《基因工程論》word版

1、 基因工程課程設計題目：基因工程及其在大腸桿菌生產(chǎn)人干擾素中的應用姓名：王曉紅 學號：20103027 年級：10級3班 專業(yè)：生物技術專業(yè)指導教師：朱常香山東農(nóng)業(yè)大學生命科學學院二014年 選題依據(jù)課程設計目的了解工業(yè)生產(chǎn)中的新型育種技術并比較不同育種技術的優(yōu)勢； 學習理解基因工程育種技術及其操作原理；研究基因工程育種技術在人干擾素生產(chǎn)中的創(chuàng)新。 基因工程作為21世紀的一種新型生物技術，應用基因工程育種技術重組大腸桿菌BL21(pBAI)生產(chǎn)人干擾素a2b, 通過優(yōu)化補料分批培養(yǎng)時葡萄糖的流加策略,提高了hIFNa2b的表達量和表達速率。利用這些技術，可以直接地、有針對性地在DNA分子水平上

2、改造生物的遺傳性狀。通過轉(zhuǎn)入外源基因，微生物和動、植物細胞可以產(chǎn)生出自身原來沒有的蛋白質(zhì)。同樣，利用重組DNA技術，也可以使一些原來存在量極低但有重要工業(yè)或醫(yī)學用途的小分子(抗生素)或蛋白質(zhì)之外的大分子物質(zhì)得以大量生產(chǎn)。特別是隨著重組DNA技術的完善和發(fā)展，以基因水平為核心的現(xiàn)代分子定向育種技術越來越受到工業(yè)微生物育種學家的關注，并展示了良好的應用前景。文獻綜述內(nèi)容1972年美國的Berg和Jackson等人將猿猴病毒基因組SV 40DNA、噬菌體基因以及大腸桿菌半乳糖操縱子在體外重組獲得成功。翌年，美國斯坦佛大學的Cohen和Boyer等人在體外構建出含有四環(huán)素和鏈霉素連個抗性基因的重組質(zhì)粒

3、分子，將之導入大腸桿菌后，該重組質(zhì)粒得以穩(wěn)定復制，并賦予受體細胞相應的抗生素抗性，由此宣告了基因工程的誕生。在二十世紀八十年代以來，隨著大批大批成果的出現(xiàn)及應用，基因工程帶來了一場新的革命。-干擾素具有較強的免疫調(diào)節(jié)、細胞抑制功能和抗病毒活性功能,在臨床上有一定的應用價值。由于天然-干擾素來源有限,產(chǎn)量甚微,因此有關-干擾素的基因工程技術研究1,2十分活躍,并帶動了重組人干擾素-(rIFN-)下游技術的研究3。優(yōu)化發(fā)酵工藝以獲得穩(wěn)定的高質(zhì)量發(fā)酵產(chǎn)物,可以降低下游技術中分離純化的成本和難度。但是,不能得到穩(wěn)定的高效表達產(chǎn)物是基因工程中普遍存在的問題4,除表達系統(tǒng)本身因素外,還涉及諸多其它因素。通

4、過對pBV220IFN-DH5工程菌高效表達rIFN-因素的研究,并選擇合適條件分離包含體,獲得了rIFN-含量和活性都很高的粗提液。采用高效疏水色譜法(HPHIC)對rIFN-進行一步同時純化與復性,方法不僅簡單、快速,而且避免了采用大量溶劑稀釋復性和通過透析除去變性劑的麻煩?；蚬こ逃N基因工程育種是在基因水平上，運用人為方法將所需的某一供體生物的遺傳物質(zhì)提取出來，在離體條件下用適當?shù)墓ぞ呙高M行切割后，與載體連接，然后導入另一細胞，使外源遺傳物質(zhì)在其中進行正常復制和表達引，與前幾種育種技術相比，基因工程育種技術是人們在分子生物學指導下的一種自覺的、能像工程一樣可預先設計和控制的育種新技術，

