堿性磷酸酶的分離純化及比活性與米氏常數(shù)測定

1、優(yōu)質(zhì)范文堿性磷酸酶的分離純化及比活性與米氏常數(shù)測定一、實驗原理(1).堿性磷酸酶的分離純化1.機械破碎法制備肝勻漿低濃度乙酸鈉：低滲破膜低濃度乙酸鎂：保護和穩(wěn)定AKP2.有機溶劑沉淀法分離純化AKP加入不同有機溶劑重復(fù)離心正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白質(zhì)33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP(2).比活性測定比活性的定義*單位重量的蛋白質(zhì)樣品中所含的酶活性單位。*通常用每毫克蛋白質(zhì)具有的酶活性單位來表示。*用以鑒定酶的純化程度，是酶分離提純完成的評價指標(biāo)之一。測定樣品的比活性必須測定：*每毫升樣品中的酶活性單位數(shù)。*每毫升樣品中的蛋白質(zhì)毫克數(shù)。磷酸苯二鈉法測定堿性

2、磷酸酶活性反應(yīng)原理H+HOPONan0NaoCHHQNCNHz4氨基安替出林N/HNC=0HfY=C1=*=醍衍生物-(3).米氏常數(shù)測定Km即為米氏常數(shù)，Vmax為最大反應(yīng)速度如上式表示,米氏常數(shù)是反應(yīng)速度為最大值的一半時的底物濃度,因此,米氏常數(shù)的單位為mol/L。當(dāng)反應(yīng)速度等于最大速度一半時,即V=1/2Vmax,Km=S吸光度表示不同底物濃度時的酶反應(yīng)速度。以吸光度的倒數(shù)作縱坐標(biāo)，以底物濃度的倒數(shù)作橫坐標(biāo)，按Lineweaver-Burk作圖法可求出Km值。S取倒數(shù)作圖迭二.器材721分光光度計器托盤天平三.試劑臺式離心機恒溫水浴鍋微量移液勻漿器試管1.0.5mol/L醋酸鎂溶液中,稀

3、釋至50ml.2.稱取醋酸鎂5.3625g溶于蒸餾水0.1mol/L醋酸鈉溶液稱取醋酸鈉0.0820g溶于蒸餾水中,稀釋至10ml.0.01mol/L醋酸鎂-一醋酸鈉溶液取0.5mol/L醋酸鎂溶液2ml及0.1mol/L醋酸鈉溶溶液10ml,混合均勻后加蒸餾水稀釋至100ml.丙酮（分析純）.95%乙醇（分析純）.Tris緩沖液（Ph8.8）稱取Tris6.05g,用蒸餾水溶解成50ml,為0.1mol/LTris液，取0.1mol/LTris液10ml,加0.5mol/L醋酸鎂2ml,加蒸餾水80ml,再用1%醋酸調(diào)pH至&8,然后用蒸餾水稀釋至100ml.0.01mol/L基質(zhì)液稱取磷酸

4、苯二鈉（C6H5PO4Na2.2H2o）0.3g,4-氨基安替比林0.15g,分別溶于煮沸冷卻后的蒸餾水中；兩液混合并蒸餾水稀釋至50ml，加0.2ml氯仿防腐，盛于棕色瓶中，冰箱內(nèi)保存，可用一星期；臨用時與等量0.1mol/LpH10的碳酸鹽緩沖液混合即可.&0.1mol/LpH10的碳酸鹽緩沖液稱取無水碳酸鈉0.318g及碳酸氫鈉0.168g溶于蒸餾水,稀釋至50ml.9.堿性溶液量取0.5mol/L氫氧化鈉溶液與0.5mol/L碳酸氫鈉溶液各20ml,混合后加蒸餾水至100ml.0.5%鐵氰化鉀溶液稱取鐵氰化鉀0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸餾水中，溶解后兩液混合均勻，再加蒸

5、餾水至50ml,置棕色瓶中暗處保存.0.1mol/L醋酸鎂溶液稱取醋酸鎂0.2145g溶于蒸餾水中，稀釋至10ml.酚標(biāo)準(zhǔn)液(0.1mg/ml).四.實驗步驟(1).“堿性磷酸酶分離純化”實驗操作2呂兔肝剪薛置于璇璃勻漿管中，加0.01mol/L醋酸錢弋01niol/LMV酸納溶液6汕在勻漿器上勻漿,10000rpm/l分鐘勺肝勻漿倒人刻度離心管記錄體積仇液）（約8nil）。吸出A液0ml置于另一試管中,在此試管中加4+9mlpH汀皿緩沖液（#管人待測比活性用。然后在A液中加2ml正丁醇，用玻棒充分?jǐn)嚢?5分鐘右隨后室溫放置30分鐘。單層濾紙過濾,取濾液,加等體積冷丙銅混勻t2000rpm離心5WD上晴液（棄去）沉淀|加0,5moVL酷酸鎂4ml（B液），記錄體積。取B額（）.1nil社于另|亠試背中，加4.9inipH8.8Tris緩沖液（B1沽）、待測比活性用克rn沉淀（棄去）上清就+95%冷乙璋至60%（約43ml）,iK勻,2500ipm離心5分鐘口i_上清橄（棄去）沉淀加0.5mol/L著酸錢3溶解:記錄體積（C）DCl0.1nil置于另一試管中R2.0mlpH8.8Tris緩iM（Cr1?）T待測比活性用。加冷丙酮至33%（纟勺L5ml）,2000rpm離心5分鐘存沉淀（棄去）上清液加冷丙銅至50%（約L5ml）,3500rpm離心10分仲.上清（弄去）沉淀加