第4章植物細胞培養(yǎng)

1、第4章植物細胞培養(yǎng)第四章 植物細胞培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)（plant cell culture）： 指對植物器官或愈傷組織上分離出來的單細胞(或小細胞團)進行培養(yǎng)，形成單細無性系或再生植物的技術(shù)。優(yōu)點：操作簡便、重復(fù)性好、群體大等。分類：1.根據(jù)規(guī)模：小規(guī)模培養(yǎng)、大批量培養(yǎng)2.根據(jù)培養(yǎng)方式：懸浮培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、看護培養(yǎng)、紙橋培養(yǎng)法3.根據(jù)要求的產(chǎn)物：誘變的細胞培養(yǎng)、生產(chǎn)次生產(chǎn)物的細胞培養(yǎng)引 言第四章 植物細胞培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)需要解決的問題（1）氧和二氧化碳的控制，過多氧過少氧均不利于生長；（2）營養(yǎng)物的供應(yīng)；（3）細胞密度過高引起細胞團聚甚至分化，培養(yǎng)過程中細胞的分化的防止，（4）細胞取得中微生物的

2、去除；植物細胞培養(yǎng)的意義：（1）研究細胞生理代謝過程及各種影響因子；（2）用于植物品種的改良；（3）用于植物次生代謝物質(zhì)的生產(chǎn)。細胞培養(yǎng)過程： 1. 擇適宜的外植體； 2. 誘導(dǎo)疏松愈傷組織； 3. 選擇適宜的培養(yǎng)基； 4. 懸浮培養(yǎng)； 5. 懸浮細胞的繼代與選擇； 6. 懸浮細胞的同步化； 7. 懸浮愈傷組織形成及植株再生。 第四章 植物細胞培養(yǎng)第一節(jié) 懸浮培養(yǎng)含義：將單個游離單細胞或小細胞團按一定密度懸浮在液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)增殖的技術(shù)。由愈傷組織液體培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展而來。第四章 植物細胞培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)特點：1、培養(yǎng)細胞可不斷增殖，且生長速度快，適于大規(guī)模培養(yǎng)及工業(yè)化生產(chǎn)有用的細胞次生代謝產(chǎn)

3、物。2、在液體培養(yǎng)基中，細胞和營養(yǎng)物質(zhì)充分接觸，細胞狀態(tài)相對保持一致。3、大規(guī)模懸浮培養(yǎng)成本較高，因為它需要配置大型搖床、轉(zhuǎn)床、連續(xù)培養(yǎng)裝置、生物反應(yīng)器、倒置顯微鏡等特殊設(shè)備。分批培養(yǎng)（Batch culture）分批培養(yǎng)含義： 分批培養(yǎng)是在一個封閉的系統(tǒng)中進行細胞培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)物增加到一定量時，需繼代培養(yǎng)，即取出少量培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)液中。特點 培養(yǎng)基體積固定 培養(yǎng)過程中，細胞生長，其數(shù)目 不斷發(fā)生變化，呈S增長。繼代的方法和最佳時期繼代方法： 用注射器或移管吸取一定量的含單細胞和小細胞團的懸浮培養(yǎng)物，并移到含有新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶里，繼續(xù)進行培養(yǎng)。繼代細胞生長曲線在整個培養(yǎng)過程中，細胞數(shù)目不

4、斷發(fā)生變化，呈現(xiàn)出明顯的由慢到快，再到慢，最后增長停止的細胞周期。細胞的生長呈S型曲線最佳繼代時期滯后期對數(shù)生長期直線生長期緩慢期靜止期培養(yǎng)時間培養(yǎng)細胞數(shù)目1234512345細胞生長各個時期的特點：緩慢期滯后期（延遲期） 細胞很少分裂，其長短與接種量大小和繼代時原種細胞所處的生長期有關(guān)對數(shù)生長期細胞分裂活躍，細胞數(shù)目增加，增長速率保持不變直線生長期細胞生長和發(fā)育最明顯的時期生長逐漸緩慢：培養(yǎng)液消耗將盡，有毒代謝物質(zhì)增多，氧氣減少靜止期生長幾乎處于停止?fàn)顟B(tài)，細胞數(shù)目增加極少，甚至開始死亡。討論 （1）滯后期的長短主要取決于在繼代時原種培養(yǎng)細胞所處的生長期和轉(zhuǎn)入細胞數(shù)量的多少。（2）加入條件培養(yǎng)

