DNA遺傳標(biāo)記教學(xué)內(nèi)容

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。DNA遺傳標(biāo)記-DNA遺傳標(biāo)記特點(diǎn)：1.直接反映基因特征，非推測(cè)。2.基因座位數(shù)量多，無(wú)論表達(dá)與否。3.多態(tài)性程度高，等位基因多，鑒別能力強(qiáng)。4.適合于陳舊的樣品，檢測(cè)能力強(qiáng)。5.靈敏度高，有利于微量樣品的檢測(cè)。6.易于檢測(cè)手段的自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化，重復(fù)性好。逐漸取代了蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)方法。DNA基礎(chǔ)DNA結(jié)構(gòu)與特征DNA分子結(jié)構(gòu)線性大分子-基本單位為脫氧核苷酸組成-堿基、脫氧核糖、磷酸差別-堿基：嘌呤堿腺嘌呤（A）與鳥(niǎo)嘌呤（G）。嘧啶堿胞嘧啶（C）與胸腺嘧啶（T）。結(jié)構(gòu)：堿基+脫氧核糖=脫氧核苷-+磷酸=

2、脫氧核苷酸DNA理化性質(zhì)DNA的變性變性（denaturation）:在一定條件下，DNA雙鏈間氫鍵斷裂，形成單鏈結(jié)構(gòu)的過(guò)程。也稱退火（annealing）。條件：A：溫度上升-Tm值(meltingtemperature)50%DNA分子解鏈的溫度。與GC/TA比值有關(guān)。1%GC-0.4。B：堿性升高-0.5NNaOH-完全解鏈。DNA的復(fù)性復(fù)性（renaturation）撤除變性條件后，變性的單鏈DNA根據(jù)堿基互補(bǔ)的原則，恢復(fù)成DNA雙鏈的過(guò)程。條件：A：溫度降低過(guò)低易錯(cuò)配。過(guò)高不易復(fù)性。B：高離子強(qiáng)度。DNA分子雜交雜交（hybridization）：來(lái)源不同的兩條DNA單鏈根據(jù)堿基互補(bǔ)

3、的原則，形成雙鏈雜種DNA的過(guò)程。基因基因與基因組基因（gene）：合成有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA所需的全部核苷酸序列。基因組（genome）:一個(gè)生物體的所有基因。核基因組：細(xì)胞核中23對(duì)染色體包含的所有基因。線粒體基因組：線粒體DNA中的所有基因?；蚪Y(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)基因：能夠編碼產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因。外顯子（exon）：編碼序列。內(nèi)含子(intron)：非編碼序列（間隔序列）。如珠蛋白-1700堿基（bp），編碼146個(gè)氨基酸，3個(gè)外顯子，2個(gè)內(nèi)含子?；蛲蛔兺蛔儯╩utation）：DNA分子中的核苷酸序列的改變。1）點(diǎn)突變（pointmutation）：?jiǎn)螇A基置換。同義突變（samesen

4、semutation）:簡(jiǎn)并密碼，無(wú)突變效應(yīng)。錯(cuò)義突變(missensemutation)：新密碼子，氨基酸序列變化，產(chǎn)生突變效應(yīng)。無(wú)義突變(non-sensemutation)：變成終止密碼，合成不完整多肽，產(chǎn)生突變效應(yīng)。終止密碼突變（terminatorcodonmutation)：合成過(guò)長(zhǎng)的多肽，產(chǎn)生突變效應(yīng)。移碼突變（frame-shiftmutation)：DNA鏈中插入1個(gè)或幾個(gè)單堿對(duì)，使突變處以下部位密碼發(fā)生變化，使合成的氨基酸種類或序列變化，產(chǎn)生突變效應(yīng)。2）片段突變：DNA鏈中小片段單堿序列發(fā)生缺失、重復(fù)或重排，產(chǎn)生突變效應(yīng)。DNA多態(tài)性的分類長(zhǎng)度多態(tài)性：等位基因片段長(zhǎng)度的個(gè)

