化。 (2)體重，反映動(dòng)物的生長(zhǎng)和一般健康狀況，也是反映毒性的敏感指標(biāo)，同時(shí)給約量的調(diào)也需根據(jù)體重的變化，因此至少每星期稱量記錄1次。 (3)攝食量的測(cè)定應(yīng)與體重變化同時(shí)測(cè)定。攝食量(g)體重增加(g)是說(shuō)明體重變化原因的重要指標(biāo)。 (4)攝水量的測(cè)定有時(shí)是必要的。對(duì)可能影響飲水量、尿量的受試藥物，或摻入飲水紿藥時(shí)，應(yīng)測(cè)定攝水量。 (5)死亡，是中毒最明顯的表現(xiàn)，但須注意與自然死亡或意外死亡的區(qū)別應(yīng)及時(shí)進(jìn)行剖檢和記錄。對(duì)瀕死動(dòng)物應(yīng)立即處死，剖檢和進(jìn)行血液學(xué)、血液生化及病理組織學(xué)檢查。第二十七張，PPT共五十二

33、頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 (二)實(shí)驗(yàn)室檢查 1血液學(xué) 血常規(guī)(纖細(xì)胞和網(wǎng)織纖細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞分類、血小板計(jì)數(shù))、出凝血時(shí)間等。反應(yīng)骨髓造血功能，外周各類血細(xì)胞的受損或活動(dòng)情況，凝血機(jī)制的影響程度等。 2尿液 尿量、尿常規(guī)(尿蛋白、尿糖、尿血紅蛋白等)檢查，反應(yīng)腎臟功能、心臟和內(nèi)分泌功能。 3 血液生化 血液生化檢測(cè)反應(yīng)動(dòng)物體內(nèi)各系統(tǒng)、各組織器官的功能狀態(tài)或受損情況。若能預(yù)測(cè)毒性作用的靶器官，可以有目的地選擇指標(biāo)，否則原則上應(yīng)盡可能多地進(jìn)行檢測(cè)。嚙齒類受到血液量的限制，非吶齒類雖不受采血量限制，但實(shí)際上不可能無(wú)限制地選擇檢測(cè)項(xiàng)目，因此，般首先選擇下列指標(biāo)以初步廠解受試藥

34、物對(duì)機(jī)體的毒性概況，為較深入地研究受試藥物的毒性指明方向。 第二十八張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 (1)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶：主要反應(yīng)肝臟受損情況，其次為由心臟病變引起的肝臟淤膽或郁血。 (2)總膽紅素：反應(yīng)肝臟解毒功能和膽道排泄?fàn)顩r或溶血等。 (3)堿性磷酸酶(ALP)：增高反應(yīng)骨骼受到影響或肝臟排泄受阻或甲狀旁腺功能亢進(jìn)。 (4)尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)：增高反應(yīng)腎臟功能受損或蛋白質(zhì)分解增強(qiáng)或脫水。 (5)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶：主要心臟受損情況。 (6)總蛋白(TP)：用以求出球蛋白含量。 (7)白蛋白：常見(jiàn)其濃度降低，反應(yīng)肝臟合成功能或胃腸消化吸收受影響后的攝入不足或腎

35、臟受損丟失過(guò)多。其濃度增高見(jiàn)于脫水及血液濃縮。 (8)球蛋白：常見(jiàn)是其濃度增高，反應(yīng)受到感染或機(jī)體免疫功能亢進(jìn)。其濃度降低較少見(jiàn)，原因可能是丟失增多或體液免疫受損。 (9)血糖(GLU)：增高或降低均上要與內(nèi)分泌系統(tǒng)改變有關(guān)。 (10)總膽固醇(TCHO)：增高見(jiàn)于代謝減退，脂類動(dòng)員增加等。第二十九張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(三)病理組織學(xué)檢查 病理組織學(xué)檢查目的足了解受試藥物毒性引起的質(zhì)性改變，是診斷毒性反應(yīng)的重要指標(biāo)。對(duì)給藥期間死亡動(dòng)物、瀕臨死亡和計(jì)劃活殺動(dòng)物都應(yīng)進(jìn)行病理組織學(xué)檢杳。正確肉眼觀察記錄的同時(shí)要保留相應(yīng)的影像、照片等資料。常用方法和注意事項(xiàng)如下。 (1)處死動(dòng)物