5、基可以縮短滯后期。 條件培養(yǎng)基：曾培養(yǎng)過一段時間組織或細胞的培養(yǎng)基。（3）縮短兩次繼代時間間隔，則可使懸浮培養(yǎng)的細胞一直保持對數(shù)生長期。（4）如果使處在靜止期的細胞懸浮液保持時間太長，則會引起細胞的大量死亡和解體。操作注意事項： 對懸浮培養(yǎng)細胞繼代時，進液口的孔徑要小，只能通過單細胞或小細胞團，使用吸管或注射器。 繼代前，培養(yǎng)容器靜置短時間，大細胞團沉降，再吸上層懸浮液。可建立良好的細胞懸浮培養(yǎng)物。連續(xù)培養(yǎng)(Continuous culture): 是用一定容積的非密閉系統(tǒng)進行細胞培養(yǎng)的方法，在培養(yǎng)過程中不斷注入新鮮培養(yǎng)基，而使?fàn)I養(yǎng)物連續(xù)得到補充，細胞生長和增殖連續(xù)進行，同時有等體積的培養(yǎng)物排

6、除系統(tǒng)。連續(xù)培養(yǎng)（Continuous culture）加入培養(yǎng)基排出培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物 二者體積相等分：開放式連續(xù)培養(yǎng) 封閉式連續(xù)培養(yǎng)開放式和封閉式區(qū)別封閉式：排出液中的細胞用機械方法收集后，又放入原培養(yǎng)基，所以其培養(yǎng)細胞數(shù)目不斷增加。開放式：在注入新鮮培養(yǎng)基的同時，培養(yǎng)細胞隨同培養(yǎng)液一起流出，培養(yǎng)細胞數(shù)目保持恒定。連續(xù)培養(yǎng)意義：1、植物細胞代謝調(diào)節(jié)的研究。2、次生物質(zhì)的大量生產(chǎn)。第四章 植物細胞培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)的特性（1）植物細胞較微生物細胞大得多，有纖維素細胞壁。（2）培養(yǎng)過程生長速度緩慢，易受微生物污染，需用抗生素；（3）細胞生長的中期及對數(shù)期易凝聚為團塊，不能象微生物一樣均勻分散，懸浮

7、培養(yǎng)較難；第四章 植物細胞培養(yǎng)（4）培養(yǎng)時需供氧。（5）細胞培養(yǎng)過程有結(jié)構(gòu)與功能全能性,因而易分化。（6）懸浮培養(yǎng)中要求有一定的細胞濃度，否則不生長（25000-50000個/ML）。第四章 植物細胞培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)步驟一、愈傷組織誘導(dǎo)二、懸浮系的建立與繼代培養(yǎng)三、懸浮細胞的生長動態(tài)四、懸浮培養(yǎng)細胞的同步化細胞的懸浮培養(yǎng)(cell suspension culture) 是指將游離的植物細胞按一定的細胞密度，懸浮在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的方法。1、起始懸浮液的制備愈傷組織液體培養(yǎng)基搖床振蕩懸浮培養(yǎng)質(zhì)地疏松，細胞分散程度大；質(zhì)地緊密，細胞分散程度小，不適于懸浮培養(yǎng)轉(zhuǎn)速30-150rpm防細胞破裂第四章

8、 植物細胞培養(yǎng)一、懸浮培養(yǎng)中起始物的建立選擇適宜的外植體：幼胚、下胚軸、子葉。選擇適宜的培養(yǎng)基：較高濃度；必要的附加物質(zhì)。愈傷組織的要求：松散性好，增殖快，再生性強。第四章 植物細胞培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細胞團較??；均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同；細胞生長迅速，懸浮細胞的生長量一般2-3天增加1倍。二、懸浮系的建立與繼代第四章 植物細胞培養(yǎng)四、懸浮培養(yǎng)細胞的同步化細胞同步化是指同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細胞都同時通過細胞周期的某一特定時期。方法：分選法 梯度離心、過濾饑餓法 N、P同時饑餓處理一種海藻50 h，有二分之一的細胞處于G1期。加入DNA合成抑制劑，如5-氨基尿嘧啶。細胞不

9、能合成DNA，處于G1和S期。低溫處理 - 4 DNA合成受阻，細胞趨向G1期五、影響細胞懸浮培養(yǎng)的因素1、基本培養(yǎng)基的組成（1）氮 硝酸鹽是最常用的氮源。（2）磷 植物細胞能以各種方式吸收磷，其濃度是細胞分裂和生長的限制因子。（3）硫 硫的缺失使所有蛋白質(zhì)合成自動停止。2、有機成分 氨基酸類、維生素類3、碳源 碳水化合物，二氧化碳4、植物激素 生長素，細胞分裂素，乙烯5、PH及滲透壓，培養(yǎng)基成分、振蕩頻率第四章 植物細胞培養(yǎng)第二節(jié) 單細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)主要包括三個方面：一為花藥培養(yǎng)；二為小孢子培養(yǎng)；三為末受精的子房和卵細胞培養(yǎng)。第四章 植物細胞培養(yǎng)第二節(jié) 單細胞培養(yǎng)誘發(fā)植物產(chǎn)生單倍體主要

