基因的轉(zhuǎn)移與重組體的檢驗(yàn)課件

1、外源DNA載體DNA重組分子原核細(xì)胞真核細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)表達(dá)連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射受體細(xì)胞第四章 基因的轉(zhuǎn)移與重組體的檢驗(yàn) 1.轉(zhuǎn)化（transformation)大腸桿菌捕獲質(zhì)粒DNA的過(guò)程。2.轉(zhuǎn)染（transfection)大腸桿菌捕獲噬菌體DNA的過(guò)程。（1）目的增加受體菌細(xì)胞膜的通透性。一 、重組體導(dǎo)入寄主細(xì)胞3. 感受態(tài)大腸桿菌的制備使用喪失了限制體系的大腸桿菌。如K12系列的大腸桿菌。（2）菌種 Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等），1970年建立此技術(shù)，其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空

2、隙，細(xì)菌細(xì)胞此時(shí)的狀態(tài)叫做感受態(tài) （3）制備原理Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備：100 ml 菌體培養(yǎng)至OD600 = 0.5，離心收集菌體 用10 ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液懸浮菌體，離心收集菌體用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液懸浮菌體 冰浴放置12 - 24小時(shí)，備用 （4）制備過(guò)程外源載體DNA（攜帶插入基因片斷）進(jìn)入感受態(tài)菌體細(xì)胞里的過(guò)程。4. 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化方法 Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化l噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染電穿孔轉(zhuǎn)化Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：取100 ml 感受態(tài)細(xì)胞，加入相當(dāng)于

3、50 ng 載體的重組冰浴放置半小時(shí) 在42保溫 1-2 分鐘（熱脈沖） 快速將轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置1 - 2分鐘 DNA連接液，混勻加入1 ml 新鮮培養(yǎng)基，于37培養(yǎng) 1 小時(shí)（擴(kuò)增） 涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選 特點(diǎn)是簡(jiǎn)單但轉(zhuǎn)化效率不高（106-108/gDNA）。電穿孔轉(zhuǎn)化 將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場(chǎng)。在強(qiáng)大電場(chǎng)的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi) 電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡(jiǎn)單，而且?guī)缀鯇?duì)所有含細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大特點(diǎn)是轉(zhuǎn)化效率高（高于109/gDNA）。LB培養(yǎng)受體菌至

4、OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，2C離心集菌冰冷的水重懸菌體2C離心集菌冰冷的水重懸菌體2C離心收集菌體少量冰冷的水重懸分裝成50-300L電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV,25F脈沖控制器200-4000.5g質(zhì)粒DNAOn ice混合加入1mLSOC培養(yǎng)液37C中速震蕩60分鐘10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板轉(zhuǎn)化細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接納外源DNA的主要屏障是細(xì)胞壁，因而這類(lèi)細(xì)菌通常采用原生質(zhì)體（細(xì)胞去壁后的形態(tài)）轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移質(zhì)?；蛑亟MDNA分子 酵母菌、霉菌、植物細(xì)胞也可用原生質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 不同細(xì)菌的原生質(zhì)體制備

5、方法不盡相同，以鏈霉菌為例：細(xì)菌需生長(zhǎng)在高滲培養(yǎng)基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加細(xì)菌細(xì)胞壁對(duì)溶菌酶的敏感性。在制備過(guò)程中，菌體應(yīng)始終懸浮在10.3%的蔗糖等滲溶液中。與原生質(zhì)體接觸的所有器皿應(yīng)保持無(wú)水無(wú)去污劑 細(xì)菌原生質(zhì)體的制備：轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 取0.2 - 1ml的原生質(zhì)體懸浮液（108-109個(gè)原生質(zhì)體），加入10 - 20 ml DNA重組連接液，同時(shí)加入含有PEG1000和Ca2+的等滲溶液，混勻 細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：細(xì)菌原生質(zhì)體的再生： 原生質(zhì)體再生的主要目的是使細(xì)菌重新長(zhǎng)出細(xì)胞壁。再生在特殊的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行，內(nèi)含脯氨酸和微量元素 轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)l

