通過測定血漿和尿液中的肌酸和胍基乙酸來診斷肌酸代謝疾病

1、 通過測定血漿和尿液中的肌酸和胍基乙酸來診斷肌酸代謝疾病 Qin Sun和William E. OBrien摘要肌酸代謝疾病包括肌酸運(yùn)載體缺乏，還有參與肌酸合成的精氨酸-甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶（AGAT）和胍乙酸甲基轉(zhuǎn)移酶（GAMT）這兩種酶的缺乏。實(shí)驗(yàn)室對這些疾病的診斷依賴于血漿和尿液中肌酸和胍乙酸的測定。這里我們記述一種快速HPLC/MS/MS法，測量將分析物衍生化后經(jīng)正相HILIC分離后的產(chǎn)物。關(guān)鍵詞：肌酸，胍基乙酸，精氨酸-甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶，AGAT，胍基乙酸甲基轉(zhuǎn)移酶，GAMT，肌酸運(yùn)載體，質(zhì)譜分析法引言肌酸和磷酸肌酸對于細(xì)胞內(nèi)ATP能量池的時(shí)空調(diào)控至關(guān)重要（1-3）。人類從膳食來源和內(nèi)源

2、獲得肌酸，后者通過精氨酸-甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶（AGAT）和胍乙酸甲基轉(zhuǎn)移酶這兩種酶參與的較短的兩步法合成通路，提供高達(dá)50%的日常肌酸要求。在第一步中，精氨酸-甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶催化從甘氨酸和精氨酸合成鳥氨酸和胍基乙酸（GAA）。然后胍乙酸甲基轉(zhuǎn)移酶把GAA轉(zhuǎn)化成肌酸，此步反應(yīng)需要s-腺苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基供體，而且是最大的SAM消耗反應(yīng)。大部分肌酸合成發(fā)生在腎臟，然后由肌酸膜運(yùn)載體接受（CRT）（4）這些疾病涉及到肌酸合成和膜上肌酸運(yùn)載體兩者（5-10）。這些病都是罕見的，至今只有兩例AGAT缺乏；一百多例GAMT缺乏和幾例CRTR缺乏，但是很可能隨著對這些病了解的增多，將發(fā)現(xiàn)更多的病例

3、。嬰兒期和童年期的病人表現(xiàn)為發(fā)育遲緩，肌張力減退，也出現(xiàn)過幾例癲癇。對于GAMT缺乏的病人，在嬰兒期肌酸處于低水平到正常限值內(nèi)，但是如果先證者實(shí)行嚴(yán)格的素食，在青春期肌酸會(huì)下降。高血漿GAA濃度被認(rèn)為能確診GAMT缺乏。這些病人腦部的磁共振檢查顯示肌酸缺乏和磷酸胍乙酸累積（11）。對于AGAT缺乏，生物化學(xué)檢測顯示血漿中肌酸和肌酐量極低， GAA的濃度也低。通過測量羊水中的胍乙酸，產(chǎn)前診斷是可能的（12）。肌酸運(yùn)載體，在給腦、骨骼和心肌提供充足能量上起到重要作用，對腎臟再吸收肌酸也至關(guān)重要，也負(fù)責(zé)GAA的大腦分佈和攝?。?3,14）。運(yùn)載體由X染色體上的一個(gè)基因（SLC6A8）編碼。這個(gè)基因的

4、突變也在X相關(guān)智力遲鈍的病人中發(fā)現(xiàn)（6, 7, 1517）。生物化學(xué)變化在初發(fā)病例中表現(xiàn)為尿肌酸/肌酐的比值升高。有趣的是，在一碳甲基代謝被妨礙的紊亂中也報(bào)告了胍乙酸和/或肌酸排泄變化，例如，在s-腺苷甲硫氨酸水解酶缺乏和鈷胺素缺乏的情況下（18,19）。對乙酸和肌酸測定已報(bào)道過數(shù)種方法，如使用HPLC, GC/MS,和HPLC/串聯(lián)MS（20-23）技術(shù)的方法。雖然用這些方法定量尿液中高濃度的胍乙酸和肌酸沒有困難，但是難于準(zhǔn)確測量AGAT缺乏時(shí)出現(xiàn)的低血漿胍乙酸濃度不夠靈敏。我們描述了一種改良的串聯(lián)MS方案，使用衍生分析和親水交互作用柱（HILIC）。HILIC是正相色譜分析法的變體，用于分