10、有四種方法：1、種間和屬間雜交2、物理照射和化學(xué)誘變3、花藥和花粉培養(yǎng)?？僧a(chǎn)生單倍體胚，或者先誘導(dǎo)單體愈傷組織再經(jīng)適當(dāng)途徑產(chǎn)生單倍體植株。第四章 植物細胞培養(yǎng)第二節(jié) 單細胞培養(yǎng)單細胞培養(yǎng)方法：對分離得到的單個細胞進行培養(yǎng)，誘導(dǎo)其分裂增殖，形成細胞團，再通過細胞分化形成芽、根等器官或胚狀體，直到長成完整植株的技術(shù)。細胞平板培養(yǎng)看護培養(yǎng)微室培養(yǎng)紙橋培養(yǎng)法植物單細胞培養(yǎng)方法：（一）平板培養(yǎng)法分散的植物細胞接種于含薄層固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)過程稱為平板培養(yǎng)法。優(yōu)點：單細胞在培養(yǎng)基中分布均勻，便于在顯微鏡下對細胞進行定點觀察。由于它具有篩選效率高、操作簡便等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于細胞分裂、分化、生理生化

11、、遺傳變異、次生代謝產(chǎn)物合成等。缺點：通氣狀況不好，排泄物質(zhì)易積累造成毒害或影響組織吸收。第四章 植物細胞培養(yǎng)（二）看護培養(yǎng)Muir(1953)首創(chuàng)此法獲得煙草單細胞體系。優(yōu)點：簡便易行，效果好。缺點：不能在顯微鏡下追蹤細胞分裂、生長過程。指利用生長的愈傷組織所產(chǎn)生的物質(zhì)來培養(yǎng)單細胞或者異種愈傷組織等的方法第四章 植物細胞培養(yǎng)三、微室培養(yǎng)在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細胞液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細胞團的方法。優(yōu)點：可對培養(yǎng)細胞連續(xù)進行顯微觀察，了解一個細胞的生長、分裂、分化等過程。缺點：培養(yǎng)基少，營養(yǎng)和水分難以保持，PH變動幅度大，培養(yǎng)細胞僅能短期分裂。四、紙橋培養(yǎng)法 將濾紙

12、的兩端浸入液體培養(yǎng)基中，使濾紙中間部分露出培養(yǎng)基表面，將所要培養(yǎng)的細胞放在濾紙的表面上培養(yǎng)。單細胞液體培養(yǎng)基濾紙單細胞的分離由完整的植物器官分離單細胞由培養(yǎng)組織（如愈傷組織）中分離單細胞1、由完整的植物器官分離單細胞機械法酶解法葉片是分離單細胞的最好材料機械法Ball&Joshi (1965)Noggle (1967)Joshi &Ball (1968)研究者和時間：研究材料：花生成熟葉片第一種方法：用刀片刮葉片具體方法:撕去下表皮露出葉肉細胞用解剖刀刮下細胞第二種方法：葉片研碎、離心研碎成粉加研磨介質(zhì)過濾、離心 只有薄壁組織排列松散，細胞間結(jié)觸點很少時用機械法分離葉肉細胞才能取得成功。酶解法

13、Takebe等（1968）最早報道：用果膠酶處理可以分離大量的葉肉細胞加果膠酶過濾、離心機械法和酶解法比較機械法酶解法細胞不受到酶的傷害；不用質(zhì)壁分離；細胞產(chǎn)量低；細胞易破。細胞受到酶的傷害；要質(zhì)壁分離；細胞產(chǎn)量高；細胞不易破。2、由培養(yǎng)組織（愈傷組織）分離單細胞材料：胡蘿卜肉質(zhì)根步驟：1 誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織2 愈傷組織反復(fù)繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織的松散性；由愈傷組織分離單細胞的方法：1、將未分化、易散碎的愈傷組織轉(zhuǎn)到有液體培養(yǎng)基的三角瓶中進行振蕩培養(yǎng)，獲得懸浮細胞液。2、用孔徑為200um的無菌網(wǎng)過濾，4000RPM/M離心，除去比單細胞小的碎片，獲得純凈的細胞懸浮液。3、用60-1

14、00UM的網(wǎng)過濾，再用20-30UM的網(wǎng)過濾，離心除去細胞碎片。4、回收獲得的單細胞，并用液體培養(yǎng)基洗衣凈，可用于培養(yǎng)。單倍體的應(yīng)用價值：1、在植物育種中使后代迅速純合、提高選擇效率3、排除雜種優(yōu)勢對后代的影響、4、遺傳研究的良好實驗材料體系，消除致死原因5、突變體的篩選，選育新型自交系6、遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料，基因表達研究的良好材料第四章 植物細胞培養(yǎng)第三節(jié) 培養(yǎng)細胞的次生代謝及產(chǎn)物積累一、概述植物次生代謝產(chǎn)物是指植物中一大類并非植物生長發(fā)育所必需的小分子有機化合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官組織和生長發(fā)育期的特異性。植物次生代謝產(chǎn)物種類酚類化合物含氮有機化合物萜類化合物其 它醌類黃酮類簡單

