分子生物學(xué)核心筆記(共16頁(yè))

1、醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 九陰真經(jīng)PAGE PAGE - 17 -第一章第八章基因(jyn)genes：基因是負(fù)責(zé)(fz)編碼RNA或一條多肽鏈DNA片段，包括編碼序列、編碼序列外的側(cè)翼序列及插入序列。是決定遺傳性狀的功能單位。結(jié)構(gòu)(jigu)基因structure genes：基因中編碼RNA或蛋白質(zhì)的DNA序列稱(chēng)為結(jié)構(gòu)基因?；蚪Mgenome：一個(gè)細(xì)胞或病毒的全部遺傳信息。（細(xì)胞或生物體的一套完整單倍體的遺傳物質(zhì)的總和。）真核生物基因組是指一套完整單倍體DNA（染色體DNA）和線(xiàn)粒體DNA的全部序列，包括編碼序列和非編碼序列。GT-AG法則：真核生物基因的外顯子與內(nèi)含子接頭處都有一段高度保守的一致性

2、序列，即：內(nèi)含子5端大多數(shù)是以GT開(kāi)始，3端大多是以AG結(jié)束。端粒：以線(xiàn)性染色體形式存在的真核基因組DNA末端都有一種特殊的結(jié)構(gòu)叫端粒。該結(jié)構(gòu)是一段DNA序列和蛋白質(zhì)形成的一種復(fù)合體，僅在真核細(xì)胞染色體末端存在。端粒DNA由重復(fù)序列組成，人類(lèi)端粒一端是TTAGGG另一端是AATCCC.操縱子：是指數(shù)個(gè)功能上相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起，構(gòu)成信息區(qū)，連同其上游的調(diào)控區(qū)（包括啟動(dòng)子和操縱基因）以及下游的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)所構(gòu)成的基因表達(dá)單位。所轉(zhuǎn)錄的RNA為多順?lè)醋?。操縱元件：是一段能夠被不同基因表達(dá)調(diào)控蛋白質(zhì)識(shí)別和結(jié)合的DNA序列，是決定基因表達(dá)效率的關(guān)鍵元件。順式作用元件：是指那些與結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)

3、、能夠被基因調(diào)控蛋白特異性識(shí)別和結(jié)合的特異DNA序列。包括啟動(dòng)子、上游啟動(dòng)子元件、增強(qiáng)子、反應(yīng)元件和poly(A)加尾信號(hào)。反式作用因子：是指真核細(xì)胞內(nèi)含有的大量可以通過(guò)直接或間接結(jié)合順式作用元件而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)因子。蛋白質(zhì)折疊 翻譯后的蛋白質(zhì)需經(jīng)過(guò)一系列加工修飾才能轉(zhuǎn)變?yōu)橛刑烊粯?gòu)象和生物功能的蛋白質(zhì)。新生肽鏈在翻譯過(guò)程中或翻譯后經(jīng)過(guò)盤(pán)曲折疊形成天然構(gòu)象過(guò)程。啟動(dòng)子：是能夠被RNA聚合酶特異性識(shí)別并與其結(jié)合并開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。（TATAbox、CAATbox、GCbox）增強(qiáng)子enhancer：是一段短的DNA序列，其中含有多個(gè)作用元件，可以特異性地與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄

4、活性。它可位于被增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄基因的上游或下游，也可相距靶基因較遠(yuǎn)。多順?lè)醋觤RNA(polycistronic mRNA)即每一個(gè)mRNA分子帶有幾鐘蛋白質(zhì)的遺傳信息（來(lái)自幾個(gè)結(jié)構(gòu)基因），利用共同的啟動(dòng)子及終止信號(hào)，組成“操縱子”的基因表達(dá)調(diào)控單元。病毒基因組的特點(diǎn)：一、：種類(lèi)單一；病毒的核酸通常是DNA分子或者是RNA分子。二：RNA病毒基因組有單、雙鏈和正、負(fù)鏈之分。根據(jù)是否可以作為mRNA模板，指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成，分成正鏈RNA病毒和負(fù)鏈RNA病毒兩大類(lèi)。1、單股正鏈RNA病毒基因組可以作為mRNA行使模板功能：病毒顆粒中的RNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后，可直接作為mRNA，翻譯出所編碼的蛋白質(zhì)，包括衣

5、殼蛋白和病毒的RNA聚合酶。然后再病毒RNA聚合酶的作用下以病毒基因組RNA為模板合成出負(fù)鏈，在以負(fù)鏈為模板復(fù)制病毒RNA，并以復(fù)制的病毒RNA和衣殼蛋白自我裝配成為成熟的病毒顆粒。這些病毒稱(chēng)為單股正鏈RNA病毒。2單股負(fù)鏈RNA病毒需要先合成與其互補(bǔ)的MRNA：先以病毒基因組RNA為模板轉(zhuǎn)錄生成互補(bǔ)RNA，再以這個(gè)互補(bǔ)RNA作為mRNA翻譯出遺傳密碼所決定的蛋白質(zhì)。3、雙鏈RNA病毒基因組含有正、負(fù)兩條RNA鏈。4、部分RNA病毒基因組可以被反轉(zhuǎn)錄為DNA：有一類(lèi)特殊的單股正鏈RNA病毒，即逆轉(zhuǎn)錄病毒，在這些病毒顆粒中帶有依賴(lài)RNA的DNA聚合酶，即逆轉(zhuǎn)錄酶，能使RNA反向轉(zhuǎn)錄生成DNA。逆

