苛養(yǎng)菌及少見(jiàn)菌分離培養(yǎng)與鑒定

1、1苛養(yǎng)菌及少見(jiàn)菌分離培養(yǎng)與鑒定苛養(yǎng)菌是指對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求苛刻，在普通培養(yǎng) 基上不生長(zhǎng)或難以生長(zhǎng)的一類(lèi)細(xì)菌；體外 培養(yǎng)需添加特殊因子或其它營(yíng)養(yǎng)成分?？琉B(yǎng)菌的分離鑒定是衡 量一個(gè)細(xì)菌室技術(shù)水平 的重要標(biāo)志?？琉B(yǎng)菌肺炎鏈球菌卡他莫拉菌流感嗜血桿菌淋病奈瑟菌（一）肺炎鏈球菌來(lái)源肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）簡(jiǎn) 稱(chēng)肺炎球菌（pneumococcus）。1881年首次由 巴斯德（Louis Pasteur）及G. M. Sternberg分別 在法國(guó)及美國(guó)從患者痰液中分離出。為革蘭染色 陽(yáng)性，菌體似矛頭狀，成雙或成短鏈狀排列的雙球菌， 5%10%正常人上呼吸道中攜 帶此菌。肺炎鏈

2、球菌(Streptococcus pneumoconia， SP) 是兒童和成人肺炎的重要病原菌之一，存在于正 常人口腔、鼻咽部，在機(jī)體抵抗力下降時(shí)致病。 它引起肺炎、中耳炎、乳突炎、鼻竇炎、細(xì)菌性 腦膜炎、敗血癥等疾病，尤其對(duì)嬰幼兒構(gòu)成嚴(yán)重 威脅。臨床意義易感人群任何人，皆可被肺炎鏈球菌感染，但以下3類(lèi)人士特別容易受到侵襲：65歲以上人士；5歲以下兒童，特別是2歲以下的幼童；高危人群，如長(zhǎng)期病患者等。以年齡層論，受肺炎鏈球菌侵襲，引致侵犯性肺炎鏈球菌疾病的最高危 者，是5歲以下的小兒，特別是2歲以下的幼童。一旦受到侵襲，死亡率最 高的是年長(zhǎng)的老人家及有長(zhǎng)期病患的高危人群。中國(guó)2011年婦幼衛(wèi)

3、生事業(yè)發(fā)展報(bào)告指出，肺炎位列中國(guó)五歲以下兒童 死因的第二位，在重癥肺炎中，約有50%是由肺炎鏈球菌引起的。肺炎鏈 球菌不僅是小兒肺炎的主要“元兇”，也是引起肺炎死亡的重要病原。嬰 兒從6月齡起母?jìng)骺贵w逐漸消失，因此6月齡到2歲是兒童侵襲性肺炎鏈球 菌性疾病發(fā)病率最高的時(shí)期。肺炎鏈球菌的莢膜在細(xì)菌的侵襲力上起主要作用，有莢膜 的SP有毒力，失去莢膜則獨(dú)力減低或喪失。還可產(chǎn)生溶血 素、紫斑產(chǎn)生因子、殺細(xì)胞素、皮膚致死毒素等。根據(jù)肺炎鏈球菌莢膜多糖抗原的不同可分為90個(gè)血清型，與疾病相關(guān)的血清型分布隨時(shí)間、地點(diǎn)、年齡不同而變化。致病力標(biāo)本來(lái)源痰肺泡灌洗液膿液耳分泌物外陰分泌物胸腔積液腦脊液血液等標(biāo)本

4、應(yīng)采用從深部咳出，選擇鐵銹色部分或膿性分泌物痰。培養(yǎng)基血瓊脂平板：胰大豆蛋白胨瓊脂或哥 倫比亞瓊脂加5%綿羊血；加慶大霉素的血瓊脂平板：在普通血 瓊脂中加入抑制劑慶大霉素注射液，混 勻傾倒平板，瓊脂中慶大霉素最后濃度 相當(dāng)于1.25 mg/250mL。標(biāo)本接種及培養(yǎng)條件用鼻咽拭子采取患者鼻咽分泌物、痰、咽 拭子、肺泡灌洗液等呼吸道標(biāo)本接種慶大 霉素血平板或普通血平板，置于35， 510% CO 2 溫箱培養(yǎng) 18-24血液、腦脊液標(biāo)本等無(wú)菌體液標(biāo)本可直接 采用血培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)。典型的肺炎鏈球菌菌落細(xì)小、圓形、呈臍 窩狀、較濕潤(rùn)、邊緣整齊，直徑0.5 1.5mm的菌落。不典型的肺炎鏈球菌菌落有水