15、酚類高等萜類低等萜類多炔類有機酸胺類生物堿生氰苷莨菪堿酪醇花青素紫草寧青蒿素人參皂甙AA類似物苦杏仁苷 類別 次生代謝產(chǎn)物 用途 黃酮 銀杏黃酮，大豆黃酮 治療心血管疾病 蘆丁，槲皮素 食品添加劑和化妝品 醌 胡桃醌 抗菌，鎮(zhèn)靜 紫草寧 抗菌、抗炎、抗病毒、止血 簡單酚類 香豆素 香料，抗菌消炎萜 類 紫杉醇 抗癌 青蒿素 抗瘧疾生 物 堿 長春新堿 抗癌 奎寧 抗瘧疾酚類化合物罌粟：嗎啡、可卡因鎮(zhèn)痛藥物香豆素葡萄糖磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸乙酰輔酶A甲戊二羥酸活性異戊二烯蒽醌甾類化合物萜類化合物甲瓦龍酸途徑三羧酸循環(huán)有機酸脂肪族氨基酸生物堿多酮途徑脂肪酸、環(huán)狀化合物磷酸戊酸途徑4-磷酸赤蘚糖糖酵解

16、莽草酸莽草酸途徑芳香族氨基酸黃酮生物堿第四章 植物細胞培養(yǎng)2.植物次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕化工業(yè)等領(lǐng)域具有重要意義。 李時珍（1593）在本草綱目中所開列的1892種藥物絕大多數(shù)是植物藥物，其藥物的有效成分均為次生產(chǎn)物。許多植物次生代謝產(chǎn)物是優(yōu)良的食品添加劑和名貴化妝品原料，可以用于殺蟲、殺菌，而對環(huán)境和人畜無害，是理想的環(huán)保產(chǎn)品。第四章 植物細胞培養(yǎng)3規(guī)?；毎囵B(yǎng)是生產(chǎn)植物次生產(chǎn)物的理想途徑 保護生態(tài)環(huán)境 提高生產(chǎn)效率 發(fā)展新型生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)來自于植物體和細胞培養(yǎng)的紫草寧含量比較生產(chǎn)方式生產(chǎn)周期紫草寧含量（干重）完整植株2-3年1-2植物細胞培養(yǎng)3 周14第四章 植物細胞培養(yǎng)次生代謝產(chǎn)物

17、的工業(yè)化生產(chǎn)20世紀40年代后期，首次報道銀膠菊植物組織可獲得橡膠。20世紀80年代以來，細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)有用的物質(zhì)，如藥物、食品、調(diào)料、香精、顏料等再生資源。第四章 植物細胞培養(yǎng)植物次生代謝產(chǎn)品的市場潛能產(chǎn)品成分用途年銷售額（億美元）長春花堿治療白血病18-20（美國）阿嗎靈循環(huán)系統(tǒng)障礙藥5-25（全世界）奎寧治療瘧疾5-10（美國）致熱素殺蟲劑20（全世界）毛地黃心臟病藥20-55（全世界）紫杉醇：二萜類化合物最早由太平洋紅豆杉Taxus brevifolia的樹皮中分離廣泛用于治療卵巢癌、乳腺癌、非小細胞肺癌等十幾種癌癥目前主要來源于紅豆杉屬植物紫杉醇簡介理化性質(zhì)英文名：Paclita

18、xel, Taxol or TM分子式：C47H51NO4水溶性：ml穩(wěn)定性：pH48 穩(wěn)定；pH 8 易分解；在特定條件下紫杉醇可被氧化，但極難還原；紫杉醇研發(fā)過程年 代進 展1958 NCI開始大規(guī)模植物藥研發(fā)篩選1967 發(fā)現(xiàn)紫杉醇抗癌活性1968 從紅豆杉中分離出紫杉醇1971 完成結(jié)構(gòu)鑒定1979 發(fā)表作用機制1983 臨床試驗1985 臨床II期1991 臨床III期1992 FDA批準上市NCI稱其為過去15年中開發(fā)的最好的抗癌藥物20世紀90年代抗腫瘤藥的三大成就之一湯姆森科技桂冠獎Ramesh Panchagnula, International Journal of Pha