5、體差別。由一特定序列，首尾相連串聯(lián)重復(fù)次數(shù)不同產(chǎn)生的個(gè)體差別。可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)（variablenumberoftandemrepeat,VNTR）短串聯(lián)重復(fù)(shorttandemrepeat,STR)A：產(chǎn)生原因：DNA滑動(dòng)與同源染色體不等交換。B：差別：VNTRSTR重復(fù)序列組成2-7bp7-數(shù)十bp重復(fù)序列數(shù)目2-10數(shù)個(gè)10數(shù)個(gè)-數(shù)百個(gè)鑒別能力高極高優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增現(xiàn)象不明顯極明顯檢測(cè)靈敏度極高稍差片段總長(zhǎng)度200-500bp數(shù)千以上bpC：STR的命名：非編碼區(qū)-D3S1358D3第三號(hào)染色體S單拷貝（singlecopy）VNTR序列的發(fā)現(xiàn)序號(hào)編碼區(qū)內(nèi)含子-HumHPRTB次黃嘌呤磷酸核

6、糖轉(zhuǎn)移酶基因（hypoxanthinephosphoribosyltransferase）序列多態(tài)性：DNA片段堿基排列順序的個(gè)體差別。單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism,SNPs）原因：堿基的置換、插入、缺失。特點(diǎn)：多位于非編碼區(qū)，選擇壓力。數(shù)量多，1/1000bp，300萬(wàn)二態(tài)性，2個(gè)等位基因，多態(tài)性程度較低。孤立事件，人類遺傳學(xué)意義大。第二部分DNA置備核心與關(guān)鍵腦肺肌肉腎6pg/細(xì)胞理想DNA樣品的要求純度-RNA、蛋白質(zhì)、多糖、脂類。完整性-DNA大分子。DNA量。g/指紋圖；ng/PCR；pg/PCR經(jīng)典DNA提取法在弱堿和螯合劑的條件下行組織

7、勻漿，溶解胞、核膜。去垢劑與蛋白酶消化蛋白，分離DNA。有機(jī)溶劑去除蛋白，萃取DNA。乙醇與鹽類沉淀DNA。試劑的使用原理弱堿和螯合劑：Tris-HClpH8.0，DNA分子穩(wěn)定。EDTA（乙二胺四乙酸）-抑制核酸酶。通過(guò)螯合鎂離子。去垢劑與蛋白酶：SDS（十二烷基磺酸鈉）增加膜通透性；促進(jìn)DNA與蛋白質(zhì)分解；促使核酸酶與蛋白質(zhì)變性。蛋白酶K，酶解組蛋白。有機(jī)溶劑：酚-變性沉淀蛋白質(zhì)，組蛋白、蛋白酶等。PH6.0，需Tris-HClpH8.0平衡。氯仿-變性沉淀蛋白質(zhì)，除酚，水相分離。異戊醇-除酚，除泡沫。乙醇與鹽類：DNA不溶于乙醇與鹽類?；静襟E樣品處理-分離細(xì)胞，低滲鹽水或細(xì)胞懸浮液。1

8、0mmol/LTris-HClpH8.0,0.1mol/LEDTA,20mg/ml胰RNA酶,0.5%SDS.消化-TNE（15mmol/LTris-HClpH8.0,15mmol/LEDTA,5mmol/LNaCl）4ml，10%SDS0.45ml，10mg/ml蛋白酶K（終濃度，100g/ml），混勻，503h，45過(guò)夜。DNA提取-等體積飽和酚-等體積飽和酚/氯仿/異戊醇（25/24/1）-氯仿/異戊醇（24/1）。500r/min,10min.沉淀DNA-1/10體積3mol/LNaAc，2倍無(wú)水乙醇-70%乙醇。室溫?fù)]干。溶解DNA-適量TE（10mmol/LTris-HClpH8.