5、滴樣，菌落 較大，邊緣不整齊；還有細(xì)小、似草綠色 鏈球菌但較濕潤(rùn)的菌落也需注意。菌落特點(diǎn)粘液型臍窩狀細(xì)菌染色形態(tài)革蘭氏染色陽(yáng)性，呈矛頭狀，成雙或鏈狀 列，有莢膜；在痰標(biāo)本中大多數(shù)成雙排列。鑒別要點(diǎn)Optochin敏感膽汁溶菌莢膜腫脹試驗(yàn)菊糖分解試驗(yàn)陽(yáng)性O(shè)ptochin(OP)敏感試驗(yàn)挑取被檢菌，密涂于血平板上，貼上 含 5 g/ 片 的 Optochin 紙 片 ， 置 510%CO2 的大氣中（或燭缸），35孵育過(guò)夜。抑菌環(huán)直徑=14mm為敏感， 推斷為肺炎鏈球菌。抑菌環(huán)直徑14mm 時(shí)參照膽汁溶菌試驗(yàn)。膽汁溶菌試驗(yàn)（1）試管法 取新鮮培養(yǎng)物分裝于兩支試管內(nèi)（每支1ml）， 其中一支加入10

6、%的去氧膽酸鈉溶液0.1ml或純牛膽汁0.2ml， 另一支加入無(wú)菌鹽水兩滴（對(duì)照），15min后，陽(yáng)性者細(xì)菌 被溶解，試管內(nèi)液體呈透明狀，陰性者無(wú)變化。（2）平皿法 加一滴10%的去氧膽酸鈉溶液或純牛膽汁于被 檢菌菌苔上，15min后，陽(yáng)性者細(xì)菌菌苔被溶解，陰性者無(wú) 變化。試驗(yàn)應(yīng)有已知肺炎鏈球菌作陽(yáng)性對(duì)照。莢膜腫脹試驗(yàn)取一滴抗血清與一滴菌懸液混勻，加少量 美藍(lán)液混合后加蓋片，室溫1020min后， 用油鏡檢查，如查到菌體呈蘭色，周?chē)@ 有界限明顯未染色的膨大空白圈為陽(yáng)性?？捎糜诜窝祖溓蚓姆中?。（二）流感嗜血桿菌臨床意義流感嗜血桿菌常寄生在人的咽喉及口腔粘 膜，少見(jiàn)于消化道和生殖道，在呼吸道定

7、植者 可達(dá)人群的50%。當(dāng)機(jī)體 抵抗力下降時(shí)引起疾 病?？呻S血液入侵組織內(nèi)部，引起腦膜炎、關(guān) 節(jié)膿腫和其它部位化膿性感染。標(biāo)本接種處理痰、咽拭子、血、分泌物、腦脊液等標(biāo)本 劃線(xiàn)接種于流感嗜血桿菌選擇性培養(yǎng)基， 放入5CO2培養(yǎng)箱 3537孵育1824h, 菌落細(xì)小，可延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至48小時(shí)。與臨床有關(guān)的有9個(gè)：流感嗜血桿菌副流感嗜血桿菌溶血嗜血桿菌副溶血嗜血桿菌杜克雷嗜血桿菌埃及嗜血桿菌嗜沫嗜血桿菌副嗜沫嗜血桿菌遲緩嗜血桿菌代表菌：流感嗜血桿菌培養(yǎng)特性營(yíng)養(yǎng)要求比較特別，需要、因子存在及 5 10%的CO2氣體，最適生長(zhǎng)溫度37。培養(yǎng)基采用哥倫比亞瓊脂加5%馬血或兔血制成巧 克力瓊脂，加入去甲萬(wàn)