19、rmaceutics.1998(172)1-15.市場需求抗癌一線用藥銷售額年增長率5億美元 理論需求量 2g /人, 500萬人/年 1000kg/年實際銷量350 kg/年紫杉醇供需相差十分懸殊 圖1：國際紫杉醇原料藥需求走勢圖（單位：公斤）圖2：國際紫杉醇銷售額（億美元）紫杉醇開發(fā)的關(guān)鍵問題上游產(chǎn)業(yè)藥源問題 下游制劑產(chǎn)業(yè)藥效（活性、水溶性）安全性生物相容性藥源問題紅豆杉 主要原料植物 國家一級保護野生植物，全球十大瀕危物種 之一生長緩慢 分布有限 Taxol含量低 樹皮中Taxol含量:0.00001-0.069% 3000棵樹=10噸樹皮=1kg Taxol=500病人人工栽培 尋找紅

20、豆衫的替代物 優(yōu)點：生長周期縮短 簡便、直接缺點：1、紫杉醇含量低 生長緩慢 2、提取工藝復(fù)雜藥源問題解決辦法（一）藥源問題解決辦法（二）化學(xué)合成全合成 1994年獲得成功 現(xiàn)有六種途徑半合成 以10-DAB和Baccatin 作為半合成原料獲得紫杉醇 新方法用10-DAT 缺點：1、合成過程煩瑣復(fù)雜，幾十步 2、費用高，化學(xué)試劑昂貴 3、總收率太低（2%）優(yōu)點：1、原料枝葉含量豐富、 提取相 對容易，充分利用再生資源 2、產(chǎn)率高 3、最具實用價值可以工業(yè)化生產(chǎn) 4、獲取紫杉醇構(gòu)效關(guān)系信息，進行結(jié)構(gòu)改造缺點：合成過程相對復(fù)雜 （11步化學(xué)轉(zhuǎn)化和7步分離）藥源問題解決辦法（三）生物方法組織和細胞

21、培養(yǎng)微生物發(fā)酵生物合成 研究階段 紅豆杉生物合成途徑基本明確 10種相關(guān)酶基因被克隆表達 利用基因工程手段改造紅豆杉提高紫杉醇產(chǎn)量 優(yōu)點：1、擺脫自然因素，可長期穩(wěn)定 生長 2、適應(yīng)市場、方便調(diào)節(jié) 3、成分簡單，有利于分離純化 4、成本低、生長周期短 5、為半合成提供原料 6、有望工業(yè)化生產(chǎn)缺點：1、產(chǎn)量低、不穩(wěn)定 2、工業(yè)化放大研究紅景天是景天科(Crassulaceae)紅景天屬(Rhodiola L.)植物，為多年生草本或亞灌木，常具肉質(zhì)匍匐根狀莖。我國對紅景天的應(yīng)用已有很久的歷史，在千金翼方、本草綱目、四部醫(yī)典中早有記載。高山紅景天(Rhodiola sachalinensis A.B

22、or)又名庫頁紅景天，為景天科紅景天屬（Rhodiola L.）多年生草本植物，是長白山珍稀藥用植物之一，具有增強記憶、改善心腦血管系統(tǒng)功能、增強免疫、抗疲勞、耐缺氧、抗腫瘤、降血糖、抗病毒、抗微波輻射。 以紅景天為例UTP+葡糖糖-1-磷酸UDP-葡糖糖+pi尿苷轉(zhuǎn)移酶UDP-葡糖糖+酪醇紅景天甙+UDPUDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶紅景天甙生物合成最后一步反應(yīng)機制已經(jīng)清楚，植物體內(nèi)的尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucosyltransferase，UDPGT，UGTs）以尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和酪醇為底物催化合成紅景天甙 表達量技術(shù)路線尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因生物信息學(xué)分析 基因

23、及表達特性分析基因分離功能分析構(gòu)建植物高效表達載體轉(zhuǎn)化回高山紅景天高山紅景天UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因（UGT1）的分離及特性分析高山紅景天UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因分離策略UGT1的全長cDNA序列總RNART高山紅景天愈傷組織3 RACE簡并引物5 RACE特異引物高山紅景天UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因(UGT1)的克隆3 RACE擴增結(jié)果5 RACE擴增結(jié)果cDNA全長擴增結(jié)果500bpM 11.5KbM 11.1kbM 1UGT1（accession number: AY547304)；全長1598bp，含有完整的編碼框，編碼480個氨基酸。UGT1 基因的生物信息學(xué)分析UGT1基因特性

24、分析UGT1基因的Southern blot雜交分析 2.5Kb2.0KbBamH KpnUGT1基因的Northern blot雜交分析 18S28SC L高山紅景天HPLC色譜圖 C290.8L179.7TC-轉(zhuǎn)基因愈傷；L-野生型植株葉片；TL-轉(zhuǎn)基因植株葉片；C-野生型愈傷UGT1轉(zhuǎn)化高山紅景天及基因功能分析 紅景天甙HPLC測定UGT1功能分析構(gòu)建植物高效表達載體農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化高山紅景天UGT1基因潮霉素陽性愈傷組織的分子生物學(xué)檢測PCR技術(shù)方案潮霉素陽性植株的分子生物學(xué)檢測PCRPCR-SouthernPCR-SouthernSouthernNorthern植物高效表達載體pBS