36、時(shí)，要考慮到組織器官免受損傷，也要考慮到動(dòng)物免受痛苦和應(yīng)激反應(yīng)。常用的麻醉后頸動(dòng)脈或腹主動(dòng)脈放血的方法比較合理。 (2)進(jìn)行剖檢時(shí)，應(yīng)觀察皮膚、口鼻、眼耳等外觀，再剝離皮膚觀察皮下組織，最后剪開(kāi)腹腔、胸腔及顱腔觀察內(nèi)腔組織器官及注射部位，包括組織器官的正常位置、形狀大小、顏色硬度及剖切面。取出的組織應(yīng)放在頂先排定組織器官名稱扦盛有生理鹽水的容器中以防漏取及干燥。 (3)取材原則上應(yīng)盡量廣泛?？紤]到中藥的特點(diǎn)，可根據(jù)急毒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有病變的器官組織和中藥藥性可能出現(xiàn)中毒的靶器官、靶組織具體確定。應(yīng)包括心、肝、脾、肺、腎等重要的實(shí)質(zhì)性器官組織。剖取的實(shí)質(zhì)性臟器應(yīng)稱重。 (4)病理切片原則亦應(yīng)盡量廣泛。

37、在同一張片上盡量含有同一器官組織的不同層面。實(shí)際操作中可先對(duì)高劑量組動(dòng)物及尸解發(fā)現(xiàn)異常器官進(jìn)行重點(diǎn)切片檢查，在高劑量組發(fā)現(xiàn)有異常病變時(shí)再進(jìn)行詳細(xì)檢查。第三十張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月皮膚黏膜用藥的毒性試驗(yàn)第三十一張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 皮膚黏膜用藥即局部用藥，包括皮膚用藥、直腸或陰道給藥、滴眼藥、滴鼻藥、滴耳劑、吸入劑及口腔咽喉用藥等。主要考察它們的局部毒性作用和局部用藥后引起的全身毒性作用。如果是局部用藥治療全身疾患的，還應(yīng)參照全身用藥的規(guī)定做長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)。三、四類外用藥治療局部疾患且方中不含毒性藥材或有毒成分的，般可不做長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)，但需做局部刺激試驗(yàn)、

38、過(guò)敏試驗(yàn)，必要時(shí)需做光敏試驗(yàn)。有關(guān)皮膚黏膜用藥的毒性試驗(yàn)分述如下。第三十二張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 第節(jié) 皮膚黏膜用藥急性毒性試驗(yàn) 皮膚黏膜用藥急性毒性試驗(yàn)?zāi)康氖?，觀察動(dòng)物皮膚(完整皮膚和破損皮膚)或黏膜短時(shí)期(一般為單次，或中藥制劑毒性較低，24h內(nèi)數(shù)次)接觸受試物，因吸收作用而使機(jī)體產(chǎn)生毒性反應(yīng)。 一、動(dòng)物 常用動(dòng)物為成年健康的白色家兔、白色豚鼠、白色大鼠或白色小型豬，雌雄各半。嬰兒用藥用年輕的動(dòng)物，如白色家兔(15kg左右)、白色豚鼠(o. 2kg左右)。第三十三張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、試驗(yàn)方法 (一)皮膚準(zhǔn)備 動(dòng)物給藥前24h背部脊柱兩側(cè)去毛(剪

39、、剃，或適宜脫毛劑)，去毛面積約為體表面積的10(家兔約150cm2，豚鼠約40cm2，小型豬約300cm2)。去毛后24h檢杳去毛皮膚是否因去毛而受傷，受傷的皮膚不能作完好皮膚的毒性試驗(yàn)。破損皮膚的制作采用不同方法將去毛消毒皮膚劃破(消毒手術(shù)刀作井字劃破或砂紙磨擦打毛)，以滲血為度。 (二)黏膜給藥 盡量模擬臨床的用藥途徑。保證受試物與黏膜接觸4h以上。 需設(shè)賦形劑對(duì)照組。如賦形劑有毒性，應(yīng)再設(shè)空白對(duì)照組。第三十四張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 (三)受試藥 原則上盡量與臨床用制劑一致，并保證受試物與皮膚接觸良好。 1劑量設(shè)置 (1)如果受試物毒性較大預(yù)試驗(yàn)時(shí)提高劑量可使大部分動(dòng)