5、離非常極性的物質(zhì)。這個(gè)方法足夠靈敏，能測量低濃度的胍乙酸并能同時(shí)分析尿液和血漿的樣品。材料標(biāo)本要求血漿樣品（肝素鈉抗凝）：立即離心樣品并把血漿（0.51.0 mL）轉(zhuǎn)移到標(biāo)記的試管中。在-16或以下冷凍儲(chǔ)存。樣品應(yīng)該在收集后的兩周內(nèi)分析。樣品在收集地點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)室之間的運(yùn)輸應(yīng)該有干冰（見備注1）。尿液樣品：冷凍25 ml尿液。標(biāo)本可以冷凍儲(chǔ)存2周。樣品在收集地點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)室之間的運(yùn)輸應(yīng)該有干冰（見備注1）。試劑1%甲酸銨：在800ml HPLC級(jí)H2O中添加10ml甲酸，用濃氫氧化銨溶液調(diào)整pH到4.0，使總體積達(dá)到1升。在室溫儲(chǔ)存?？煞€(wěn)定2年。HPLC運(yùn)行緩沖液：包含0.05%甲酸銨的95%乙腈。在

6、950ml乙腈中添加50ml 1%的甲酸銨溶液。在室溫儲(chǔ)存，可穩(wěn)定2年。衍生劑， 配制在正丁醇中的3N鹽酸（Regis Technologies, Inc., Morton Grove, IL）標(biāo)準(zhǔn)品和校準(zhǔn)品肌酸標(biāo)準(zhǔn)品一級(jí)儲(chǔ)存液，6 mM：在50 ml乙腈與水的混合液（乙腈/水=50/50）中中添加44.75 mg肌酸?？衫鋬觯?16或以下）儲(chǔ)存達(dá)2年。肌酸標(biāo)準(zhǔn)品次級(jí)儲(chǔ)存液，600 M：用9 ml乙腈與水的混合液（乙腈/水=50/50）稀釋1ml肌酸標(biāo)準(zhǔn)品一級(jí)儲(chǔ)存液，使有效濃度為600 M。冷凍儲(chǔ)存可達(dá)1年（-16或以下）。肌酸質(zhì)量控制溶液，7.6 mM：在50 ml乙腈與水的混合液（乙腈/水

7、=50/50）中添加50 mg肌酸。胍基乙酸標(biāo)準(zhǔn)品一級(jí)儲(chǔ)存液，5 mM：在50 ml乙腈與水的混合液（乙腈/水=50/50）添加29.3 mg胍基乙酸。冷凍儲(chǔ)存儲(chǔ)備溶液可達(dá)2年（-16或以下）。胍基乙酸標(biāo)準(zhǔn)品次級(jí)儲(chǔ)存液，50 M：把100l儲(chǔ)備溶液與9.9 ml乙腈與水的混合液（乙腈/水=50/50）混合稀釋。冷凍儲(chǔ)存可達(dá)1年（-16或以下）。胍基乙酸質(zhì)量控制溶液，850M：在250ml乙腈與水的混合液（乙腈/水=50/50）中添加25mg GAA。按如下步驟制備肌酸和胍基乙酸標(biāo)準(zhǔn)品的工作液（見備注1）：GAMT A標(biāo)準(zhǔn)液，300M肌酸和25M GAA ： 混合等體積的600M肌酸和50M胍乙

8、酸的次級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)存液。GAMT B標(biāo)準(zhǔn)液，30M肌酸和2.5M GAA：以1:10的比例混合上述GAMT A標(biāo)準(zhǔn)液和95%乙腈。根據(jù)1制備6個(gè)校準(zhǔn)品，在充分混合后用SpeedVac干燥。干燥時(shí)間大約是30分鐘。表1GAA和CRT標(biāo)準(zhǔn)液GAMT A lGAMT B l內(nèi)標(biāo)lCRT最終濃度（M）GAA最終濃度（M）G130 1030025G2151015012.5G310101008.33G43010302.5G51510151.25G6101050.4內(nèi)標(biāo)和質(zhì)控品內(nèi)標(biāo)（D3-肌酸）：在20 ml乙腈與水的混合液（乙腈/水=50/50）中添加10mg D3-肌酸，使溶液濃度大約為3.7 mM，本儲(chǔ)

