研發(fā)部崗前培訓(xùn)細(xì)胞培養(yǎng)ppt課件

1、研發(fā)部崗前培訓(xùn)牛血清細(xì)胞培育技術(shù)中文稱號(hào)： 胎牛血清 英文稱號(hào)： fetal calf serum 定義： 采自胎牛的血清。含有多種生長(zhǎng)因子，常用于體外細(xì)胞培育。一、胎牛血清各項(xiàng)質(zhì)量目的符合2005版第三部附錄的要求。1、性狀、外觀 淺黃色廓清、無(wú)溶血、無(wú)異物稍粘稠液體。2、蛋白質(zhì)含量 3.5%5.0% w/v3、血紅蛋白含量 0.02% w/v4、無(wú)菌檢驗(yàn) 陰性5、支原體檢驗(yàn) 陰性 6、細(xì)菌內(nèi)毒素 5EU/ml 7、牛腹瀉病毒 陰性8、大腸桿菌噬菌體 陰性 9、支持細(xì)胞增殖(Sp2/0-Ag14)生長(zhǎng)曲線接種濃度最大增殖濃度2.5106 個(gè)/ml細(xì)胞倍增時(shí)間 15h 克隆率 85%血清的主要

2、成分血清是由血漿去除纖維蛋白而構(gòu)成的一種很復(fù)雜的混合物，其組成成份雖大部分知，但還有一部分尚不清楚，且血清組成及含量常隨供血?jiǎng)游锏男詣e、年齡、生理?xiàng)l件和營(yíng)養(yǎng)條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長(zhǎng)因子、激素、無(wú)機(jī)物等，這些物質(zhì)對(duì)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)或抑制生長(zhǎng)活性是到達(dá)生理平衡的。胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛；新牛血清取自出生24小時(shí)之內(nèi)的新生牛；小牛血清取自出生1030天的小牛。顯然，胎牛血清是質(zhì)量最高的，由于胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對(duì)細(xì)胞有害的成分最少。功能牛血清是細(xì)胞培育中用量最大的天然培育基，含有豐富的細(xì)胞生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)成份，常用于動(dòng)物細(xì)胞的體外培育，具

3、有極為重要的功能。1.提供對(duì)維持細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)的激素，根底培育基中沒(méi)有或量很少的營(yíng)養(yǎng)物，以及主要的低分子營(yíng)養(yǎng)物。2. 提供結(jié)合蛋白，能識(shí)別維生素、脂類(lèi)、金屬和其他激素等，能結(jié)合或調(diào)變它們所結(jié)合的物質(zhì)活力。3.有些情況下結(jié)合蛋白質(zhì)能與有毒金屬和熱原質(zhì)結(jié)合，起到解毒作用。4.是細(xì)胞貼壁、鋪展在塑料培育基質(zhì)上所需因子來(lái)源。5.起酸堿度緩沖液作用。6.提供蛋白酶抑制劑，使在細(xì)胞傳代時(shí)使剩余胰蛋白酶失活，維護(hù)細(xì)胞不受損傷。胎牛血清與小牛血清不同點(diǎn)1、來(lái)源不同：胎牛血清(Fetal Bovine Serum ,FBS) 是在屠宰懷孕母牛的時(shí)候,經(jīng)過(guò)心臟穿刺采血獲取的胎牛的血清，新生牛(小牛)血清(Calf

4、serum, CS)采自出生10至14 天的小牛。組份與比例不同：兩者所含的促細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促貼附因子、激素及其他活性物質(zhì)等組份與比例不同，用途與用法不同：某些細(xì)胞必需胎牛血清才干生長(zhǎng)，而有些細(xì)胞只需小牛血清即可，運(yùn)用濃度不同，普通在5%-10%，有特殊要求的濃度在20%。血清保管和運(yùn)用須留意：血清應(yīng)保管在-5至-20，假設(shè)存放在4不可超越一個(gè)月。解凍血清時(shí) ，應(yīng)先將血清至于2-8冰箱，并經(jīng)常搖勻使之溶解，然后至室溫放置使之升溫，絕對(duì)不可將冷凍的血清直接放入37水浴或者溫箱中，如放在37解凍，顏色加深，粘稠度也會(huì)添加，血清在解凍和熱滅活后，應(yīng)按用量分裝并于-20保管，防止反復(fù)凍融。2、胎牛血清