25、UGT的構(gòu)建UGT1BamH IKpn IHid+ BamHDigestionLigationBamH+KpnDigestionLigation750bpM1pBSROK酶切鑒定 1.5Kb3M42156781.6Kb3M4215678pBSUGT1酶切與PCR鑒定 高山紅景天抗性選擇標記潮霉素（Hyg）適宜濃度的確定 Hyg0潮霉素濃度為5mg/L時，外植體生長減慢，致死率達到50.17%；潮霉素濃度為10mg/L時，致死率高達93.0%；潮霉素濃度為15mg/L時，葉片全部死亡。 UGT1轉(zhuǎn)基因抗性愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化及篩選 DBCAUGT1轉(zhuǎn)基因高山紅景天植株的獲得 ABC高山紅景天轉(zhuǎn)基因

26、材料分子鑒定1.6kbM71920RCKPCK1PCR鑒定 RCKPCK720PCR-Southern鑒定 高山紅景天轉(zhuǎn)基因愈傷組織分子鑒定2.0kb1.5kbPCK1920Southern鑒定 高山紅景天轉(zhuǎn)基因植株分子鑒定1.6kbM569RCKPCK2PCR鑒定 PCR-Southern鑒定 RCKPCK29高山紅景天轉(zhuǎn)基因材料分子鑒定及轉(zhuǎn)基因高山紅景天愈傷組織紅景天甙含量的HPLC測定290.8CTC569.2TCLTLCTC-轉(zhuǎn)基因愈傷；L-野生型植株葉片；TL-轉(zhuǎn)基因植株葉片；C-野生型愈傷Northern鑒定 第四章 植物細胞培養(yǎng)高等植物提供的天然物質(zhì)、性質(zhì)及用途培養(yǎng)植物種屬產(chǎn)物組

27、 莨菪屬、蔓陀羅屬 穿心蓮屬細胞生長后期積累托品類生物堿內(nèi)酯、倍半萜類組 胡蘿卜屬快速生長期積累肉桂酸組 長春花屬 煙草屬與細胞生長平行積累長春花堿(治白血病)煙堿(殺蟲劑)組 紫草穩(wěn)定期積累紫草寧(抗癌藥)第四章 植物細胞培養(yǎng)人參工業(yè)化生產(chǎn)幼莖、葉柄進行愈傷組織培養(yǎng)（固體培養(yǎng)）擴大培養(yǎng)（液體培養(yǎng)）平板培養(yǎng)（固體培養(yǎng)）擴大培養(yǎng)（液體培養(yǎng)）大量培養(yǎng)人參皂苷提?。ǘ?、定性分析）建立細胞株選擇高產(chǎn)細胞株培養(yǎng)基：MS+0.5mg/L 2,4-D溫度：25、黑暗條件酶處理葉肉、根尖、髓組織愈傷組織轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基液體MS+0.5mg/L 2,4-D轉(zhuǎn)速80-90r/min，28光照在克氏瓶中加入10mL

28、懸浮液20-30黑暗培養(yǎng)初步鑒定液體培養(yǎng)，繼代/5周28光照，80-90r/min多次重復(fù)鑒定植物次生代謝產(chǎn)物的提取與分離純化1、細胞破碎2、提取3、沉淀分離4、層析分離5、萃取分離6、結(jié)晶7、濃縮與干燥第四章 植物細胞培養(yǎng)第四節(jié) 植物細胞的規(guī)模培養(yǎng)一、植物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)體系建立種細胞的選擇種細胞系的增殖與放大大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立第四章 植物細胞培養(yǎng)1. 種細胞的選擇外植體選擇： 植物類型、組織、器官高產(chǎn)細胞的建立：第四章 植物細胞培養(yǎng)2.種細胞系的增殖與放大培養(yǎng)目的：獲得大量的活躍生長的細胞群體，為細胞大批量生產(chǎn)準備基礎(chǔ)材料。方法：液體振蕩培養(yǎng)，從幾百毫升到幾升逐級放大。第四章 植物細胞培養(yǎng)

29、 3、植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)第四章 植物細胞培養(yǎng)半連續(xù)培養(yǎng)含義：在完成成批培養(yǎng)的一個周期后，只從反應(yīng)器中取出大部分細胞懸液，保留小部分細胞懸液作為下一培養(yǎng)周期的種細胞，然后加入新鮮培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。特點：可以節(jié)省種細胞培養(yǎng)成本，同時保留的培養(yǎng)液有利于細胞分裂啟動。但細胞同步性不是很好。第四章 植物細胞培養(yǎng)固定化培養(yǎng)細胞固定化培養(yǎng)是指將游離的細胞包埋在多糖或多聚化合物制備成的網(wǎng)狀支持物中，培養(yǎng)液呈流動狀態(tài)進行無菌培養(yǎng)的一門技術(shù)。第四章 植物細胞培養(yǎng) 細胞固定化培養(yǎng)技術(shù)按照其支持物不同可以分為兩大類： 包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽b、聚丙烯酰胺等； 附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物