9、備溶液在-16或以下冷凍儲(chǔ)存可穩(wěn)定5年。按1/500混合儲(chǔ)備溶液與乙腈與水的混合液（乙腈/水=50/50），配制成內(nèi)標(biāo)工作液（大約6.35 mM）。在-16或以下可儲(chǔ)存1年。尿液對照：可以使用志愿者或者無藥物尿的混合尿液。按照1:10用水稀釋混合尿液，制備“正常的”尿液對照。使用未稀釋的尿液作為“高值”控制品。將上市對照液分裝，在-16或以下冷凍儲(chǔ)存。血漿對照：使用新鮮的冷凍血漿或相似材料制備對照品。其一部分進(jìn)行分裝來制備“正常的”對照。在4ml新鮮冷凍血漿中添加100l 7.6mM肌酸和100l 850M胍基乙酸質(zhì)量的控制標(biāo)準(zhǔn)液，制備“高值”控制品。設(shè)備1. Micromass Quattr

10、o Micro Spectrometer (Waters Corp., Milford, MA)2. Waters 2695 HPLC (Waters Corp., Milford, MA).3. Atlantis HILIC (Hydrophilic Interaction Chromatography) HPLC column, 2.1 100mm, 5 m (Waters Corp. Milford, MA).4. Masslynx analytical software (Waters Corp., Milford, MA).5. SPD1010 SpeedVac (Thermo Fi

11、sher Scientific, Waltham, A).方法血漿樣品制備解凍樣品，混合均勻。樣品處理可在室溫下進(jìn)行。向適當(dāng)標(biāo)記的1.5ml 微離心管中轉(zhuǎn)移30l 血漿樣品和添加10l內(nèi)標(biāo)工作溶液。在以上的混合物中添加300l乙腈，渦旋振蕩使蛋白質(zhì)沉淀。在桌面離心機(jī)中以10,500g的速度離心10分鐘。把上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的標(biāo)記試管，在SpeedVac中徹底干燥液體（在45加熱45分鐘）。尿液樣品制備測定尿液樣品的肌酐濃度。肌酐值用于在隨后的步驟中調(diào)整適當(dāng)?shù)哪蛞合♂尪?。本檢測不適用于肌酐濃度小于0.1 mg/ml的樣品（見備注2）。如果肌酐濃度在0.1-0.4 mg/ml之間，用去離子水按照1

12、:10稀釋樣品，如果肌酐的濃度在0.4 mg/ml以上，則以1:75的倍數(shù)稀釋樣品（見備注3）。用去離子水按照1:10稀釋正常和高值尿液對照品。把10l稀釋的尿液樣品和對照品轉(zhuǎn)移到1.5ml的標(biāo)記微的離心管中。添加10l內(nèi)標(biāo)工作溶液，渦旋混合。在45下用SpeedVac徹底干燥加熱45分鐘。微量液體不影響最終結(jié)果。HPLC/ MS/MS分析的樣品制備干燥后向所有試管中各添加70 l 3 N HCl的正丁醇溶液，包括標(biāo)準(zhǔn)液、對照品和樣品，混合均勻。把試管放在65加熱塊中20分鐘，在此期間至少渦旋一次。取出試管，在 45的SpeedVac中干燥內(nèi)容物。干燥時(shí)間大約為30分鐘。微量液體不會(huì)影響最終結(jié)

13、果。在每個(gè)試管中添加1ml 95%乙腈，混合均勻。在10,500g下離心試管6分鐘，以除去任何懸浮微粒。把150l上清液轉(zhuǎn)移到150l樣品瓶中，供色譜分析。HPLC和串聯(lián)質(zhì)譜分析法的設(shè)置（見備注4）親水CRT和GAA的色譜分離在室溫下執(zhí)行，使用Atlantis HILIC（親水作用色譜）HPLC柱，2.1100 mm, 5 m。流動(dòng)相的流速保持在0.2 mL/min。質(zhì)譜分析儀的設(shè)置如下：電噴射陽離子模式（ESI+），毛細(xì)管電壓3.5 kV，源錐孔電壓25 V，提取電壓4V，源溫度130，脫溶劑溫度350，分析儀碰撞15。噴霧器和去溶化的氮?dú)馑俾史謩e是90和600 l/h。采用多反應(yīng)監(jiān)測（MR

14、M）：胍乙酸174101，肌酸18890，D3-肌酸19193。典型色譜圖見圖1。圖1：樣品的LC-MS/MS分析色譜圖。各個(gè)MRM檢測離子對如下：上圖，D3-肌酸（m/z19193）；中圖，在6.3分鐘肌酸（m/z 18890）；下圖，在6.0分鐘GAA （m/z 174101）。數(shù)據(jù)分析使用Masslynx軟件，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品和質(zhì)控品的濃度。表2的濃度值考慮到檢測中使用的樣品體積。需要輸入尿液稀釋因子，供Masslynx計(jì)算數(shù)值。只要樣品體積不變，不需要進(jìn)一步計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（r2）應(yīng)該在0.97.3以上。對照值應(yīng)該在既定對照均值2 SD之內(nèi)結(jié)果方可接受。質(zhì)控范圍的例子見表3

