細胞培養(yǎng)技術的應用及前景講述

1、細胞培養(yǎng)技術的應用及前景講述概述 細胞生物學、分子生物學以及免疫學是現(xiàn)代三大前沿生物科學，發(fā)展異常迅速。細胞培養(yǎng)是細胞生物學研究中最常用的方法之一。由于在體外培養(yǎng)中和機體內，細胞行為的基本規(guī)律是一樣的，因此許多研究可以在體外進行。更重要的是，在培養(yǎng)條件下，人們可以有目的的、有選擇地控制細胞生長的環(huán)境，因此可以研究在某些特殊條件下的細胞生物學行為。本講主要目的是介紹動物細胞培養(yǎng)技術及其應用。一 分類1.組織培養(yǎng)(Tissue Culture)指的是從體內取出組織摹擬體內生理環(huán)境,在無菌 、適當溫度和一定營養(yǎng)條件下,使之生存和生長并維持其結構和功能的方法。2.細胞培養(yǎng)(Cell Culture):

2、培養(yǎng)物是單個細胞和細胞群。3.器官培養(yǎng)（Organ Culture）：培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個器官,使之在體外生存、生長和保持一定功能的方法.組織培養(yǎng)的分類和基本概念 歷史 1885年Roux最早嘗試使組織離體培養(yǎng),材料是雞胚神經板,采用生理鹽水為培養(yǎng)液,并首次采用組織培養(yǎng)這個術語。1907年Harrison 和1912年Carrel開始把組織培養(yǎng)作為一種方法,用于研究離體動物細胞的培養(yǎng)。體外培養(yǎng)技術的發(fā)展大致可分三個時期：50年代之前是細胞培養(yǎng)在多個領域發(fā)展期；50年代是細胞培養(yǎng)迅猛發(fā)展期，多種培養(yǎng)技術相繼建立；50年代后是體外培養(yǎng)技術與生命科學其他技術結合發(fā)展的新時期，誕生了

3、多種培養(yǎng)的應用技術。 由于組織培養(yǎng)在醫(yī)學研究中的應用，如抗病毒疫苗的生產等，現(xiàn)已經逐漸發(fā)展成為一門精細技術。許多細胞株、細胞系的培育成功，尤其是以人的腫瘤組織為材料建立的各種細胞系，如Hela細胞系（Gey，1952），可用來進行一系列研究，更加促進了組織培養(yǎng)技術的發(fā)展。1)細胞內部的種種活動,如DNA的復制和轉錄、蛋白質合成、能量代謝;2)細胞內部的流動,如RNA從細胞核向細胞質方向運轉,激素受體復合物的易位等;3)生態(tài)學,如營養(yǎng)、感染、病毒或化學誘變、藥物作用;4)細胞與細胞之間的相互作用,如胚胎誘導、細胞群體的動力學等.組織培養(yǎng)中感興趣的研究領域 1）理化環(huán)境可以調控 2）細胞經過多次傳

4、代培養(yǎng)形成細胞系，其特征基本相同，對外界影響因素的反應也較為一致。 3）培養(yǎng)物可直接暴露在預測的試劑中，預測樣品用量少，并可直接觀測反應。 4）可通過繁殖擴增，提供大量均勻的細胞備用，供比較不同因素或同一因素不同劑量對同一細胞株的作用。 5）可以人工篩選具有一定特征變異的細胞株或細胞融合，有利于基因功能的研究。 6）組織培養(yǎng)結合縮時電影技術，可以直接觀察細胞的活動和對外界作用的反應。細胞培養(yǎng)應用的優(yōu)點體內外細胞的差異 當人工條件和體內實際情況不完全相同時,細胞在體外培養(yǎng)后,一旦失去神經體液調節(jié)和細胞間相互影響,生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中,發(fā)生變化則是必然.細胞最多見的表現(xiàn)是:返祖（Atavis

5、m）現(xiàn)象失去原有組織結構和細胞形態(tài)、分化減弱或不顯、細胞趨單一化、不死性、惡性狀。培養(yǎng)細胞的分化 不適應（Deadaption）細胞在體內時所擁有的分化特性減弱或不顯。例如肝細胞在體外喪失了產生酪氨酸轉移酶的特性.脫分化和去分化（Dedifferentiation）由于基因變異而使細胞失去分化能力。如肝細胞失掉產生精氨酸酶及氨基酸轉移酶的特性后,儲存肝糖元的能力喪失,并很難再現(xiàn).所以說,不適應和脫分化兩個概念不同.不適應是因為生存條件改變而使分化發(fā)生抑制;從分子水平考慮,脫分化很可能是基因變異所致. 培養(yǎng)細胞的形態(tài) 1.貼附型： 1）成纖維細胞：心肌細胞，血管內皮細胞等 2）上皮型細胞：消化管

6、外皮細胞，肝臟上皮細胞等 3）游走型細胞：神經膠質細胞 4）多形型細胞：神經組織細胞 2.懸浮型：如癌細胞和血液白細胞 組織培養(yǎng)細胞的生長和增殖 1.原代培養(yǎng)（Primary Culture）階段：原代培養(yǎng)也稱初代培養(yǎng)，嚴格的說即從體內取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，但實際上，通常把第一代至第十代以內的培養(yǎng)細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng) ，隨不同的組織時間長短不一，一般為1-4w。2.傳代培養(yǎng)（Subculture）階段：或稱繼代培養(yǎng)。也就是細胞系（Cell line）階段。細胞增殖旺盛，一般細胞可傳代10-50代）。二倍體細胞系（Diploid cell line）：即細胞保持二倍體核型。 3.衰