40、物死亡，應(yīng)按全身給藥的原則，沒(méi)置幾個(gè)劑量組(完整皮膚組和破損皮膚組備數(shù)個(gè)劑量組)。具體方法可參見(jiàn)本篇“急性毒性試驗(yàn)”。動(dòng)物宜采用大鼠或豚鼠。 (2)如果受試物毒性較小，可只一個(gè)劑量組。每組家兔或豬4只，如用豚鼠需10只。并增加其他給藥途徑的最大給藥量試驗(yàn)。第三十五張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 2給藥方法 受試物如為膏劑或液體劑型，可直接涂抹于去毛皮膚；如是固體粉末或中藥散劑，需加適量水或其他賦形劑(如羊毛脂、凡上林、橄欖油等)混合均勻，以保證受試物與皮膚接觸良好。 藥物涂抹后應(yīng)以適當(dāng)?shù)姆ü潭?，如用無(wú)刺激性紗布、膠布或有孔尼龍繃帶固定；豚鼠或大鼠可用剪去指套的乳膠手套包住整個(gè)背部和

41、腹部；如受試物是液體，應(yīng)先覆以聚乙烯薄膜，防止液體揮發(fā)。同時(shí)要注意防止試驗(yàn)動(dòng)物舔食受試物。 黏膜用藥，如直腸或陰道或滴鼻或吸入用藥時(shí)，可將動(dòng)物固定；口腔用藥時(shí)，可將藥物涂抹在下唇與齦之間(不能排除動(dòng)物舔食受試物)；或提高受試物的黏稠度；或分次數(shù)用藥，目的是要保證受試物與黏膜接觸4h以上。 有些毒性很小的外用制劑，也可用全身給藥途徑(如皮下注射等)反應(yīng)其毒性。受試物劑量應(yīng)以同面積不同濃度為宜。如采用其他方法，應(yīng)說(shuō)明理由。第三十六張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 3給藥周期 皮膚黏膜用藥的急性毒性試驗(yàn)時(shí)，受試物與皮膚或黏膜接觸不超過(guò)24h。根據(jù)中藥特點(diǎn)，可適當(dāng)提高濃度或增加24h內(nèi)用藥次

42、數(shù)。給約24h后，用溫水或無(wú)刺激溶劑除去殘留受試物。 三、觀察記錄與檢查 除去受試物后每日觀察至第七日，記錄動(dòng)物的體重、皮膚毛發(fā)、眼和黏膜的變化，中毒表現(xiàn)的觀察項(xiàng)與全身給藥的急性毒性實(shí)驗(yàn)相同。若有死亡動(dòng)物，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行尸檢，有肉眼可見(jiàn)的病變應(yīng)進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。第三十七張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 第二節(jié) 皮膚黏膜用藥長(zhǎng)期毒性試驗(yàn) 皮膚黏膜用藥急性毒性試驗(yàn)?zāi)康氖?，觀察動(dòng)物皮膚(完整皮膚和破損皮膚)或黏膜反復(fù)多次接觸受試物，因吸收作用而使機(jī)體產(chǎn)生的毒性反應(yīng)。 一、動(dòng)物 常用動(dòng)物為成年健康的白色家兔(2kg左右)、白色豚鼠(03kg左右)、白色大鼠(02kg左右)或白色小型豬(7kg左