5、它可實現(xiàn)超遠緣雜交，因而是最新最有前途的一種育種新技術?；蚬こ碳夹g的全部過程一般包括目的基因DNA片段的取得、DNA片段與基因載體的體外連接、外源基因轉(zhuǎn)入宿主細胞和目標基因的表達等主 要環(huán)節(jié)。運用基因工程進行定向育種的新技術定點突變(sitespecific mutagenesis或sitedirected mutagenesis)是指在目的DNA片斷(例如：一個基因)的指定位點引入特定的堿基對的技術，其包括寡核苷酸介導的定點突變、盒式誘變以及以PCR為基礎的定點突變。近十年來，定點突變技術獲得了長足的發(fā)展，并且在此基礎上又發(fā)展了很多新技術。例如：重疊延伸PCR法(Overlap Exten

6、sion PCR簡稱EOPCR)、大引物PCR法(Megaprimer PCR)、一步重疊延伸PCR(OnestepOverlap Extension PCR，簡稱OOEPCR)、單管大引物PCR(Singletube Megaprimer PCR)、快速定點誘變法、多位點環(huán)狀誘變法TAMS(Targeted Amplification of Mutant Strand)定點誘變技術。在這些技術中，單管大引物PCRTAMS定點誘變技術最為簡單和適用，并得到廣泛的應用。TAMS定點誘變技術 2003年，Young等報道了一種有目的地擴增突變鏈的定點誘變技術(Targeted amplificat

7、ion of mutant strand，TAMS)。該技術能夠一次引入多個位點的突變，并且能夠有目的地擴增突變鏈，從而使突變效率幾乎達到100。定點突變技術已在蛋白質(zhì)的結(jié)構和功能改造上取得了很大成功。例如，利用定點突變改變酪氨酰-tRNA合成酶的活性中心，從而使酶活力提高了50倍；此外，在T4溶菌酶中加入二硫鍵，顯著提高了該酶的穩(wěn)定性。3.易錯PCRDNA聚合酶在進行擴增目的DNA時會以一定的頻率發(fā)生堿基錯配，這一現(xiàn)象恰好提供了一種對特定基因進行隨機誘變的可能方法。利用PCR過程中出現(xiàn)的堿基錯配進行特定基因隨機誘變的技術就稱為易錯PCR(Error_prone PCR，簡稱EPPCR)。此方

8、法的原理與操作如圖3，其操作過程是在Taq DNA聚合酶催化的PCR反應體系中，利用Mn替代天然的輔助因子Mg，使Taq DNA聚合酶缺乏校對活性，同時使反應體系中各種dNTP的比例失衡，因此導致堿基的錯配率大大增加，通常約為0.1。另外，還可以在該反應體系中加入dITP等三磷酸脫氧核苷類似物來控制錯配水平。這種方法可以將錯配率最大提高至20?？讟s等利用易錯PCR使D-海因酶對底物的水解活性提高了2.4倍；黃瑛等用易錯PCR使短小芽孢桿菌YZ02脂肪酶活性提高了1.31倍，Km值由8.24mmol/L降低至7.717mmol/L，在pH8.0時的穩(wěn)定性也較野生型脂肪酶有所提高。DAN重排DNA

9、重排(DNA shufling)技術是一種利用重組文庫的體外定向進化技術，Stemmer于1993年首先提出。Figure 4 The principle and operation process of DNA shuffling Zhao等在此基礎上發(fā)明了一種更加簡化交叉延伸程序( STEP)。此技術是在一個PCR反應體系中以2個以上相關的DNA片段為模板進行PCR反應。引物先在一個模板鏈上延伸，隨之進行多輪變性、短暫復性(延伸)過程。在每一輪PCR循環(huán)中，那些部分延伸的片段可以隨機地與含不同突變的模板進行雜交，使延伸繼續(xù)，并由于模板轉(zhuǎn)換而實現(xiàn)不同模板間的重組，這樣重復進行直到獲得全長基因

10、片段，重組的程度可以通過調(diào)整時間和溫度來控制。此方法省去了將DNA酶切成片段這一步，致使DNA重排方法進一步簡化。近幾年來，提高DNA重排技術捕獲變異的能力一直是研究人員努力的方向。Ostermie等以核酸外切酶代替DNaseI對靶序列進行消化，發(fā)明了遞減法建立雜交酶技術（ITCHY)，使得非同源性序列間也能發(fā)生重排，擴大了該技術的用途。Hiraga等開發(fā)的SISDC技術在組件內(nèi)部引入了限制性內(nèi)切酶識別標記，用相應的限制性內(nèi)切酶代替DNase I產(chǎn)生重排片段。Bergquist等開發(fā)的DOGS技術則是根據(jù)保守模體區(qū)序列特征設計簡并引物，擴增出保守同源區(qū)后再用重排操作生成突變富集體。由于此方法是