6、噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)： 將大腸桿菌在含有麥芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)至OD600 = 0.5吸附： 加入經(jīng)體外包裝好的重組噬菌體懸浮液，30保溫10分鐘轉(zhuǎn)染裂解： 加入20倍體積的新鮮培養(yǎng)基，30培養(yǎng)2小時(shí)，直至培養(yǎng)液 中菌體裂解，培養(yǎng)液澄清度增加，然后涂板篩選轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的定義 轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)，其定義為：每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。由于在一般的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)規(guī)模下，每個(gè)受體細(xì)胞最多只能接受一個(gè)載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每微克載體DNA轉(zhuǎn)化后，接納DNA的受體細(xì)胞的個(gè)數(shù)，即克隆數(shù)（在篩選時(shí)，未接納載體或重組子的

7、受體細(xì)胞不長(zhǎng)）轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的定義 例如，pUC18對(duì)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為108，即每微克pUC18中只有108個(gè)分子能進(jìn)入受體細(xì)胞。1微克pUC18共有3.4X1011個(gè)分子（6.02X1017 / 2686X660），也就是說(shuō)，每3400個(gè)pUC18分子才有一個(gè)分子進(jìn)入受體細(xì)胞 轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的用途 利用轉(zhuǎn)化率和重組率等參數(shù)可以幫助設(shè)計(jì)DNA重組實(shí)驗(yàn)規(guī)模例如，某一DNA重組實(shí)驗(yàn)的重組率為20%，轉(zhuǎn)化率為107/mg載體， 經(jīng)切接處理后的載體轉(zhuǎn)化率比天然的載體低100倍，欲獲得104個(gè) 重組克隆，需投入多少載體DNA進(jìn)行重組實(shí)驗(yàn)？ 若重組率為100%，則轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生104個(gè)重組克隆需要： 104 /

8、 107 X 10 - 2 = 0.1 mg 載體DNA 考慮到實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的重組率為20%，所以實(shí)際投入載體應(yīng)為： 0.1 / 20% = 0.5 mg 載體DNA 載體投入量確定后，外源DNA的投入量即可按101的要求算出（5 mg）轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的影響因素載體及DNA重組分子方面： 載體本身的性質(zhì)：不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率不同 載體的空間構(gòu)象：質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率一般要比新制備的超螺旋質(zhì)粒低兩個(gè)數(shù)量級(jí) 插入片段的大?。簩?duì)質(zhì)粒載體而言，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低 轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的影響因素受體細(xì)胞方面： 受體細(xì)胞必須與載體相匹

9、配，例如：pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM83株，轉(zhuǎn)化率很低；但對(duì)大腸桿菌ED8767株的轉(zhuǎn)化率則較高 轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的影響因素轉(zhuǎn)化方法方面： 受體細(xì)胞的預(yù)處理：影響最大制備感受態(tài)菌必須使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌。必須在冰冷的條件下制備。CaCl2處理要充分，使細(xì)菌細(xì)胞膜失去一些蛋白。儲(chǔ)存感受態(tài)菌要在70以下。供受體的比例：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化 0.1 ml 感受態(tài)細(xì)胞 50 ng DNA 轉(zhuǎn)化方法：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化 106 - 107 / mg DNA 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 109 個(gè)原生質(zhì)體 50 ng DNA 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 105 - 106 / mg DNA l-DNA轉(zhuǎn)染 107 - 108 / mg DNA

10、 電穿孔轉(zhuǎn)化 106 - 109 / mg DNA 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增擴(kuò)增操作 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增操作是指轉(zhuǎn)化完成之后細(xì)胞的短時(shí)間培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，擴(kuò)增操作往往與轉(zhuǎn)化操作偶聯(lián)在一起，如： Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的37培養(yǎng)一個(gè)小時(shí) 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后的再生過(guò)程 l噬菌體轉(zhuǎn)染后的30培養(yǎng)等，均屬擴(kuò)增操作 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增擴(kuò)增操作的目的增殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使得有足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于篩選程序 擴(kuò)增和表達(dá)載體分子上的標(biāo)記基因，便于篩選 表達(dá)外源基因，便于篩選和鑒定 小結(jié)目的基因 查詢、獲得、酶切制備載體 提取、酶切制備宿主細(xì)胞（感受態(tài)） 連接轉(zhuǎn)化二 轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)克隆DNA序列檢測(cè)外源基因產(chǎn)物檢測(cè)重組

