病原微生物及免疫學(xué)融合實驗：感染性休克四 炎性因子的檢測

1、實驗4炎性因子的檢測ELISA檢測的原理 ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實際應(yīng)用中，通過不同的設(shè)計，具體的方法步驟可有多種。1.IL-12p70檢測：(1)使用前，將所有試劑充分混勻，避免產(chǎn)生泡沫。(2)根據(jù)實驗孔（空白和標(biāo)準(zhǔn)品）數(shù)量，確定所需的板條數(shù)目。樣品（含標(biāo)準(zhǔn)品）和空白都應(yīng)做復(fù)孔。(3)加樣：100uL/well加入稀釋后的Cytokine sta

2、ndard至標(biāo)準(zhǔn)品孔，100uL/well加入樣品至樣品孔，設(shè)置空白孔，用Dilution bufferR（1）代替樣品和標(biāo)準(zhǔn)品。ELISA檢測的方法(4)加檢測抗體：50uL/well加入稀釋后的Biotinylated antibody?；靹蚝螅w上封口膜，37溫育90min。(5)洗板：扣去孔內(nèi)液體，300uL/well加入1washing buffer；停留1min后棄去孔內(nèi)液體。重復(fù)4次，每一次在濾紙上扣干。(6)加酶：100uL/well加入稀釋后的Streptavidin-HRP。蓋上封板膜，37溫育30min。(7)洗板：重復(fù)步驟5。(8)顯色：100uL/well加入TMB，

3、37避光溫育5-30min之間，根據(jù)孔內(nèi)顏色的深淺（深藍色）來判定終止反應(yīng)。通常顯色在10-20min。(9)終止反應(yīng)：100uL/well迅速加入Stop solution終止反應(yīng)。終止后10min內(nèi)，用檢測波長（measure wavelengh）450nm讀值。推薦用雙波長即檢測波長450nm、參考波長或校正波長610-630nm同時讀板，測量結(jié)果會更準(zhǔn)確。8、結(jié)果分析：1.有兩種設(shè)定空白對照的方案：1）將TMB空白顯色孔設(shè)為對照。所有的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光值減去空白孔的吸光值后，在坐標(biāo)紙上畫出曲線，以吸光值作為縱坐標(biāo)，以濃度作為橫坐標(biāo)。2）將零孔設(shè)為對照。得到的數(shù)據(jù)可以直接在坐標(biāo)紙上畫出曲線。2.根據(jù)樣品的吸光值在坐標(biāo)上找出對應(yīng)的濃度。用戶也可以使