43、右)，雌雄各半。嬰兒用藥應(yīng)用更年輕的動(dòng)物，如白色家兔(11kg左右)、白色豚鼠(02kg左右)。第三十八張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、實(shí)驗(yàn)方法 (一)皮膚準(zhǔn)備 皮膚長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)和皮膚急性毒性試驗(yàn)的皮膚準(zhǔn)備相同。 (二)受試藥物 原則上盡量與臨床用制劑致，并保證受試物與皮膚接觸良好。 1劑量設(shè)置 皮膚黏膜用藥的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)，一般設(shè)高、低兩個(gè)劑量組和一個(gè)對(duì)照組。高劑量組應(yīng)是使動(dòng)物產(chǎn)生嚴(yán)重毒性反應(yīng)或有少數(shù)動(dòng)物死亡的劑量，低劑量組應(yīng)相當(dāng)或略高于藥效學(xué)有效劑量。具體方法可參見(jiàn)本篇“長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)”。如急毒試驗(yàn)濃度超過(guò)臨床用量20倍(經(jīng)劑量轉(zhuǎn)換)而未出現(xiàn)毒性反應(yīng)或死亡，叫只設(shè)一個(gè)相當(dāng)臨床用量

44、20倍以上的劑量組和一個(gè)對(duì)照組。每組家兔6只或小型豬4只，如用豚鼠需10只。第三十九張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2 給藥方法 受試物如為膏劑或液體劑型，可直接涂抹于去毛皮膚上；固體粉末或中藥散劑，需加適量水或其他賦形劑(如羊毛脂、凡士林、橄欖油等)混合均勻，以保證受試物與皮膚接觸良好， 藥物涂抹后應(yīng)以適當(dāng)?shù)牧Ψü潭?，如用無(wú)刺激性紗布、膠布或有孔尼龍繃帶固定；豚鼠或大鼠可用剪去指套的乳膠手套包住整個(gè)背部和腹部；如受試物是液體，應(yīng)先覆以聚乙烯薄膜，防液體揮發(fā)。同時(shí)要注意防試驗(yàn)動(dòng)物舔食受試物。 黏膜用藥，如直腸或陰道或滴鼻或吸入用藥時(shí)，可將動(dòng)物固定后進(jìn)行；口腔用藥，可將藥物涂抹在下唇與

45、齒齦之間(不能排除動(dòng)物舔食受試物)；或提高受試物的黏稠度；或增加用藥次數(shù)。目的足要保證受試物與黏膜接觸4h以上。 受試物劑量應(yīng)以同面積不同濃度為宜。如采用其他方法，應(yīng)說(shuō)明理由。 毒性很小的中藥外用制劑，也可用全身給藥途徑(如皮下注射等)反應(yīng)具毒性。第四十張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 3給藥周期 皮膚黏膜用藥長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)時(shí)，給藥時(shí)間不少于臨床用藥療程的兩倍，具體用藥周期可參照全身用藥的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)。每周給七次，每日1次，每次6h黏膜用藥至少4h)。 三、觀察記錄與檢查 皮膚黏膜用藥的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)，觀察項(xiàng)包括血液學(xué)，血液生化和病理學(xué)檢查均同全身給藥的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)，只是受試物涂抹的局部

46、皮膚應(yīng)列為檢查劉象。第四十一張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 第三節(jié) 皮膚刺激試驗(yàn) 試驗(yàn)?zāi)康淖阌^察動(dòng)物皮膚接觸受試物后產(chǎn)生的刺激反應(yīng)情況。分為1次給藥的皮膚刺激實(shí)驗(yàn)和多次給藥的皮膚刺激試驗(yàn)。 一、動(dòng)物 選成年健康的白色家兔(2kg左右)，其次是白色豚鼠(03kg左右)。嬰兒用藥應(yīng)用更年輕的動(dòng)物，如白色家免15kg左右，白色豚鼠02kg左右。 二、受試物 應(yīng)盡量與臨床用制劑致。粉末或中藥散劑，需加適量水或其他賦形劑時(shí)，也應(yīng)參考臨床使用方法，合理配制。第四十二張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、試驗(yàn)方法 至少用3只家兔或5只豚鼠。給藥前24h，動(dòng)物背部去毛。分完整皮膚給藥區(qū)、破