8、古霉素注射液或桿菌肽作 為抑制劑，終濃度分別為6mg/300mL 、 76mg/250mL。用綿羊血做巧克力時(shí)，需加入添加劑（OXOID公 司產(chǎn)品，劑量按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)）。培養(yǎng)特性需氧菌培養(yǎng)較為困難培養(yǎng)基中需加入血液， 提供X、V因子X(jué)因子血紅素V因子輔酶I或輔酶II510%的CO2流感嗜血桿菌的純培養(yǎng)形態(tài)在巧克力平板上形成 微小、無(wú)色透明、呈 露滴樣小菌落。48h 后可形成灰白色、較 大菌落。革蘭染色形態(tài)特征流感嗜血桿菌為革蘭氏陰 性細(xì)小桿菌，從病灶中分 離的菌株多呈球桿狀或雙 球狀，有時(shí)可呈短鏈；在 陳舊培養(yǎng)物中成多形態(tài)性， 有長(zhǎng)桿狀和絲狀；無(wú)芽孢、 無(wú)鞭毛。鑒定方法衛(wèi)星試驗(yàn)X、V因子需求試驗(yàn)

9、衛(wèi)星試驗(yàn)原理有溶血性的細(xì)菌在羊血瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)可破壞紅細(xì)胞釋 放出血紅素(即X因子)和維生素B類(lèi)物質(zhì)(即V因子)，從而促進(jìn)了 流感嗜血桿菌的生長(zhǎng)；金黃色葡萄球菌在生長(zhǎng)過(guò)程中能合成V因 子釋放于培養(yǎng)基中，當(dāng)嗜血桿菌與金黃色葡萄球菌一起培養(yǎng)時(shí)， V因子會(huì)促進(jìn)嗜血桿菌的生長(zhǎng)，出現(xiàn)靠近葡萄球菌菌落的嗜血桿菌菌落較大，而遠(yuǎn) 離葡萄球菌菌落的嗜血桿菌菌落較小的現(xiàn) 象稱(chēng)為“衛(wèi)星現(xiàn)象”；在不含血紅素瓊脂 平板上進(jìn)行的衛(wèi)星試驗(yàn)，稱(chēng)為“瓊脂衛(wèi)星 試驗(yàn)”。X、V因子需求試驗(yàn)取無(wú)色透明，邊緣整齊，露滴狀菌落在哥倫比亞 瓊脂平板上均勻密劃線(xiàn)，在劃線(xiàn)上貼X、 V因子紙 片，兩紙片間距為2022mm。經(jīng) 510%的CO

10、2培養(yǎng)箱， 3537孵育1824h，在 兩紙片中央出現(xiàn)細(xì)小菌落生長(zhǎng)現(xiàn)象為陽(yáng)性。嗜血桿菌屬主要菌種X因子V因子溶 血CO2觸酶G+C(mol%)+（+）+39393942384041+DD4041菌名流感嗜血桿菌埃及嗜血桿菌溶血嗜血桿菌嗜沫嗜血桿菌*杜克雷嗜血副溶血嗜血桿菌副流感嗜血桿菌副嗜沫嗜血桿菌+42 *常見(jiàn)在次代培養(yǎng)不需要血紅素; D.不同結(jié)果.生化反應(yīng)氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，分解葡萄糖，不分解蔗 糖和乳糖，觸酶和硝酸鹽還原試驗(yàn)均為陽(yáng) 性。有莢膜的菌株能產(chǎn)生吲哚，無(wú)莢膜菌 株則不行致病性致病物質(zhì)為內(nèi)毒素、莢膜、菌毛和酶類(lèi)通過(guò)呼吸道感染，引起原發(fā)性或繼發(fā)性感染原發(fā)性感染多由b型莢膜強(qiáng)毒株引起，為急