7、退階段： 細胞增殖減慢或不增殖，甚至最后凋亡。但少數情況下，在這三期的任何一點，由于某種因素影響，細胞發(fā)生自發(fā)性轉化。（物理 化學 病毒等因素1）潛伏期（Latent phase）：細胞從接種到貼壁生長繁殖的一段時間。2倍體細胞該期時間長（24-96h），連續(xù)細胞系時間短（10-30min）。一代周期內細胞生長的三個時期2) 指數生長期（Logarthmic growth phase）：細胞增殖最旺盛時期，一般用細胞分裂指數（Mitotic index MI）表示：即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數。體外培養(yǎng)細胞分裂指數介于0.1-0.5%，且受細胞種類培養(yǎng)液成分、pH、溫度等影響。指數生

8、長期是細胞活力最好的時期，在接種細胞數量適宜情況下，指數生長期持續(xù)3-5d后，隨細胞數量不斷增多，生長空間日趨減少，細胞相互接觸匯合成片，呈現(xiàn)接觸抑制（Contact inhibition）。而惡性細胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)分正常與癌細胞標志之一。但癌細胞則由于營養(yǎng)成分的消耗和細胞代謝產物的影響而發(fā)生密度抑制（Density inhibition）。3）停滯期（Stagnate phase）：即細胞數量達到飽和密度后，細胞與營養(yǎng)液的交換面積減少,代謝產物積累,PH下降細胞停止增殖，進入停滯期。在此時應及時進行換液傳代，否則因細胞中毒受損，大量細胞出現(xiàn)死亡，至少再傳1-2代后，細

9、胞才能恢復。 細胞培養(yǎng)中應注意的幾個問題 1）培養(yǎng)液和培養(yǎng)物:一定濃度的培養(yǎng)液僅能支持一定數量的細胞生長,不能盲目增加每單位體積的細胞濃度. 2）PH:7.2-7.4 7.6或6.0 細胞損傷、退變或死亡3）培養(yǎng)瓶內的空間:一般培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)液與液面上的空間體積之比為1:10.4）容積、深度、表面面積:培養(yǎng)液體積與表面面積的比例為5）去除死細胞: 6) 溫度控制：動物細胞培養(yǎng)對溫度波動較為敏感。溫度低于36.5C，細胞生長緩慢，高于38C，細胞失去活力。 1.據CCTV4報道，13年10月中國臺灣地區(qū)臺北榮民總醫(yī)院在干細胞研究方面有重大突破，研究人員利用干細胞已分化出網膜和心肌細胞，目前該研究正

10、處于臨床實驗階段，未來有望生產干細胞藥品有效治療失明、心臟病等。 細胞培養(yǎng)的應用2.一口好牙不但能給出一個美麗的笑容，還是健康的標志。但由于疾病或意外事故，我們可能失去牙齒。鑲顆金牙吧，有損整體美觀?，F(xiàn)在好了，科學家成功利用人的尿液衍生的細胞誘導形成干細胞獲得再生牙齒雛形。7月30日，這項研究成果刊登在學術期刊細胞再生上，同時也引發(fā)國際社會廣泛討論。 3. 中化新網訊 科學家13年8月表示，他們已利用干細胞，培養(yǎng)出能在培養(yǎng)皿上自發(fā)收縮的人類心臟組織，意味在尋求制造移植器官方面獲致進展。 美國賓州匹茲堡大學研究團隊利用取自人類皮膚細胞得出的誘導性多功能干細胞（iPS），制作出名為MCPs的心臟前

11、驅細胞。4. 2013年7月，利用誘導性多功能干細胞（iPSCs），日本科學家首次成功培育出具有功能的人類肝臟。這項發(fā)表在自然上的研究結果轟動了整個科學界。當前急需器官移植的患者眾多，器官的捐獻率卻常年處于低位。iPS細胞培養(yǎng)的器官有望成為移植臟器的新來源，減少患者對于捐贈器官的依賴。研究小組利用人類誘導性多功能干細胞（iPSCs），在體外培育出簡單的人類肝臟，移植到小鼠體內后，這些肝臟成功血管化并正常行使功能。這是科學界首次用誘導性多功能干細胞（iPSCs）培育出具有功能的人類器官。 5. CLS生物治療的原理是利用自身免疫殺滅腫瘤細胞。2011年諾貝爾醫(yī)學獎獲得者斯坦曼博士在1973年發(fā)現(xiàn)了激活免疫系統(tǒng)的關鍵細胞DC細胞。在20世紀80年代，科學家又培養(yǎng)出了具有腫瘤強殺傷效應的CIK細胞。這兩種細胞是腫瘤生物治療的關鍵。CLS生物治療通過體外實驗萬倍擴增這兩類細胞，再輸回患者體內實現(xiàn)腫瘤大面積殺傷治療。CLS多細胞生物免疫治瘤-有效延長生命長度 3-5年,保證提升生物質量,實現(xiàn)瘤自我康復 .細胞培養(yǎng)前景 胚胎干細胞是人體發(fā)展的初始階段，胚胎干細胞被認為是治療修復人體的最好材料。美國奧巴馬總統(tǒng)上任后的第一個科技政策就是支持鼓勵胚胎干細