11、率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想極限根據(jù)重組體克隆的表現(xiàn)型特征進(jìn)行選擇的方法。（1）遺傳檢測(cè)法 pBR322質(zhì)粒上有兩個(gè)抗菌素抗性基因，Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位點(diǎn)BamH I和Sal I; Ampr上有插入位點(diǎn)Pst I。當(dāng)由外源DNA插入后就會(huì)造成抗菌素抗性失活。原理：抗藥性篩選法載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)抗藥性篩選法： 將外源DNA片段插在EcoRI位點(diǎn)： 非重組子呈 Apr、Tcr 重組子呈 Apr、Tcr 將外源DNA片段插在BamHI位點(diǎn)： 非重組子呈 Apr、Tcr 重組子呈 Apr、Tcs 正選擇：四環(huán)素：氨芐青霉素抗性基因：常用的抗菌素標(biāo)記產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇?/p>

12、酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（藍(lán)灰色）褪色。抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，但不殺死細(xì)菌。殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌，但不殺死停止生長(zhǎng)的細(xì)菌。環(huán)絲氨酸：負(fù)選擇：如果在Tetr上插入外源DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素加環(huán)絲氨酸平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。如果Ampr上插入外源DNA，導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液選擇。Tetr失活的菌生長(zhǎng)被四環(huán)素抑制，但不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來(lái)；Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長(zhǎng)，從而被環(huán)絲氨酸殺死?？咕厥Щ钸x擇過(guò)程載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法的基本原理： 載體分子上攜帶某種營(yíng)養(yǎng)組份的合成基因，而受體細(xì)胞本

13、身不能合成這一營(yíng)養(yǎng)組份，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在不含此營(yíng)養(yǎng)組份的培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出的便是轉(zhuǎn)化子 載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)顯色篩選法載體上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位點(diǎn)。受體菌基因組中有突變的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）?？梢员籌PTG誘導(dǎo)表達(dá)。載體和受體菌基因組可以互補(bǔ)形成完整有功能的-半乳糖苷酶。原理： -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法-半乳糖苷酶乳糖半乳糖葡萄糖Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛藍(lán)+深藍(lán)色-半乳糖苷酶使Xgal分解成蘭色產(chǎn)物。選擇過(guò)程克隆DNA序列檢測(cè)限制性酶切圖譜法 所謂的限制性酶切圖譜法就是對(duì)載體上插入的外源DNA片段進(jìn)行酶切圖譜分析，并以此與目的

14、基因的已知圖譜對(duì)比，因此利用這種方法不僅能區(qū)分重組子與非重組子，而且還能鑒定目的重組子。但這種方法在用于數(shù)千規(guī)模的轉(zhuǎn)化子篩選時(shí)，工作量極大，實(shí)驗(yàn)成本也高。克隆DNA序列檢測(cè)限制性酶切圖譜法全酶解圖譜法：pUC18 2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZoriBBEP4.0 kb1.0 kb0.8 kb區(qū)分重組子與非重組子用BamHI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA電泳觀察酶解產(chǎn)物片段重組子： 2.7 kb + 4.0 kb非重組子： 2.7 kb如果外源DNA片段也是2.7 kb，最好選用單一切口的酶將質(zhì)粒線型化，然后通過(guò)其長(zhǎng)度來(lái)

15、鑒定其是否為重組子利用帶插入片段的重組載體分子量比野生型載體分子量大。重轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。克隆DNA序列檢測(cè)菌落噬菌斑原位雜交法 菌落或噬菌斑原位雜交法的工作原理是根據(jù)克隆的目的基因或DNA片段的同源序列設(shè)計(jì)并合成探針，以此搜尋篩選含有目的基因的目的重組子。其中，DNA同源序列之間的特異性互補(bǔ)雜交是該技術(shù)的基本理論依據(jù) 克隆DNA序列檢測(cè)菌落噬菌斑原位雜交法菌落原位雜交法的基本操作：對(duì)應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽(yáng)性菌落。但需要目的基因的探針。克隆DNA序列檢測(cè)菌落噬菌斑原位雜交法雜交探針的制備：用于菌落或噬菌斑原位雜交的探針必須滿足下列條件：?jiǎn)捂溄Y(jié)構(gòu)（