11、性化膿感染，如腦 膜炎、鼻咽炎、咽喉會(huì)厭炎、化膿性關(guān)節(jié)炎、心包炎等繼發(fā)性感染主要在流感、麻疹、百日咳、肺結(jié)核等后發(fā)生， 多為無(wú)莢膜菌株引起。如慢性支氣管炎、鼻竇炎等（三）卡他莫拉菌卡他莫拉菌（M.catarrhalis）原屬奈瑟菌屬，1970年 分類(lèi)為布蘭漢菌(Branhamella)，1984年（伯杰分類(lèi)細(xì)菌 學(xué)手冊(cè)）列為莫拉菌屬(Moraxella)的一個(gè)亞屬（Subgenus Branhamella）。該菌寄居于人類(lèi)的鼻煙部， 也可引起人類(lèi)多種感染。如急性中耳炎、上頜竇炎和下呼 吸道感染，也可引起腦膜炎、心內(nèi)膜炎、尿道炎，嬰兒和 兒童眼結(jié)膜炎、角膜炎和敗血癥等。該菌產(chǎn)生 -內(nèi)酰胺酶的菌株

12、漸多，為臨床治療帶來(lái)一定困難。臨床意義培養(yǎng)特點(diǎn)本菌生長(zhǎng)不需要特殊營(yíng)養(yǎng)條件，需氧，在血平板、巧 克力平板及營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上均能生長(zhǎng)。在510%CO2環(huán)境 中，35培養(yǎng)過(guò)夜，可形成直徑13mm的菌落。菌落圓 形、凸起、無(wú)色、不溶血，推刮易碎不沾環(huán)，用接種環(huán)刮取的菌苔可呈淡奶色，在鹽水中 不易乳化。有些菌株在初分離時(shí)， 菌落可微微凹陷在瓊脂中。革蘭染色形態(tài)特征本菌為革蘭陰性球菌，直徑 0.61.0m，無(wú)芽孢、無(wú)鞭毛， 呈單或成雙存在，成雙時(shí)，兩 菌相對(duì)呈腎形。生化反應(yīng)特點(diǎn)本菌不分解碳水化合物，硝酸鹽還原試 驗(yàn)陽(yáng)性，氧化酶及觸酶試驗(yàn)均陽(yáng)性，DNA 酶和乙酰脂酶陽(yáng)性。DNA酶試驗(yàn)鑒別方法乙酰脂酶試驗(yàn)DNA

13、酶試驗(yàn)挑取可疑菌落，涂抹接種于DNA瓊脂平板上(涂 抹菌斑直徑5-10mm)，以金黃色葡萄球菌ATCC 25923作為陽(yáng)性對(duì)照，放入35孵箱培養(yǎng)24-48h 后，于DNA瓊脂上加1N HCL溶液1-2ml(鋪滿(mǎn)瓊脂 表面)，10分鐘后觀(guān)察結(jié)果：菌斑周?chē)蚓呦?刮去菌 斑)出現(xiàn)無(wú)色透明區(qū)即為 DNA酶陽(yáng)性。乙酰脂酶試驗(yàn)用無(wú)菌生理鹽水將3-乙酰吲哚紙片沾濕， 取待檢菌落涂在紙片上，3分鐘內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)綠 色為陽(yáng)性反應(yīng)。以卡他莫拉菌ATCC 25238， 全國(guó)臨檢中心質(zhì)控菌株9602、9707、0101作為陽(yáng)性對(duì)照。少見(jiàn)菌44棒狀桿菌屬棒桿菌屬的細(xì)菌為革蘭陽(yáng)性直或微彎曲的桿菌， 縱邊不平行，有的末端略膨

14、大呈棒形。棒桿菌常成對(duì)并排，V形，柵欄狀或呈簇狀排列， 細(xì)胞很少著色不均，不分枝，無(wú)抗酸性。通常細(xì)胞內(nèi)有異染顆粒，與醫(yī)學(xué)相關(guān)的種均無(wú)動(dòng) 力。培養(yǎng)特性棒桿菌需氧或兼性厭氧，杰氏棒桿菌不 能在厭氧條件下生長(zhǎng)。與醫(yī)學(xué)相關(guān)的棒桿菌均可在含有5的羊血瓊脂平 板上良好生長(zhǎng)。最適生長(zhǎng)溫度為3537。不能 在麥康凱瓊脂上生長(zhǎng)。45棒狀桿菌屬杰氏棒桿菌革蘭染色接近棒桿菌血平皿菌落46棒狀桿菌屬以下情況分離到棒桿菌更具有臨床意義：多份標(biāo)本部分離到同樣的棒桿菌。標(biāo)本直接涂片革蘭染色鏡下見(jiàn)到棒桿菌，并觀(guān)察到強(qiáng) 烈的白細(xì)胞反應(yīng)。從同一標(biāo)本中分離到的其他細(xì)菌的致病性低。以下情況下分離到的棒桿菌需要鑒定到種的水平：從無(wú)菌的

