Bcl2、Bax和Caspase3在酒精性肝病大鼠肝組織中的表達(dá)和五田保肝液的干預(yù)作用

1、Bcl-2、Bax和Caspase-3在酒精性肝病大鼠肝組織中的表達(dá)和五田保肝液的干預(yù)作用 作者：畢業(yè)東，蘇金玲，安先鳳，宋星星，范英昌【摘要】 目的研究Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA在酒精性肝病大鼠肝組織中的表達(dá)變化及五田保肝液對(duì)其表達(dá)的干預(yù)作用。方法選用健康清潔級(jí)雄性Wistar大鼠64只，隨機(jī)分為對(duì)照組10只;模型組、中藥治療組、陽(yáng)性對(duì)照組各18只。采用62度白酒(10 mlkg-1d-1)、玉米油(2 mlkg-1d-1)、吡唑(25 mgkg-1d-1)混合物灌胃的方法建立大鼠酒精性肝病模型。12周末處死大鼠，取肝組織采用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)Bcl-2、B

2、ax和Caspase-3 mRNA的表達(dá)。結(jié)果模型組Bcl-2基因表達(dá)較之對(duì)照組和中藥治療組顯著性降低(P0.05);模型組Bax 、Caspase-3基因表達(dá)較之其它各組均明顯升高(P0.05);中藥治療組和陽(yáng)性對(duì)照組Bcl-2、 Bax 、Caspase-3基因表達(dá)差異亦不具有顯著性(P0.05)。結(jié)論大量飲酒可通過(guò)下調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)，上調(diào)Bax 、Caspase-3基因的表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致肝損傷。而五田保肝液可通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的表達(dá)，抑制肝細(xì)胞的凋亡，起到保肝護(hù)肝作用。 【關(guān)鍵詞】 五田保肝液;Bcl-2;Bax;Caspase-3;

3、酒精性肝病;大鼠酒精性肝病(Alcoholic Liver Disease，ALD)的發(fā)生與多種因素關(guān)系密切。其中，長(zhǎng)期大量飲酒通過(guò)各種機(jī)制誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡是ALD發(fā)生發(fā)展的重要原因。在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中證明五田保肝液(專利號(hào)：ZL021581703)對(duì)ALD有預(yù)防和治療作用，但是其具體發(fā)揮作用的靶點(diǎn)和機(jī)制不清。本文擬探討五田保肝液是否對(duì)酒精性肝病大鼠肝細(xì)胞的凋亡具有干預(yù)作用。1材料與儀器1.1動(dòng)物清潔級(jí)健康Wistar大鼠64只，雄性，6周齡，體質(zhì)量(20020) g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所提供。1.2材料和儀器實(shí)驗(yàn)用酒為62度牛欄山二鍋頭，由北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。五田保肝液由深圳

4、市三九現(xiàn)代中藥有限公司提供;陽(yáng)性對(duì)照藥物易善復(fù)(多烯磷脂酰膽堿膠囊)生產(chǎn)單位為賽諾菲安萬(wàn)特(北京)制藥有限公司，批號(hào)/BN：D8099，規(guī)格228 mg。RNA提取試劑盒RNA-Solv Reagent購(gòu)自O(shè)mega公司;SYBR PrimeScript TM RT-PCR Kit試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。ABI7300熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，2700型PCR System擴(kuò)增儀為Applied Biosystems公司產(chǎn)品。2方法2.1實(shí)驗(yàn)分組和動(dòng)物模型制備適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，64只大鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組10只，模型組、中藥治療組、陽(yáng)性對(duì)照組各18只。造模方法1：模型組、中藥治

5、療組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠均以62度牛欄山二鍋頭酒(10 mlkg-1d-1)、玉米油(2 mlkg-1d-1)、吡唑(25 mgkg-1d-1)混合物灌胃,2次/d,早晚各1次。中藥治療組、陽(yáng)性對(duì)照組、模型組大鼠于兩次灌胃之間分別給予相當(dāng)于成人等劑量的五田保肝液(1 020 mgkg-1d-1)、易善復(fù)(123.12 mgkg-1d-1)和相應(yīng)劑量的生理鹽水灌胃，對(duì)照組則每日3次以生理鹽水灌胃。各組大鼠實(shí)驗(yàn)期間均予全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。造模時(shí)間為12周。2.2熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)的基因表達(dá)2.2.1引物的設(shè)計(jì)及合成Bcl-2引物序列：forward：5-TGAACCG

6、GCATCTGCACAC-3; revese：5-CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG-3;Bax引物序列：forward：5-CGGCGAATTGGAGATGAACTG-3;revese：5-AGCAAAGTAGAAGAGGGCAACC-3;Caspase-3引物序列：forward：5- CAGACAGTGGAACTGACGAT -3;revese：5- TTTCAGCATGGCGCAAAGTG -3。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司使用美國(guó)PE公司391型DNA自動(dòng)合成儀合成引物。2.2.2標(biāo)本的留取和處理造模12周末頸椎脫臼處死大鼠，大鼠處死前12 h禁食水。處死大鼠后迅速剖