5、，小牛血清和新生牛血清三種之間的區(qū)別：這三種血清的成份，總體沒(méi)有什么明顯差別，只是有一些成分與其生存環(huán)境有關(guān)，如上述有人說(shuō)的抗體很等少。此外，因生長(zhǎng)發(fā)育的需求，有些成分在小牛出生后會(huì)發(fā)生一些變化。不過(guò)還沒(méi)有搞清楚它與其它的血清之間的差別。有一點(diǎn)可以一定，胎牛血清中的部分功能蛋白與小牛血清中的含量有差別。3、最為重要的一點(diǎn)是：胎牛本身生活在一個(gè)干凈環(huán)境當(dāng)中，其血清與外界隔絕，只需消費(fèi)工藝科學(xué)規(guī)范，其質(zhì)量一定要比后兩者好。4、根據(jù)牛出生時(shí)間和血清采制分別方法分為：1胎牛血清：八月齡胎牛心臟穿刺取血;2新生牛血清：出生12-24小時(shí)新生牛靜脈采血;又可細(xì)分為：a.高級(jí)新生牛血清：采血后靜置自然析出的

6、血清;b.規(guī)范新生牛血清：c.經(jīng)離心分別的血清;d.普通新生牛血清：融血或微融血的血清;3小牛血清：出生三月齡小牛動(dòng)脈采血分別血清; 血清是血漿去除纖維蛋白而構(gòu)成的一種很復(fù)雜的混合物，其組成成份雖大部分知，但還有一部分尚不清楚，且血清組成及含量常隨供血?jiǎng)游锏男詣e、年齡、生理?xiàng)l件和營(yíng)養(yǎng)條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長(zhǎng)因子、激素、無(wú)機(jī)物等，這些物質(zhì)對(duì)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)或抑制生長(zhǎng)活性是到達(dá)生理平衡的。對(duì)血清的成分和作用的研討雖有很大進(jìn)展，但仍存在一些問(wèn)題。胎牛血清是質(zhì)量最高的，由于胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對(duì)細(xì)胞有害的成分最少。一、細(xì)胞培育(cell cu

7、lture)的定義 從體內(nèi)取出細(xì)胞，在模擬體內(nèi)生理環(huán)境下無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定的營(yíng)養(yǎng)條件，使細(xì)胞生存、生長(zhǎng)并維持其構(gòu)造和功能的方法。IN VITRO:離體的，即在容器中用培育細(xì)胞進(jìn)展的實(shí)驗(yàn)IN VIVO:在體的完好機(jī)體內(nèi)進(jìn)展的實(shí)驗(yàn)二、細(xì)胞培育的優(yōu)點(diǎn)與缺乏 一優(yōu)點(diǎn)：長(zhǎng)時(shí)間直接察看活細(xì)胞的形狀構(gòu)造和生命活動(dòng)：細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)攝影、攝電影和閉路電視等方法記錄細(xì)胞變化細(xì)胞種類(lèi)廣泛：從低等生物到高等生物人；從胚胎到成體；從正常細(xì)胞到腫瘤細(xì)胞便于運(yùn)用各種技術(shù)：相差顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、組織化學(xué)、同位素標(biāo)志等易于運(yùn)用物理、化學(xué)和生物要素等進(jìn)展研討提供大量生物性狀類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)對(duì)象，更經(jīng)濟(jì)二

8、缺乏：即使模擬體內(nèi)環(huán)境的技術(shù)開(kāi)展很快，但是與體內(nèi)環(huán)境相比，仍有較大差別對(duì)無(wú)菌要求高失去神經(jīng)體液的調(diào)理和細(xì)胞間的相互作用：去分化、永生或惡變?nèi)?、培育?xì)胞的形狀分類(lèi) 一貼附型這類(lèi)細(xì)胞在培育時(shí)能貼附在支持物外表生長(zhǎng)大多數(shù)培育細(xì)胞呈貼附型生長(zhǎng)只依賴于貼附才干生長(zhǎng)的細(xì)胞稱貼附性細(xì)胞分類(lèi)：成纖維型細(xì)胞中胚層間充質(zhì)來(lái)源、上皮型細(xì)胞內(nèi)、外胚層來(lái)源、游走型細(xì)胞活潑的游走與變形運(yùn)動(dòng)、多形型細(xì)胞神經(jīng)細(xì)胞二懸浮型不貼附在支持物上生長(zhǎng)呈懸浮形狀生長(zhǎng)，胞體為圓形如某些癌細(xì)胞和血液白細(xì)胞特點(diǎn)：生存空間大，允許長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)，能繁衍大量細(xì)胞，便于進(jìn)展細(xì)胞代謝等研討三細(xì)胞凍存與復(fù)蘇培育細(xì)胞在傳代過(guò)程中性質(zhì)容易發(fā)生變化，且有支原體污