15、體液標(biāo)本中分離出的捧桿菌(多份標(biāo)本中只 有一份為陽(yáng)性時(shí)除外)。嚴(yán)格按操作規(guī)程采集的標(biāo)本中分離出的棒桿菌，而且 是優(yōu)勢(shì)菌時(shí)。從尿標(biāo)本分離出單一的棒桿菌，細(xì)菌計(jì)數(shù)大于104CFU/ml，或是優(yōu)勢(shì)菌細(xì)菌計(jì)十?dāng)?shù)大于105CFU/ml時(shí)。47單核細(xì)胞增生李斯特菌李斯特菌為革蘭陽(yáng)性短桿菌，不分枝，無(wú)芽胞， 長(zhǎng)0 5-2um，寬0.4-0.5um，菌體細(xì)胞呈單個(gè) 或短鏈狀，培養(yǎng)時(shí)間延 長(zhǎng)或粗糙型培養(yǎng)物可 呈絲狀菌體(6-20um)。有1-5根周鞭毛， 在室溫下運(yùn)動(dòng)活潑，在35 時(shí)失去動(dòng)力或運(yùn)動(dòng)非常緩慢，此特 征可作為 初步判定。李斯特菌為兼性厭氧菌，在含5羊，馬兔血 的胰大豆胨瓊脂平皿上生長(zhǎng)良好。最適生長(zhǎng)溫

16、 度為30-37能在4下緩慢生長(zhǎng)。48單核細(xì)胞增生李斯特菌單核細(xì)胞增生李斯特菌伊氏李斯特菌49單核細(xì)胞增生李斯特菌CAMP實(shí)驗(yàn)是鑒定單核細(xì) 胞增生李斯特菌及其他李 斯特菌的重要試驗(yàn)之一。 本菌CAMP試驗(yàn)的加強(qiáng)溶 血區(qū)不是箭頭狀而是長(zhǎng)方 形。用馬紅球菌做CAMP試驗(yàn) 時(shí)單核細(xì)胞增生李斯特菌 呈陰性或弱陽(yáng)性，伊氏李 斯特菌為陽(yáng)性。50諾卡菌屬革蘭氏染色：革蘭氏陽(yáng)性或不定，無(wú)芽孢和鞭毛。菌體呈多向的分枝絲狀，直徑0.5-1.2 m。 培養(yǎng)早期可見(jiàn)豐富的菌絲體，常有次級(jí)分枝。培養(yǎng)后期菌體裂解為球形或桿狀。星形奴卡菌巴西奴卡菌星形奴卡菌51星形奴卡菌 24 h星形奴卡菌 72 h諾卡菌屬52改良抗酸染

17、色為弱陽(yáng)性（1%硫酸水溶液），呈不均勻性，易被脫色呈陰性。奴卡菌星形奴卡菌星形奴卡菌諾卡菌屬53痰標(biāo)本直接涂片革蘭氏染色可見(jiàn)典型的分枝菌絲，菌絲呈90 分枝角。有時(shí) 不易著色或不均勻。痰涂片 菌絲呈90 分枝痰涂片 菌絲團(tuán)痰涂片 著色不均諾卡菌屬54組織中細(xì)菌易聚集形成團(tuán)塊或微粒，在膿性分泌物中肉眼可見(jiàn)“硫磺顆?！碧低科?弱抗酸染色血培養(yǎng)涂片 革蘭氏染色諾卡菌屬55諾卡菌屬星形諾卡菌培養(yǎng)2d56屬間鑒定諾卡菌屬于其他需氧放線(xiàn)菌屬如鏈霉菌屬、擬諾卡菌屬、紅球菌屬、馬杜拉放 線(xiàn)菌屬以及棒狀桿菌等形態(tài)形似的革蘭氏陽(yáng)性桿菌的屬間鑒定：與鏈霉菌屬、放線(xiàn)菌屬和擬諾卡菌屬的鑒別四者鏡下形態(tài)均為分枝絲狀，但諾