9、0,1mmol/LEDTA,長(zhǎng)時(shí)間。五、其他方法1.Chelex-100提取DNA基本成分：含有亞氨基二乙酸鹽離子的苯乙烯-二乙基苯共聚物?；痉椒ǎ撼恋砑?xì)胞；5%試劑200l；560.5h以上；1008min；劇烈震蕩；離心上清。注意：離心徹底。2.硅珠法提取DNA基本成分：GuSCN（硫氰酸胍，蛋白變性劑）與二氧化硅（硅珠，核酸吸附劑）?；痉椒ǎ貉海?-4l）TES（100l）SDS（20l）煮沸5min；300lGuSCN溶液與20l硅珠液保溫15min；離心；離心加GuSCN溶液；離心加乙醇漂洗；TES5610min離心取上清。3.直接煮沸法，10010min六.注意事項(xiàng)如消化不完

10、全，可用TNE溶解后再重提。消化時(shí)間宜長(zhǎng)不宜短。操作輕柔?；靹蛞浞?。揮干不宜過(guò)度。七.不同生物性檢材的DNA制備1.混合斑二步提取法（精液與陰道液）原理：精子細(xì)胞膜富含硫醇蛋白，包裹DNA的魚(yú)精蛋白富含半光氨酸，二硫鍵豐富，可抵抗蛋白酶作用。二硫蘇糖醇（DTT）可還原二硫鍵，使蛋白酶發(fā)生作用。方法；（1）分離細(xì)胞成分。（2）常規(guī)消化。（3）加10%SDS40l，1mol/LDTT16l，10g/l蛋白酶K4l，37過(guò)夜。（4）常規(guī)處理。2.八.DNA定量1.凝膠電泳半定量分析法標(biāo)準(zhǔn)參照分析。2.分光光度計(jì)分析原理：核酸于260nm波長(zhǎng)為吸收峰，1OD值為50g/l雙鏈核酸（40g/l單鏈核酸

11、），根據(jù)OD值可計(jì)算DNA含量。蛋白于280nm波長(zhǎng)為吸收峰，260/280比檢測(cè)核酸純度。1.6-1.8九.DNA純化第三部分聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）在模板DNA和4種脫氧核苷酸存在的條件下，由一對(duì)特異性引物限定的靶DNA片段，經(jīng)DNA聚合酶催化的體外合成過(guò)程。PCR的基本過(guò)程1.變性（denaturation）:在加熱的條件下（94左右），模板DNA配對(duì)堿基間氫鍵斷裂，DNA雙鏈變成單鏈。2.退火（annealing）：在降溫的條件下（55-62），引物與其互補(bǔ)的模板DNA結(jié)合形成雜交雙鏈。3.延伸（extension）：在

12、合適的溫度下（68-72），經(jīng)DNA聚合酶催化4種脫氧核苷酸，由引物的3端為起始點(diǎn)，從5向3端延伸，合成新的與模板DNA互補(bǔ)的DNA鏈。每反應(yīng)一個(gè)循環(huán)，靶DNA片段數(shù)量增加一倍，并以指數(shù)的量堆積，經(jīng)30余次循環(huán)，產(chǎn)物量可達(dá)到2105-7個(gè)拷貝。幾個(gè)循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板。二、PCR反應(yīng)的體系標(biāo)準(zhǔn)體系為50-100l，常用20l。DNA模板/DNA聚合酶/一對(duì)引物/4種脫氧核苷酸/緩沖液。反應(yīng)條件：954-5min,9430s,55-6230s,7230-60s,30循環(huán)后725-10min。三、試劑的要求：1.引物：人工合成的單鏈DNA。A：長(zhǎng)度15-30bp。Ln=2(G+C)+(A+T)1

13、000極強(qiáng)有力支持法醫(yī)學(xué)專業(yè)碩士研究生面試題（專業(yè)筆試部分）1.闡述從事法醫(yī)學(xué)專業(yè)工作應(yīng)具備的基本素質(zhì)。2.從事法醫(yī)學(xué)鑒定應(yīng)遵守的基本原則是什么。3.法醫(yī)學(xué)工作的基本內(nèi)容有那些。4.你認(rèn)為法醫(yī)學(xué)“死因鑒定”還存在哪些問(wèn)題。在法醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域還有哪些亟待解決的課題。法醫(yī)鑒定學(xué)一、概述（一）法醫(yī)鑒定學(xué)的概念1.法醫(yī)鑒定學(xué)的定義法醫(yī)鑒定學(xué)是為司法機(jī)關(guān)客觀準(zhǔn)確的判斷案情提供客觀依據(jù)，應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)理論與技術(shù)研究法醫(yī)學(xué)鑒定的原理、方法與程序的學(xué)科。在定義中包含以下內(nèi)容：（1）目的：為司法機(jī)關(guān)客觀準(zhǔn)確的判斷案情提供客觀依據(jù)，重要的在于提供客觀依據(jù)，通過(guò)“鑒定書(shū)”等形式，只有“依據(jù)”是客觀、科學(xué)、準(zhǔn)確的，才能保