9、染的危險(xiǎn)處理方法：細(xì)胞凍存，需求時(shí)復(fù)蘇在培育液中參與冷凍維護(hù)劑小分子：甘油、二甲亞砜，以減少細(xì)胞內(nèi)液構(gòu)成冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。大分子：蔗糖、卵黃，穩(wěn)定細(xì)胞膜復(fù)蘇：手工降溫、程序降溫儀“慢凍速溶五、培育細(xì)胞的生存環(huán)境一無(wú)污染環(huán)境細(xì)胞培育環(huán)境無(wú)毒、無(wú)菌是首要條件人體：皮膚、黏膜；免疫系統(tǒng)；解毒器官肝臟體外：堅(jiān)持細(xì)胞培育環(huán)境無(wú)任何污染，及時(shí)去除代謝物二溫度人和哺乳動(dòng)物培育細(xì)胞規(guī)范溫度：36.5C 0.5C培育細(xì)胞對(duì)低溫的耐受力比其對(duì)高溫強(qiáng) 39 C 四、細(xì)胞培育的根本技術(shù)一細(xì)胞分別與原代培育原代培育primary culture也稱初代培育，指從供體分別得到所需細(xì)胞后，接種于培育器皿，進(jìn)展初次培育培育資

10、料為血液、胸水、腹水和羊水等細(xì)胞懸液時(shí)，可采用低速離心分別培育資料為組織塊時(shí)，將組織塊剪切得盡能夠細(xì)小，然后用膠原酶或胰蛋白酶進(jìn)一步消化，以獲得細(xì)胞懸液細(xì)胞分別與原代培育二細(xì)胞的傳代secondary culture細(xì)胞由原培育器皿內(nèi)分別稀釋后傳到新的培育器皿的過(guò)程為傳代貼附細(xì)胞的傳代：多采用含有胰蛋白酶和EDTA的消化液消化傳代，然后以適宜比例接種在新的培育器皿內(nèi)懸浮細(xì)胞的傳代：可直接添加新穎培育液，或離心搜集后換新穎培育液，再以一定比例稀釋傳代細(xì)胞系cell line： 在細(xì)胞培育中產(chǎn)生了具有無(wú)限增殖才干的變種細(xì)胞，這種細(xì)胞可被無(wú)限的傳代常見(jiàn)的細(xì)胞系： NIH3T3細(xì)胞系：取自小鼠胚胎細(xì)胞

11、建立(1963年) Hela細(xì)胞系：取自人宮頸癌細(xì)胞建立(1952年)貼附型細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程 游離期 貼壁期 埋伏期 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 停頓期平臺(tái)期，平頂期 游離期：細(xì)胞接種后在培育液中呈懸浮形狀。也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形10分鐘 4小時(shí) 貼壁期：細(xì)胞附著于底物上，游離期終了。細(xì)胞株平均在10分鐘 4小時(shí)貼壁底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白生長(zhǎng)基質(zhì)，這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著進(jìn)口塑料培育瓶涂有生長(zhǎng)基質(zhì)化學(xué)合成的功能基團(tuán)細(xì)胞貼壁過(guò)程細(xì)胞貼壁過(guò)程 埋伏期：此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，但是

12、無(wú)細(xì)胞分裂。細(xì)胞株埋伏期普通為624小時(shí) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最正確，最適宜進(jìn)展實(shí)驗(yàn)研討 停頓期平臺(tái)期：細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程三氣體環(huán)境與pH值多數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)需求O2，閉合式單層細(xì)胞培育氧分壓1995 - 9975Pa開(kāi)放培育時(shí)碟皿或培育瓶松蓋培育，普通將細(xì)胞置于95%空氣加5%CO2混合氣體環(huán)境中CO2的主要作用在于維持培育基的pH 值，多數(shù)細(xì)胞的適宜pH值為7.2 7.4原代培育細(xì)胞普通對(duì)pH的變動(dòng)耐受差；永生細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞耐受力強(qiáng)總的說(shuō)來(lái)，培育細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些四體外培育細(xì)胞生存所需根本物質(zhì)六碳糖是主要

13、的能源葡萄糖、半乳糖 1. 糖 2. 氨基酸一切的細(xì)胞都需求谷氨酰胺，其所含的氨是核酸中嘌呤和嘧啶的來(lái)源；其它還有精氨酸、胱氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸等培育細(xì)胞也需求維生素，如生物素、葉酸、泛酸、核黃素、硫胺素、胭酰胺等 3. 促生長(zhǎng)因子EGF, FGF, NGF, PDGF, EDGF等激素：胰島素促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄 糖和氨基酸 氫考促進(jìn)上皮細(xì)胞生長(zhǎng) 4. 其它物質(zhì)根本元素：鉀、鈉、鈣、鎂、氮和磷微量元素：鐵、鋅、硒等五浸透壓人血漿浸透壓約290mOsm/kg，可視為培育細(xì)胞的理想浸透壓鼠細(xì)胞浸透壓約320mOsm/kg大多數(shù)培育細(xì)胞的浸透