30、采用尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫、中空纖維等材料。 固定化細胞生物反應(yīng)器第四章 植物細胞培養(yǎng)固定化細胞生物反應(yīng)器優(yōu)點細胞固定在支持物上，培養(yǎng)基不斷更換，可以在培養(yǎng)基中提取產(chǎn)物，免除了培養(yǎng)基中因含有過多的次生產(chǎn)物而對細胞代謝產(chǎn)生的反饋機制?？梢暂^容易地控制培養(yǎng)系統(tǒng)的理化環(huán)境，從而研究特定的代謝途徑，便于調(diào)節(jié),有利于次生產(chǎn)物的合成由于細胞固定在一定的介質(zhì)中，可以不斷提取產(chǎn)物，即可以進行連續(xù)生產(chǎn)。第四章 植物細胞培養(yǎng)二、植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)要求： 1.培養(yǎng)的細胞在遺傳上應(yīng)是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物； 2.細胞生長及生物合成的速度快，在較短的時間內(nèi)能得到較高產(chǎn)量的終產(chǎn)物； 3.代謝產(chǎn)物要在細胞中積累而不

31、被迅速分解，最好能將其釋放到培養(yǎng)基中。第四章 植物細胞培養(yǎng)兩相培養(yǎng)技術(shù)兩相培養(yǎng)技術(shù)：是在培養(yǎng)體系中加入水溶性或脂溶性的有機物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培養(yǎng)體系形成上、下兩相，細胞在水相中生長，合成的次生代謝產(chǎn)物分泌出來后轉(zhuǎn)移至有機相中。兩相培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點：減少產(chǎn)物的反饋抑制作用，提高產(chǎn)物含量（促進儲存在細胞內(nèi)部的產(chǎn)物分泌）；通過有機相的不斷回收及循環(huán)使用，實現(xiàn)培養(yǎng)的連續(xù)化。第四章 植物細胞培養(yǎng)建立植物細胞的兩相培養(yǎng)系統(tǒng)必需滿足以下條件添加的有機物或多聚化合物對植物細胞無毒，不會影響細胞的生長和產(chǎn)物的合成。產(chǎn)物能較容易地被有機物吸附或溶解于有機相中。兩相之間的分離容易。有機物或多聚化合物不

32、能吸收培養(yǎng)基中的有效成分。兩相培養(yǎng)的應(yīng)用舉例紫杉醇細胞兩相培養(yǎng)第四章 植物細胞培養(yǎng)實驗材料：采用東北紅豆杉細胞系，培養(yǎng)基采用某些成分加倍后的B5培養(yǎng)基，附加水解酪蛋白等成分。有機溶劑采用十六烷、油酸等對產(chǎn)物有大的分配系數(shù)的物質(zhì)。生產(chǎn)過程與紫杉醇的含量分析：結(jié)果：胞內(nèi)含量：0.893mg/L;胞外培養(yǎng)液:0.75mg/L;有機相中。第四章 植物細胞培養(yǎng)三、人工種子的概念及意義人工種子（artificial seed）是指通過植物組織培養(yǎng)的方法獲得的具有正常發(fā)育能力的材料，如胚狀體，外面再包有特定物質(zhì)，通常是一層有機的薄膜包裝，這種與天然種子相類似的人工合成種子稱作人工種子或無性種子和人造種子。第

33、四章 植物細胞培養(yǎng) 具有繁殖速度快、結(jié)構(gòu)完整等特點體細胞胚可以固定F1代雜種優(yōu)勢。為一些不能采用種子繁殖的園藝作物開辟了良種繁育的新途徑。（一）、人工種子意義第四章 植物細胞培養(yǎng)（二）、人工種子的制作程序 體細胞胚的誘導(dǎo)及同步化控制 人造胚乳及人造種皮研制及包埋 人工種子的貯存及萌發(fā)第四章 植物細胞培養(yǎng)人工種子的制作程序 高質(zhì)量體細胞胚發(fā)生系統(tǒng)的建立 體細胞胚胎發(fā)生的同步化控制化學(xué)抑制法、低溫抑制法、機械過篩選擇法、滲透壓選擇法、應(yīng)用植物胚性細胞分級儀第四章 植物細胞培養(yǎng)（三）、人造種皮及人造胚乳研制及包埋 人造種皮的研制 對人造種皮總的要求是：能保持胚狀體的活力，利于萌發(fā)和貯藏。 因此，所選