14、證判斷案情的客觀、準(zhǔn)確。使我國(guó)社會(huì)主義法制服務(wù)得到健全與鞏固。（2）方法：現(xiàn)代科學(xué)理論與技術(shù)，研究的是理論與方法，但涉及的理論與技術(shù)學(xué)科廣與新：自然科學(xué)（生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等）與社會(huì)科學(xué)（法律、邏輯、倫理）無(wú)所不及；最新的成果（如分子生物學(xué)技術(shù)）不斷的應(yīng)用。（3）研究?jī)?nèi)容：法醫(yī)學(xué)的鑒定原理、鑒定方法、鑒定程序。保證鑒定結(jié)論客觀、準(zhǔn)確、科學(xué)、合法。2.鑒定及特性鑒定的字義解釋：“鑒”為審視、審查、檢測(cè)、檢驗(yàn)、分析、鑒別等，是一個(gè)過(guò)程?！岸ā睘檎J(rèn)定、判定、確定、斷定等，為得出結(jié)論。“鑒定”一般指受聘的專業(yè)人員應(yīng)用掌握的專業(yè)知識(shí)通過(guò)對(duì)某客體檢測(cè)、分析，就專門(mén)性問(wèn)題作出判斷的過(guò)程。一般特征有：（1）普遍適用

15、性：需要鑒定的專門(mén)性問(wèn)題多，從古到今，增多趨勢(shì)明顯。必須鑒定。（2）科學(xué)客觀性：科學(xué)性應(yīng)為專家利用專業(yè)知識(shí)?？陀^性鑒定人與事件必須無(wú)關(guān)。（3）程序規(guī)范性：必須符合特定的程序，保證發(fā)揮社會(huì)效應(yīng)。否則非鑒定。3.法醫(yī)學(xué)鑒定法醫(yī)學(xué)鑒定是要解決法律實(shí)踐中有關(guān)醫(yī)學(xué)問(wèn)題的鑒定，隨著我國(guó)社會(huì)主義法制建設(shè)的不斷完善與改革開(kāi)放與國(guó)際接軌形勢(shì)的要求，法醫(yī)學(xué)鑒定的內(nèi)容、數(shù)量、質(zhì)量、時(shí)限等要求越來(lái)越高。法醫(yī)學(xué)鑒定自身特點(diǎn)：（1）法律法規(guī)依據(jù)：刑事訴訟法、民事訴訟法、行政訴訟法等有指派鑒定的相應(yīng)規(guī)定，其他法律法規(guī)也有相應(yīng)規(guī)定（如醫(yī)療事故處理?xiàng)l理）。（2）是訴訟或調(diào)查的程序之一，符合訴訟法或部門(mén)法相關(guān)規(guī)定。（3）法醫(yī)學(xué)鑒

16、定結(jié)論是具有證據(jù)效力的法定證據(jù)之一。（二）法醫(yī)鑒定學(xué)的任務(wù)1.科學(xué)完善法醫(yī)學(xué)鑒定理論法醫(yī)學(xué)鑒定涉及范圍廣，人體極其復(fù)雜，科學(xué)處于發(fā)展過(guò)程中。應(yīng)系統(tǒng)鑒定理論。處理好表里、因果等關(guān)系，科學(xué)準(zhǔn)確的得出結(jié)論。2.將最新的科技手段引入法醫(yī)學(xué)鑒定領(lǐng)域，規(guī)范方法，保證結(jié)果客觀。并提高鑒定水平與質(zhì)量。提高案件處理率。3.完善法醫(yī)學(xué)鑒定程序，提高鑒定結(jié)論的證據(jù)效率（四）法醫(yī)鑒定學(xué)的歷史與發(fā)展司法體制的建立順應(yīng)社會(huì)發(fā)展的需要，各級(jí)官員為行政人員，必須有相關(guān)的專業(yè)人員配合以保證提供處理案件作為依據(jù)的證據(jù)的準(zhǔn)確。禮記。月令記載“命理瞻傷，察創(chuàng)，視折，審斷，決獄訟必端平”?！袄怼睘榉ㄡt(yī)檢驗(yàn)與鑒定的官員，并反映出檢驗(yàn)與鑒