7、腹取出肝臟，冰生理鹽水沖洗，取肝右葉部分組織置于凍存管后迅速投入液氮中冷凍保存，以備檢測(cè)分子生物學(xué)指標(biāo)。所有手術(shù)器械均經(jīng)DEPC水浸泡和高壓滅菌消毒處理。2.2.3總RNA的提取和檢測(cè)按RNA-Solv Reagent的操作說(shuō)明書(shū)提取大鼠肝組織總RNA，紫外分析及瓊脂糖電泳檢測(cè)總RNA的純度、濃度及完整性。2.2.4逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反應(yīng)條件如下:反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)85，15 min，反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)95，30 s。2.2.5熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)反應(yīng)條件如下:第1步是預(yù)變性, 95, 30 s(1個(gè)循環(huán))。第2步是PCR反應(yīng), 95, 5 s; 60, 3

8、1 s(40個(gè)循環(huán))。反應(yīng)結(jié)束后,使用7300 system SDS software軟件分析PCR過(guò)程中樣本的CT(Threshold cycle)值，每個(gè)標(biāo)本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算平均CT值，每一次反應(yīng)均設(shè)定陰性對(duì)照。采用2-CT計(jì)算各目的基因相對(duì)反應(yīng)起始拷貝數(shù)，以GAPDH為內(nèi)參。2.3統(tǒng)計(jì)方法用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以s表示，各組數(shù)據(jù)比較采用one-way ANOVA方法檢驗(yàn)。3結(jié)果3.1各組大鼠一般情況比較對(duì)照組大鼠健康狀況良好，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程無(wú)一只死亡。模型組大鼠精神萎靡，毛發(fā)干枯蓬亂，部分大鼠出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象，食量減少，大便稀，小便黃。至造模結(jié)束，體質(zhì)量增長(zhǎng)不明顯。至

9、12周末，因酒精誤入氣管死亡3只，因急慢性酒精中毒死亡7只。中藥治療組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠情況好于模型組，精神較活躍，體質(zhì)量增加較模型組快，均因酒精誤入氣管死亡5只，因急慢性酒精中毒死亡4只。3.2PCR產(chǎn)物鑒定各產(chǎn)物的熔解曲線僅有1個(gè)峰,說(shuō)明為單一片段擴(kuò)增,熔解溫度分別為GAPDH 85.3,Bax 86.4,Bcl-2為84.6，Caspase-3為83.9。3.3各組大鼠肝臟組織Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的表達(dá)模型組Bcl-2基因表達(dá)較之對(duì)照組和中藥治療組顯著性降低(P0.05);模型組Bax 、Caspase-3基因表達(dá)較之其它各組均明顯升高(P0.05);中藥治療組

10、和陽(yáng)性對(duì)照組Bcl-2、 Bax 、Caspase-3基因表達(dá)差異亦不具有顯著性(P0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。表1各組大鼠肝組織Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的表達(dá)情況4討論目前，酒精濫用和依賴已成為日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。大量長(zhǎng)期飲酒可導(dǎo)致ALD，在病理組織學(xué)上ALD可分為酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化、酒精性肝硬化幾種常見(jiàn)類型 2。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)ALD的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量研究，認(rèn)為乙醇和其代謝產(chǎn)物的直接毒性作用以及造成機(jī)體的代謝紊亂，自身抗體形成、過(guò)氧化反應(yīng)、線粒體損傷、自由基的形成和氧利用障礙等均可引起肝損傷3。新近研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡在ALD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮

11、重要的促進(jìn)作用4。凋亡是不同于壞死的一種細(xì)胞死亡形式，是細(xì)胞在生理或病理信號(hào)刺激下啟動(dòng)自身凋亡基因發(fā)生的主動(dòng)自殺行為。凋亡目前被認(rèn)為是保持組織自穩(wěn)態(tài)的一個(gè)基本過(guò)程,但是過(guò)度凋亡則會(huì)引起組織損傷，進(jìn)而導(dǎo)致功能障礙。細(xì)胞凋亡受促進(jìn)凋亡因子和抑制凋亡因子的共同調(diào)節(jié)，其中發(fā)揮最主要作用的是Bcl-2家族和Caspase家族。Bcl-2家族和凋亡關(guān)系最密切的是Bcl-2和Bax。Bcl-2蛋白發(fā)揮抗凋亡作用，而B(niǎo)ax蛋白發(fā)揮促凋亡作用，二者作用的整合決定細(xì)胞的生死。單體的Bax不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式一種是與Bcl-2結(jié)合成異源二聚體而抑制Bcl-2的抗凋亡作用，一種是Bax表達(dá)過(guò)量，形成