16、雙鏈DNA可用堿變性） 足夠長(zhǎng)度（至少12個(gè)堿基） 內(nèi)部不含互補(bǔ)區(qū) 探針的制備方法或來(lái)源包括：人工合成 cDNA合成 同源序列 mRNA 克隆DNA序列檢測(cè)菌落噬菌斑原位雜交法雜交探針的標(biāo)記：T4-PNP介導(dǎo)的末端標(biāo)記5 HO3 HOOH 3 OH 5 T4-PNPMg2+ pppATP（g-32P-ATP）5 p3 HOOH 3 p 5 克隆DNA序列檢測(cè)菌落噬菌斑原位雜交法雜交探針的標(biāo)記：逆轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記3AAAAAAAAAAACCAGCTTCCGAACTGATTTAGGCT5mRNA反轉(zhuǎn)錄酶Mg2+ dNTP + pppdATP（a-32P-dATP）5TTTTTTTTTTT5m

17、RNA3cDNA3AAAAAAAAAAACCAGCTTCCGAACTGATTTAGGCT5TTTTTTTTTTTGGTCGAAGGCTTGACTAAATCCGA純化的DNA片斷DNase I 制造單鏈缺口DNA Pol I 進(jìn)行缺口轉(zhuǎn)移-32P-dNTPs和dNTPs555555553333333332P-dNTPs32P-dNTPs雜交探針的標(biāo)記：DNA聚合酶介導(dǎo)的缺刻前移標(biāo)記非放射性標(biāo)記酶促生物素標(biāo)記：生物素探針序列待測(cè)基因親和素酶底物中間產(chǎn)物產(chǎn)物發(fā)光克隆DNA序列檢測(cè)菌落噬菌斑原位雜交法雜交探針的標(biāo)記：ABC熒光標(biāo)記GCTTGAGCAGTAACCTG顯色酶Biotin 生物素Avidin

18、生物素結(jié)合蛋白烷烴連接臂克隆DNA序列檢測(cè)菌落噬菌斑原位雜交法雜交探針的標(biāo)記：ABC顯色酶標(biāo)記GCTTGAGCAGTAACCTG顯色酶Biotin 生物素Avidin 生物素結(jié)合蛋白烷烴連接臂生色底物顏色產(chǎn)物酶：辣根過(guò)氧化物酶（HRP），堿性磷酸梅（AP）底物：Lumigen-PPDb,Lumi-Phos530b, AMPPD, CSPD克隆DNA序列檢測(cè)DNA序列分析法雙脫氧末端終止測(cè)序法的基本原理： DNA序列測(cè)定是精確鑒定目的基因的重要手段，目前國(guó)際上流行采用Sanger發(fā)明的雙脫氧末端終止法測(cè)定DNA序列，其工作原理是在DNA聚合反應(yīng)的進(jìn)程中，通過(guò)位點(diǎn)特異性終止測(cè)定DNA序列其關(guān)鍵技術(shù)有：DNA鏈聚合反應(yīng)時(shí)的定點(diǎn)隨機(jī)中斷（ddNTP）聚丙烯酰胺凝膠電泳的高分辨率（600 bp / 601 bp）電腦自動(dòng)檢測(cè)、記錄、編輯程序用于DNA測(cè)序的專一性試劑盒（Kit）克隆DNA序列檢測(cè)DNA序列分析法雙脫氧末端終止測(cè)序法的基本操作： A C G T ssDNA ssDNA ssDNA ssDNA Primer Primer Primer Primer KlenowKlenowKlenowKlenowdNTPsdNTPsdNTPsdNTPsddATPddCTPddGTPddTTPA G T C DNA聚合反應(yīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳外源基因產(chǎn)物檢測(cè)蛋白質(zhì)生物功能