34、的材料要有韌性，耐壓，對胚狀體無毒害作用，含有胚狀體發(fā)芽生長所需的營養(yǎng)成分或植物激素，還應(yīng)含有殺菌劑以防止播種后土壤微生物的侵染。張桂芳中草藥 2011第四章 植物細胞培養(yǎng)人造種皮及人造胚乳研制及包埋 人造胚乳的研制人造胚乳的主要成分為無機鹽、碳水化合物及蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)。 人造種子的包埋技術(shù)的研制最佳的包埋材料是藻酸鹽包埋方法有滴注法和裝模法四、人工種子研究歷史 *1978年Murashige提出人工種子概念 *1986年Redenbaugh等成功地利用藻酸鈉包埋單個體細胞胚，生產(chǎn)人工種子。 *胡蘿卜、棉花、玉米、甘藍、萵苣、苜蓿等人工種子制作獲得成功。 *在我國人工種子的研究已列入國家高新

35、技術(shù)研究與發(fā)展計劃（863 計劃），并已取得一些重要的研究成果。 五、人工種子各部分功能 1 體細胞胚 2人工胚乳 可向人工胚乳內(nèi)自由添加有利于胚狀體正常萌發(fā)所需的各種營養(yǎng)成分、防病蟲物質(zhì)、植物激素等，也是人工種子優(yōu)越于天然種子之處。 3、人工種皮 六、人工種子種類 根據(jù)包裹體細胞胚材料的不同，可以將人工種子分為以下4種類型（Redenbaush等，1991）。 （1）裸露的或休眠的繁殖體，可以直接播種，如休眠微型薯等。 （2）人工種皮包裹的繁殖體。 （3）水凝膠包埋的胚狀體、不定芽以及休眠的小鱗莖等繁殖體，水凝膠中可含多種養(yǎng)分和激素，促進繁殖體的生長。 （4）液膠包埋的繁殖體。 （海藻酸鈣凝

36、膠）（云杉）七、人工種子與天然種子比較有其自身的特點： （1）可對一些自然條件下不結(jié)實的或種子很昂貴的植物進行繁殖。 （2）固定雜種優(yōu)勢，使Fl雜交種可多代利用，使優(yōu)良的單株能快速繁殖成無性系品種，從而大大縮短育種年限。 （3）在人工種子的包裹材料里加入各種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、菌肥、農(nóng)藥等，可人為地影響控制作物生長發(fā)育和抗性。 (4)可以保存及快速繁殖脫病毒苗，克服某些植物由于長期營養(yǎng)繁殖所積累的病毒病等。 (5)與試管苗相比成本低，運輸方便(體積小)，可直接播種和機械化操作。 *人工種子制備包括胚狀體的誘導(dǎo)與同步化、人工種子的包埋、人工胚乳的制作、人工種皮的制作、人工種子貯藏等步驟內(nèi)容。 1、高質(zhì)

37、量和高產(chǎn)量的體細胞胚誘導(dǎo)與同步化控制 體細胞胚的誘導(dǎo)與同步化控制方法： 八 人工種子的研制體細胞胚誘導(dǎo)與同步化控制 苜蓿體細胞胚的生產(chǎn)與植株的獲得www.plant.uoguelph.ca/research/embryo/embryo.htm 2、人工種子包埋 進行包埋時應(yīng)做到以下幾點： （1）包埋材料必須對體細胞胚無損害和無毒性，并能保護胚和胚發(fā)芽的能力，成本低廉； （2）同時在制造、貯藏、運輸和種植過程中必須具有耐久性，一定的硬度； （3）膠囊必須含有養(yǎng)分和植物激素以及植物生長和發(fā)育所需的成分和水分，以保證體細胞胚的正常萌發(fā)；（4）人工種子適合于農(nóng)業(yè)機械化播種。 a 成熟的體細胞胚；b 用無菌吸管吸取與包埋劑混合的體細胞胚 c 帶體細胞胚的液滴滴入2CaCl2溶液后形成的白色半透明的包埋丸； d 人工種皮包埋制成的人工種子 人工種子的制備3 包埋方法： 經(jīng)研究認為藻酸鹽所形成的膠囊是目前最好的凝膠包埋材料，所采用的主要方法是滴注和裝膜兩種。 （1）滴注法 制備人工種子是將選擇好的體細胞胚懸浮于含2%3%的藻酸鈉溶液中，然后用一個塑料吸管吸注含體細胞胚的藻酸鈉懸滴加入到2溶液中，這時離子間發(fā)生交換而形成膠囊，膠囊的直徑依賴于吸管的內(nèi)徑和吸注的速度，膠囊的大小，視體細胞胚的大小和發(fā)芽能力而定，一般采用吸管口徑為34 mm