18、卡菌屬改良抗酸染色弱陽(yáng)性，后者陰性。革蘭氏染色菌絲與孢子鏈諾卡菌屬57白色鏈霉菌擬諾卡菌 MHA，9d，氣生菌絲諾卡菌屬58與紅球菌屬的鑒別兩者均可呈現(xiàn)弱抗酸性，但馬紅球菌不產(chǎn)生氣生菌絲。馬紅球菌 48h 粘液型馬紅球菌 SBA 粗糙型諾卡菌屬59馬紅球菌 24h 弱抗酸馬紅球菌 5d 革蘭氏染色諾卡菌屬60與棒狀桿菌的鑒別棒狀桿菌不形成菌絲，菌體呈柵欄狀排列。諾卡菌屬61諾卡菌屬臨床意義：諾卡菌在自然界分布廣泛，多為腐生寄生菌，與人類(lèi)關(guān)系最大的 是星形諾卡菌復(fù)合體（星形、鼻疽和新星，引起90%的非皮膚部 位感染）；巴西諾卡菌（熱帶的足分枝菌病和非熱帶肺部感染， CNS），多為外源性感染足分枝

19、菌病：巴西諾卡菌，熱帶地區(qū)，可通過(guò)損傷的皮膚侵犯皮 下組織，產(chǎn)生慢性化膿樣肉芽腫，表現(xiàn)為膿腫及多發(fā)性瘺管，好 發(fā)于足和腿部。孢子絲菌病：星形諾卡菌，皮膚淋巴肺部-吸入性：星形諾卡菌，慢性，X光顯示滲入性結(jié)節(jié)，空洞， 多結(jié)節(jié)，類(lèi)似結(jié)核病。星形諾卡菌肺炎患者的痰標(biāo)本呈肺結(jié)核樣 乳酪樣痰。播散性：由肺部感染引起，90%為星形諾卡菌，CNS占40%，膿 腫或肉芽腫；其他部位：眼，腎，關(guān)節(jié)，心臟。62諾卡菌屬鑒定要點(diǎn)：弱抗酸染色（改良抗酸染色）必須標(biāo)準(zhǔn)化。 涂片染色與分離培養(yǎng)必須結(jié)合取長(zhǎng)補(bǔ)短。加強(qiáng)與臨床溝通使檢驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)化為臨床治療 更能及時(shí)有效。63形態(tài)學(xué)檢查在細(xì)菌鑒定中的關(guān)鍵作用菌體形態(tài)觀(guān)察通過(guò)觀(guān)察菌

20、體形態(tài) 為鑒別細(xì)菌提供手段 細(xì)菌菌體形態(tài)結(jié)合 菌落形態(tài)特征可對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒別。例如，在選擇性巧克力平 板（加萬(wàn)古霉素）上生長(zhǎng)的草綠色溶血菌落，是乳桿菌還是 腸球菌（VRE）只要涂片鏡檢就很容易區(qū)分；鮑曼不動(dòng)桿與 克雷白菌屬細(xì)菌的菌落形態(tài)相似，區(qū)別在于前者為革蘭陰性 球桿菌（接近球菌），后者為革蘭陰性桿菌；丹毒絲菌在血 平板上的菌落形態(tài)與草綠色鏈球菌很相像，但鏡下形態(tài)差別 很大。64形態(tài)學(xué)檢查在細(xì)菌鑒定中的關(guān)鍵作用肺炎克雷伯菌拉絲現(xiàn)象諾卡菌65形態(tài)學(xué)檢查在細(xì)菌鑒定中的關(guān)鍵作用菌體特殊結(jié)構(gòu)的觀(guān)察莢膜 莢膜是某些細(xì)菌在細(xì)胞壁外包裹的一層粘液性物質(zhì)， 不同的細(xì)菌其莢膜成分也有一定差異，一般由多糖、多 肽或蛋白質(zhì)組成。莢膜作為細(xì)菌的毒力因子有必要對(duì)其 染色