11、在突變耐受的保守區(qū)直接增加轉(zhuǎn)轍組的幾率，所以其產(chǎn)生的突變頻率大大增加。DNA重排的最大特點是在反復突變過程中引進了重組這一自然進化中最重要的過程，而且其對可操作的靶序列的長度沒有任何要求，可以達到幾萬kb。通過多輪篩選或選擇，可以使有益突變迅速積累，導致功能的明顯提高，同時還打破了傳統(tǒng)物種之間由于生殖隔離導致不能重組的界限。4.基因組重排基因組重排(genome shufling)技術是受DNA重排的啟發(fā)，于2l世紀出現(xiàn)的全基因組改組技術。這種技術將分子定向進化的對象從單個基因擴展到整個基因組，可以在更為廣泛的范圍內(nèi)對菌種的目的性狀進行優(yōu)化組合。首先，利用經(jīng)典的誘變育種技術獲得含有目標性狀的基

12、因組庫，然后利用原生質(zhì)體融合技術將這些發(fā)生正向突變的菌株的全基因組進行多輪隨機重組，從而快速篩選表型得到較大改進的雜交菌種。該技術巧妙地采用了多輪循環(huán)原生質(zhì)體融合技術，將各種親本制成原生質(zhì)體-融合-再生-再制成原生質(zhì)體-融合-再生)，即遞歸原生質(zhì)體融合(recursive protoplast fusion)的方法。Zhang等于2002年首次報道應用基因組重排方法快速地使弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)產(chǎn)生泰樂菌素的能力得到提高。該方法以營養(yǎng)缺陷型為出發(fā)菌株，僅用了1年時間，通過兩輪基因組改組就從24 000株菌株中分離到2組共14株泰樂菌素高產(chǎn)菌株，其泰樂菌素產(chǎn)量高于

13、通過經(jīng)典誘變育種方法所篩得的生產(chǎn)菌株SF21，而后者(SF21)是用經(jīng)典誘變育種方法在長達20年的時間中先后篩選過約1 000 000個菌株后才獲得的。由此可見，此技術大大減少了工作量，并縮短了篩選時間。四川抗菌素工業(yè)研究所的徐波等以產(chǎn)量性狀為標記特征，應用基因組重排的方法在一年之內(nèi)使替考拉寧產(chǎn)量提高了65.3。2、基因工程育種技術在大腸桿菌種的應用大腸桿菌是迄今為止研究的最為詳盡的原核細菌，其K-12MG1655株的4 000多kb的染色體DNA已測序完畢，全基因共含有4 405個開放閱讀框，其中大部分基因的生物功能已被鑒定。作為一種成熟的基因克隆表達受體，大腸桿菌被廣泛用于分子生物學研究的

14、各個領域，如基因的分離擴增、DNA序列分析、基因的表達產(chǎn)物功能鑒定等。由于大腸桿菌繁殖迅速，培養(yǎng)代謝易于控制，大腸桿菌的分子遺傳學背景已相當明了，不斷完善的基因操作技術可將大腸桿菌構建成為用于異源蛋白生產(chǎn)的分子工廠。因此，利用DNA重組技術構建大腸桿菌工程菌，以規(guī)?；a(chǎn)真核生物基因尤其是人類基因的表達產(chǎn)物，具有重大的經(jīng)濟價值?，F(xiàn)在已有100多種異源蛋白通過大腸桿菌基因工程菌實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，其中包括一些結(jié)構相當復雜的人體蛋白，如HAS、pro-UK、MT、M-CSF及Hb等。工業(yè)中常用于生產(chǎn)醫(yī)藥蛋白如人胰島素、人生長激素、人干擾素、人白細胞介素和抗體。以下以生產(chǎn)人干擾素為例介紹其應用。人干擾素a