47、損皮膚給藥區(qū)、完整皮膚對(duì)照區(qū)、破損皮膚對(duì)照區(qū)4個(gè)區(qū)，每區(qū)均為體表面積的35，各區(qū)之間留有適當(dāng)距離。破損皮膚制造方法、給藥和固定方法等同皮膚毒性試驗(yàn)。給藥區(qū)涂抹受試物 (固體)或1ml(液體)，對(duì)照區(qū)涂以等量賦形劑，二層紗布覆蓋，適當(dāng)方法固定。 一次給藥的皮膚刺激實(shí)驗(yàn)，24h后以溫水或無(wú)刺激性溶劑洗去殘留受試物和賦形劑，觀察1h，24h、48h、72h涂抹部位的紅斑和水腫等反應(yīng)。原發(fā)反應(yīng)在12日內(nèi)達(dá)到最劇，消退較快，多次給藥的皮膚刺激實(shí)驗(yàn)，每日涂抹1次，連續(xù)1星期或以上。其他同1次給藥的皮膚刺激實(shí)驗(yàn)。第四十三張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 第四節(jié) 皮膚過(guò)敏性試驗(yàn) 皮膚過(guò)敏性試驗(yàn)的目的

48、足觀察在重復(fù)接觸受試物后，受試物作為致敏原引起的變態(tài)反應(yīng)在皮膚上的表現(xiàn)。皮膚過(guò)敏性試驗(yàn)可以分成兩大類，一類是使用佐劑(或稱免疫增強(qiáng))的方法，一類是不用佐劑的方法。 一、動(dòng)物 原則上選擇敏感性高的動(dòng)物。一般用白色豚鼠，250300g(或13個(gè)月齡)，雌雄齊半。每組10只，或由是否會(huì)影響結(jié)果評(píng)價(jià)決定。 二、陽(yáng)性對(duì)照 對(duì)苯二胺，1氯2，4二硝基苯、二鉻化鉀、璜胺新霉素、磺化鎳等。第四十四張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 三、受試物 受試物如為膏劑或液體劑型，可直接涂抹于去毛皮膚；如是固體粉末或中藥散劑，需加適量水或其他賦形劑(如羊毛脂、凡士林、橄欖等)混合均勻，以保證受試物與皮膚接觸良好。

49、 確定劑量應(yīng)考慮受試物的溶解性等性質(zhì)，局部、全身的耐受性等。必要時(shí)應(yīng)能陳述所用劑量的理由。 四、試驗(yàn)方法 給受試物(致敏或激發(fā))前24h，動(dòng)物頸背部?jī)蓚?cè)脫毛，側(cè)用于致敏涂敷，另側(cè)用激發(fā)涂敷。脈鼠去毛范圍約3cm3cm(或2cmx4cm)。試驗(yàn)組動(dòng)物背部 側(cè)脫毛處涂敷受式物，陰性對(duì)照組動(dòng)物背部脫毛處涂敷賦形劑，陽(yáng)性對(duì)照組動(dòng)物背部一側(cè)脫毛處涂敷1DNCB(或其他陽(yáng)性對(duì)照藥)，均持續(xù)6h動(dòng)物分籠飼養(yǎng)。14日后，在動(dòng)物背部另一側(cè)，試驗(yàn)組涂敷受試物，陰性對(duì)照組涂敷賦形劑，陽(yáng)性對(duì)照組涂敷o1DNCB(或其他陽(yáng)性對(duì)照藥)。6h后，去掉涂敷物，即刻觀察皮膚過(guò)敏反應(yīng)情況，之后于24h、48h、72h再次觀察。以上是代表性步驟。測(cè)試皮膚過(guò)敏反應(yīng)的還有其他方法，據(jù)報(bào)道認(rèn)為福氏完全佐劑法的敏感忭略高。簡(jiǎn)述如下：第四十五張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 (一)不用佐劑的方法 l，Buehler試驗(yàn)法 包敷封閉式涂敷受試物致敏，2星期后包敷封閉式涂敷受試物激發(fā)。 2，Dmize試驗(yàn)法 皮內(nèi)注射受試物致敏，2星期后皮內(nèi)注射受試物激發(fā)。 3敞開(kāi)式敷皮試驗(yàn)法(open eplcutmeo test) 按臨床擬用方法，反復(fù)涂敷受試物致敏。2星期后涂敷受試物激發(fā)。 (二)使用佐劑的方法 1 佐刑貼敷試驗(yàn)法 頸背部脫毛區(qū)四角各皮內(nèi)注射蒸餾水和