14、壓在260 mOsm/kg - 320 mOsm/kg六培育基按物質(zhì)形狀：半固體培育基，液體培育基按其來(lái)源：1合成培育基：根據(jù)知細(xì)胞所需物質(zhì) 的種類(lèi)和數(shù)量嚴(yán)厲配制而2天然培育基：成分尚未搞清楚，如血清、 血漿等3無(wú)血清培育基：根本培育基促生長(zhǎng)物質(zhì)七附著底物除少數(shù)懸浮型細(xì)胞外，絕大多數(shù)培育細(xì)胞需求適宜的底物以附著其上類(lèi)型：1玻璃：透明、易察看、易洗滌、能反復(fù)運(yùn)用； 缺陷：易破碎2一次性塑料：常用聚苯乙烯，聚四氟乙烯； 缺陷：易產(chǎn)生劃痕，不宜反復(fù)運(yùn)用3微載體：由聚苯乙烯和聚丙烯酰胺制成的小球 體，附著面大，利于大量繁衍細(xì)胞4飼細(xì)胞Feeder Cells：也稱滋養(yǎng)細(xì)胞，如 用成纖維細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，

15、大劑量射 線照射，細(xì)胞失去增殖才干但尚存活 并有代謝活動(dòng)；再將其它細(xì)胞接種于 其上。飼細(xì)胞的代謝產(chǎn)物利于其它細(xì) 胞生長(zhǎng)八抑制細(xì)胞生長(zhǎng)要素制備培育基消毒不徹底：有毒物質(zhì)或微生物混入細(xì)胞生存環(huán)境中血清滅活：能除去培育基中的補(bǔ)體和降低免疫球蛋白的毒性，并不損傷多肽生長(zhǎng)因子，但能夠滅活另一些有用的成分六、細(xì)胞培育的設(shè)備與根本條件 實(shí)驗(yàn)用品：超凈任務(wù)臺(tái)，壓力蒸汽消毒器，電熱枯燥箱，濾器，酸缸CO2培育箱倒置顯微鏡酶標(biāo)儀、微孔板震蕩器液氮罐自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀耗 材：培育瓶，吸管，電動(dòng)吸引器，培育板，凍存管壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣電熱枯燥箱：干熱消毒160 ，2小時(shí)。主要用干玻璃器皿消毒 濾

16、 器：過(guò)濾除菌，大多數(shù)培育用液，如人工合成培育基、血清、酶液等均采用濾過(guò)法除菌 超凈任務(wù)臺(tái)：為細(xì)胞操作提供無(wú)菌環(huán)境紫外燈：紫外線消毒。主要用于培育室空氣、操作臺(tái)、塑料培育皿和培育板等外表消毒超凈臺(tái) 超凈任務(wù)臺(tái)的任務(wù)原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過(guò)高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化 凈化空氣徐徐經(jīng)過(guò)任務(wù)臺(tái)面，使任務(wù)臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。CO2培育箱 CO2培育箱設(shè)定的條件為37 ，5CO2 運(yùn)用CO2培育箱培育細(xì)胞時(shí)應(yīng)留意的問(wèn)題： 用螺旋口瓶培育細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微 松，以保證通氣 堅(jiān)持培育箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒90 ，14 h) 箱內(nèi)火菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以 堅(jiān)持箱內(nèi)濕度，避兔培育液

17、蒸發(fā)純水儀七、器械用于解剖動(dòng)物、取材和原代培育切割組織等解剖刀剪、鑷子、縫針線、持針器、止血鉗等八、培育器皿一玻璃瓶皿玻璃瓶：用于配制、儲(chǔ)存培育液、血清等培育瓶：用于培育細(xì)胞培育皿：用于培育和分別細(xì)胞吸管、離心管、燒瓶杯、量筒、漏斗、試管、注射器等二塑料瓶皿多孔培育板：適于做單細(xì)胞克隆、生長(zhǎng)曲線測(cè)定、藥物測(cè)試和單克隆抗體等研討：分為4、6、24、96孔板培育皿：培育瓶：適于在CO2培育箱中運(yùn)用九、培育基液一平衡鹽溶液：二天然培育基：血清、組織提取液、雞 血漿等三合成培育基 培育基培育液是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然培育基和合成培育基 天然培育基：天然培育基有血清、血漿、和組織提取液如雞胚和牛胚浸液優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培育效果好缺陷：來(lái)源受限。成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染 合成培育基:合成培育基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類(lèi)和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培育基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等合成培育基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)優(yōu)點(diǎn)：規(guī)范化消費(fèi)，組分和含量相對(duì)固定。本錢(qián)低 缺陷：短少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需求 人工合成培育基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁衍，還需補(bǔ)充一定量的天然培育基如血清 血清中含有： 多種蛋白質(zhì)白蛋白、球蛋白、