15、2b (Human Interferona2b,hIFNa2b)是由165個氨基酸組成的多肽,具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、修復DNA結(jié)構損傷等作用。hIFNa2b在臨床上廣泛應用,對肝炎、呼吸道病毒感染、皰疹病毒感染等均具有治療作用。大腸桿菌表達系統(tǒng)具有生長快速、發(fā)酵成本低、表達水平高等優(yōu)點,是生產(chǎn)外源蛋白的理想表達體系。在大腸桿菌溫度誘導表達外源蛋白的發(fā)酵過程中,如何控制升溫誘導后菌體的生長,提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)速率,是實現(xiàn)高密度高表達的關鍵。本文采用大腸桿菌BL21(pBAI)表達hIFNa2b,其表達通過溫控型PL啟動子調(diào)控?？疾炝搜a料方式對hIFNa2b生產(chǎn)速率的影響,hIFNa2b表達

16、水平達到6 540 mg/L。參考文獻：1 張惠展.基因工程.上海: 華東理工大學出版社,2005,82 朱筠,李志敏,張倩,甘人寶,葉勤.重組大腸桿菌BL21(pBAI)生產(chǎn)人干擾素a2b.華東理工大學學報,2008,3(2):184-1883 聶明,李懷波,萬佳蓉,周傳云.工業(yè)微生物遺傳育種的研究進展.現(xiàn)代食品科技，2005,21(3):184-1874 王參軍,鄒文藝,張玲,范清林,宋禮華. 突變?nèi)烁蓴_素-2b基因5端提高其在大腸桿菌中的表達.安徽醫(yī)科大學學報,2010,45(2):149-1535 代云見,王明蓉,杜天飛.微生物基因工程育種技術的研究進展.藥研動態(tài)(國外醫(yī)藥抗生素分冊)

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18、. coli BL21(DE3)BF-dcm ompT hsdS (r-Bm-B) gal(DE3),重組質(zhì)粒為pBAI,帶有氨芐青霉素耐藥性標記,hIFNa2b基因表達受PL啟動子和質(zhì)粒cI857編碼的蛋白調(diào)控。培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L,酵母抽提物5 g/L,NaCl 10 g/L),滅菌后加入100 mg/L氨芐青霉素鈉。分批發(fā)酵培養(yǎng)基為含葡萄糖5 g/L的LB培養(yǎng)基。未特別注明的補料分批發(fā)酵培養(yǎng)基均為含葡萄糖5 g/L的2LB培養(yǎng)基(蛋白胨20 g/L,酵母抽提物10 g/L,NaCl 10 g/L),補料液為400 g/L的葡萄糖。培養(yǎng)基配制所用蛋白胨和酵母抽

19、提物均為Oxoid產(chǎn)品,其余試劑為國產(chǎn)分析純,采用去離子水配制。2.1.2 培養(yǎng)方法種子培養(yǎng) 從-20C保藏的甘油管中取出1ml菌液,接入裝有30 ml種子培養(yǎng)基的250mL錐形瓶,于搖床200 r/min,30C下培養(yǎng)10 h,為一級種子;將一級種子以1.5%的接種量轉(zhuǎn)接至裝有70 ml LB培養(yǎng)基的500 ml錐形瓶中,相同條件培養(yǎng)9 h,為二級種子。發(fā)酵罐培養(yǎng) 將二級種子以6%的接種量接入5 L發(fā)酵罐(RIBE-5型)中。培養(yǎng)液裝量為2.5 L，生長階段控制溫度30C,表達階段控制溫度42C，發(fā)酵過程中控制pH為7.0,通氣量4 L/min，初始攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min,發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)速逐漸提高以維持溶氧大于20%。補料分批培養(yǎng)過程中,初始葡萄糖耗盡后采用3種不同的葡萄糖流加方式，即恒pH流加、恒速流加、恒比供應速率流加。恒pH方式為當pH超過7.0時自動補入葡萄糖；恒速流加以5.4 g/(Lh)的速率流加葡萄糖；恒比供應速率(QG)為0.27 g/(gh)，每小時根據(jù)菌體濃度調(diào)整葡萄糖的流加速率。2.1.3 測定方法菌體濃度測定采用濁度法,測定波長600 nm處的光密度(OD600),根據(jù)標準曲線計算菌體干重。葡萄糖測定采用葡萄糖測定試劑盒(上?？菩郎锛夹g研究所)測定。乙酸測定采用氣相色譜法5。hIFN