12、同源二聚體，直接啟動(dòng)或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。如果Bcl-2過(guò)量表達(dá)，則形成Bcl-2同源二聚體，抑制細(xì)胞的凋亡5。綜上所述，細(xì)胞內(nèi)兩類蛋白的含量和功能狀態(tài)之間的平衡是細(xì)胞調(diào)控凋亡的重要機(jī)制，當(dāng)Bcl-2的含量高于Bax時(shí)，抑制了細(xì)胞的凋亡;而當(dāng)Bax的含量高從而形成Bax同源二聚體時(shí)，則細(xì)胞趨于凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠Bcl-2的表達(dá)水平比對(duì)照組顯著降低，而B(niǎo)ax的表達(dá)水平卻明顯升高，這時(shí)形成Bax同源二聚體，加速肝細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)肝臟的損傷。而中藥治療組和陽(yáng)性對(duì)照組的Bcl-2、Bax水平和對(duì)照組相比差別不具有顯著性，提示五田保肝液主要是通過(guò)提高Bcl-2的表達(dá)，降低Bax的表達(dá)來(lái)抑制肝細(xì)胞的凋

13、亡，起到保肝作用。Caspase家族成員到目前為止已區(qū)分了14種，根據(jù)它們假定的功能和同源順序，Caspase通常被分為3組：凋亡啟動(dòng)因子、凋亡執(zhí)行因子和炎性介導(dǎo)因子。凋亡執(zhí)行因子包括Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7。尤其是Caspase-3在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中發(fā)揮重要作用6。本研究另外發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠Caspase-3的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，因此可得出結(jié)論Caspase-3的表達(dá)升高也是酒精造成大鼠肝細(xì)胞凋亡的另外一個(gè)分子機(jī)制。而中藥治療組和陽(yáng)性對(duì)照組Caspase-3的表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差別，說(shuō)明五田保肝液可以通過(guò)抑制Caspase-3的上調(diào)而起到抑制肝細(xì)胞凋亡的

14、效果。但是，凋亡的調(diào)節(jié)是極其復(fù)雜的。新近研究證明，Bcl-2可通過(guò)阻止Caspase-3的激活而降低細(xì)胞凋亡的發(fā)生，一旦Caspase-3被激活，Bcl-2蛋白將被Caspase-3酶解成較短的22kDa的片段，其功能發(fā)生了根本轉(zhuǎn)變，抑制凋亡轉(zhuǎn)換為觸發(fā)凋亡7。由此可發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族和Caspase家族在調(diào)節(jié)凋亡上的作用是密切相關(guān)的。長(zhǎng)期臨床應(yīng)用顯示了五田保肝液有良好的降酶、降脂等治療作用，觀察各類脂肪肝128例，4周后結(jié)果顯示其中64例為觀察組總有效率為95.31%(P0.01)，肝功能、血脂等血生化指標(biāo)明顯改善(P0.05,0.01),臨床癥狀如肝區(qū)隱痛、乏力、腹脹等改善率好于對(duì)照組(P0

15、.05)。通過(guò)“清肝化濕、分化通經(jīng)、解毒祛瘀”來(lái)實(shí)現(xiàn)保肝作用8。經(jīng)過(guò)我們的研究結(jié)果表明，五田保肝液對(duì)酒精誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用機(jī)制是復(fù)雜的，對(duì)Bcl-2家族和Caspase-3的表達(dá)均發(fā)揮了一定作用，一方面通過(guò)促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)和下調(diào)Bax的表達(dá)，提高Bcl-2/Bax的比率而發(fā)揮抗凋亡，進(jìn)而保肝的功效，另一方面，Bcl-2的表達(dá)提高也阻止了Caspase-3的進(jìn)一步激活，而Caspase-3的激活減少也反過(guò)來(lái)使Bcl-2的降解減少，這樣一個(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)最終使五田保肝液更有效地發(fā)揮抗肝細(xì)胞凋亡和保肝的功效?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1陳宏輝,張明亮,陽(yáng)學(xué)風(fēng),等.骨調(diào)素對(duì)巨噬細(xì)胞在酒精性肝纖維化肝組織

16、局部浸潤(rùn)的影響J.肝臟, 2004, 9(4): 244.2吳曉楓,呂東霞.酒精性肝病的中西醫(yī)治療現(xiàn)狀J.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生,2008, 46 (12):41.3Lieber CS. Microsomalethanol-oxidizing system(MEOX):the first 30years(1968-1998)-an eviewJ. Aleohol ClinExp Res，1999，23:991.4Setwart S, Jones D, Day CP. Alcoholic liver disease: mechanisms and preventative StrategiesJ. Tre

17、nds Mol MED,2001,7(9):408.5Klemm K, Eipel C, Cantr D,et al. Multiple doses of erythropoietin impair liver regeneration by increasing TNF-alpha, the Bax to Bcl-xL ratio and apoptotic cell deathJ.PLoS One,2008;3(12):e3924.6Watanabe M, Kitano T, Kondo T, et al. Increase of nuclear ceramide through casp