17、定是正確處理案件的必備程序。南宋（1247年）洗冤集錄（宋慈）內(nèi)容包括“檢覆總說(shuō)、疑難雜說(shuō)、初檢、復(fù)檢、驗(yàn)尸、驗(yàn)骨、自縊、溺死、殺傷、火死、服毒、跌死、雷震死、蛇蟲(chóng)傷死”等53個(gè)檢驗(yàn)項(xiàng)目。是世界上第一部系統(tǒng)全面的法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)鑒定古典巨著。秦朝既有“手足痕跡”檢驗(yàn)用于偵破有關(guān)案件的記載（封診式關(guān)于盜墓偵破記載）中國(guó)歷史上“指紋”的應(yīng)用?！暗窝ü牵?yàn)親”方法的開(kāi)發(fā)應(yīng)用等。近代，1562年法國(guó)醫(yī)生巴雷經(jīng)尸體解剖作出“升汞中毒”的結(jié)論。二、法醫(yī)學(xué)鑒定體制（一）法醫(yī)學(xué)鑒定機(jī)構(gòu)（二）鑒定權(quán)1.鑒定決定權(quán)2.鑒定執(zhí)行權(quán)3.鑒定管理權(quán)（三）法醫(yī)學(xué)鑒定人1.法醫(yī)鑒定人及地位2.法醫(yī)鑒定人的條件與資格3.法醫(yī)鑒定

18、人的權(quán)利4.法醫(yī)鑒定人的義務(wù)（1）按時(shí)完成鑒定任務(wù)，時(shí)限的要求，特殊情況應(yīng)向委托機(jī)關(guān)申請(qǐng)延期。（2）按鑒定要求出具鑒定書(shū)，標(biāo)準(zhǔn)格式，簽名以示負(fù)責(zé)。（3）依法申請(qǐng)回避，當(dāng)事人、其他訟訴成員、有親屬或利害關(guān)系者。（4）根據(jù)要求按時(shí)出庭舉證，并接受相關(guān)人員質(zhì)證，有正當(dāng)理由經(jīng)審判長(zhǎng)批準(zhǔn)可不出。（5）對(duì)違反法律的行為應(yīng)承擔(dān)法律責(zé)任。（四）鑒定形式的分類1.初次鑒定2.補(bǔ)充鑒定由原鑒定部門(mén)對(duì)已經(jīng)得出的鑒定結(jié)論進(jìn)行補(bǔ)充。（1）有新的材料與案情。（2）有新的鑒定要求。（3）原鑒定書(shū)表述不確切或不完全。3.從新鑒定對(duì)以有鑒定結(jié)論有疑義而委托新的鑒定單位對(duì)同樣的專門(mén)性問(wèn)題進(jìn)行鑒定。4.聯(lián)合鑒定對(duì)爭(zhēng)議較大的出現(xiàn)不同結(jié)論的（或疑難的）案件，由鑒定部門(mén)聘請(qǐng)有權(quán)威的專家（不同部門(mén)）進(jìn)行的鑒定。意見(jiàn)不同可分別出具鑒定書(shū)。三、法醫(yī)學(xué)鑒定程序（一）現(xiàn)場(chǎng)勘驗(yàn)與樣品的收集（二）鑒定的委托1.鑒定的決定案件涉及到專門(mén)性問(wèn)題時(shí)，案件處理涉及到定性與定量的問(wèn)題，應(yīng)提請(qǐng)鑒定。2.鑒定項(xiàng)目的提出（1）鑒定項(xiàng)目是法律規(guī)定必須解決的專門(mén)問(wèn)題。（2）鑒定項(xiàng)目是目前的科學(xué)技術(shù)能夠解決的問(wèn)題。（3）送檢材料必須符合鑒定要求。3.鑒定機(jī)構(gòu)與鑒定人的選擇（1）鑒定人的資格。（2）鑒定人的