15、和.4。表2尿液樣品的稀釋因子計(jì)算肌酐mg/mlH2O稀釋分析的尿樣體積（L）分析的標(biāo)準(zhǔn)樣品體積（L）由于體積差異進(jìn)行的額外稀釋最終稀釋因子0.10.4101030330 (103)0.4及以上7510303225 (753)表3尿液質(zhì)控范圍例化合物高容許限（M）正常容許限（M）肌酸660126050165胍乙酸1603301040表4血漿質(zhì)控范圍例化合物高容許限（M）正常容許限（M）肌酸752401055胍乙酸8450.52.54. 如果臨床樣品的數(shù)值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限，那么必須進(jìn)一步稀釋和重新分析。結(jié)果解釋1. 血漿和尿液的參考范圍見表5。這些數(shù)值只是作為指南，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室要建立自己的參考范

16、圍。有報(bào)告說尿液中胍基乙酸的濃度隨著年齡而減少，但是血漿濃度隨著年齡而增加（20）。另外的報(bào)告也指出了參考值與年齡相關(guān)的變化（24）。但是，這一趨勢未在我們的參考范圍中反映出來（表5）。這可能是由于年齡組或樣品構(gòu)成的差異，因?yàn)槲覀兊膮⒖挤秶莾?nèi)部建立的。表5CRT和GAA參考范圍血漿（M）尿液（mmoles/mole肌酐）0-2歲2歲以上1-5歲5歲以上CRT28-10220-11020-90012-500GAA0.3-1.50.3-2.88-1308-1502. 肌酸缺乏異常：對這些病人的生物化學(xué)發(fā)現(xiàn)高度取決于方法學(xué)的差異。以下是用于解釋病人結(jié)果的通用性指南。要記住，飲食和補(bǔ)充劑對于肌酸濃度

17、有重大影響。成人可能從飲食中獲取50%肌酸，主要是從肉和魚中獲得。因此，西方飲食的人很少有低肌酸濃度。另外，肌酸是運(yùn)動(dòng)員最常用的營養(yǎng)補(bǔ)充劑（25）。病人的飲食和補(bǔ)充劑使用歷史是解釋胍乙酸和肌酸結(jié)果的重要信息。AGAT或GAMT缺乏病人的肌酸濃度通常在參考范圍內(nèi)或只稍微高于參考范圍，而血漿胍基乙酸濃度（表6）則更有意義而且足夠用于診斷。值得注意的是，由于鈷胺素缺乏，在當(dāng)甲基丙二酸尿癥併發(fā)高胱氨酸尿癥時(shí)血漿胍基乙酸應(yīng)該是增加（18）。在創(chuàng)傷之后還發(fā)現(xiàn)肌酸尿，很可能是由于肌損傷（26），這樣的病人應(yīng)該在稍后的時(shí)間重新檢測。表6結(jié)果解釋血漿（M）尿液（mmoles/mole肌酐）GAACRTGAACR

18、TAGAT缺乏低低低正常/低GAMT缺乏高低正常/高正常/低CRT運(yùn)載體缺陷正常正常/低正常高備注GAA和肌酸是不穩(wěn)定的。血漿和尿液樣品應(yīng)該在-16或以下冷凍儲(chǔ)存。在從收集地點(diǎn)運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室時(shí)使用干冰。樣品應(yīng)該在收集后的2周內(nèi)分析。溶血的血漿樣品是不可接受的，因?yàn)橛屑t細(xì)胞肌酸污染。儲(chǔ)備溶液冷凍保存時(shí)可以穩(wěn)定達(dá)1年。工作溶液在4儲(chǔ)存時(shí)可以穩(wěn)定6周。即使在正常群體中，肌酸和胍基乙酸的尿排泄變化也相當(dāng)大。為了最小化隨機(jī)尿液收集相關(guān)的多種問題，在做任何解釋之前把這些結(jié)果歸一化為尿肌酐濃度至關(guān)重要。極低的肌酐水平是有會(huì)產(chǎn)生問題的，因?yàn)橐子阱e(cuò)誤地升高肌酐標(biāo)準(zhǔn)化的肌酸和胍乙酸水平。鑒于此，建議取消肌酐非常低（0.4 mg/ml的稀釋因子是225。在Masslynx軟件的運(yùn)行順序表中輸入這些稀釋因子，供后來計(jì)算使