6、轉(zhuǎn)錄病毒基因組一般包括三個(gè)基本的結(jié)構(gòu)基因，即：gag,pol,env，分別編碼核心蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶和膜蛋白。三、DNA病毒基因組有環(huán)狀DNA分子和線(xiàn)性DNA分子。四、其他：形式多樣、大小不一、基因重疊；、動(dòng)物/細(xì)菌病毒與真核/原核基因相似：內(nèi)含子；具有不規(guī)則的結(jié)構(gòu)基因；基因編碼區(qū)無(wú)間隔：通過(guò)宿主及病毒本身酶切；無(wú)帽狀結(jié)構(gòu)；結(jié)構(gòu)基因沒(méi)有翻譯起始序列。原核(yun h)基因組的特點(diǎn)：一、原核生物基因組通常僅由一條環(huán)狀雙鏈DNA分子組成；二、操縱子結(jié)構(gòu)是原核生物基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)之一：原核生物的絕大多數(shù)結(jié)構(gòu)基因按功能相關(guān)性成簇地串聯(lián)(chunlin)排列與染色體上，構(gòu)成信息區(qū)，連同其上游的調(diào)控區(qū)（包括啟

7、動(dòng)子和操縱基因）以及下游的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)構(gòu)成一個(gè)基因表達(dá)單位，即操縱子結(jié)構(gòu)。一個(gè)操縱子只含一個(gè)啟動(dòng)序列和數(shù)個(gè)可轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)基因。在同一個(gè)啟動(dòng)序列控制下，操縱子可轉(zhuǎn)錄出多順?lè)醋觤RNA。三、基因密度非常高，基因組序列中編碼區(qū)所占的比例較大?？杀磉_(dá)基因約50%，大于真核生物小于病毒。重復(fù)序列很少。四、在原核生物基因組中的非編碼區(qū)內(nèi)主要是一些調(diào)控序列。五、基因一般是連續(xù)的，無(wú)內(nèi)含子；六、細(xì)菌基因組中的可移動(dòng)成分能產(chǎn)生轉(zhuǎn)座現(xiàn)象。轉(zhuǎn)座因子的類(lèi)別和遺傳(ychun)效應(yīng)：細(xì)菌基因組中的可移動(dòng)成分能產(chǎn)生轉(zhuǎn)座現(xiàn)象。1、原核生物轉(zhuǎn)座因子可以分為：插入序列、轉(zhuǎn)座子、Mu噬菌體。2、轉(zhuǎn)座因子的幾個(gè)遺傳效應(yīng)。轉(zhuǎn)座因子的轉(zhuǎn)

8、座不是本身的移動(dòng)，而是由轉(zhuǎn)座因子復(fù)制出一個(gè)新的拷貝轉(zhuǎn)移到基因組中的新位置上去。新的轉(zhuǎn)座因子轉(zhuǎn)到靶點(diǎn)后，靶點(diǎn)序列會(huì)倍增為兩個(gè)靶點(diǎn)序列，并分別排列在轉(zhuǎn)座因子的兩側(cè)，形成同向重復(fù)序列。在轉(zhuǎn)座過(guò)程中能夠形成共同體。轉(zhuǎn)座因子轉(zhuǎn)座后能促使染色體畸變。轉(zhuǎn)座因子可以從原來(lái)的位置上切除，這個(gè)過(guò)程成為切離。轉(zhuǎn)座可引起插入突變。給受體基因組增添了新的標(biāo)志基因。真核基因組的特點(diǎn)：真核生物基因組遠(yuǎn)大于原核生物基因組，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，基因數(shù)龐大，具有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)；基因組由染色體DNA和染色體外DNA組成。真核基因?yàn)閱雾樂(lè)醋樱?xì)菌和病毒的結(jié)構(gòu)基因多為多順?lè)醋?；基因組中非編碼區(qū)多于編碼區(qū)；真核基因多為不連續(xù)的斷裂基因，由外顯子和

9、內(nèi)含子鑲嵌而成；存在大量的重復(fù)序列；功能相關(guān)的基因構(gòu)成各種基因家族；還存在一些假基因存在可移動(dòng)的遺傳因素；體細(xì)胞為雙倍體，而精子和卵子為單倍體。轉(zhuǎn)座子（transposon,Tn）這是一類(lèi)長(zhǎng)度在200020000bp之間較大的轉(zhuǎn)座因子，如Tn1681 Tn420.它們除了帶有與轉(zhuǎn)座有關(guān)的基因以外，還帶有其他基因，如Tn903 Tn5帶有卡那霉素抗藥基因等。質(zhì)粒plasmid:是存在于細(xì)菌 染色體外的、具有自主復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。衛(wèi)星DNA：是出現(xiàn)在非編碼區(qū)的串聯(lián)重復(fù)序列。其特點(diǎn)是具有固定的重復(fù)單位，該重復(fù)單位首尾相連形成重復(fù)序列片段，通常存在于間隔DNA和內(nèi)含子中。串聯(lián)重復(fù)序列是形成

10、衛(wèi)星DNA的基礎(chǔ)。分類(lèi)：大衛(wèi)星DNA、小衛(wèi)星DNA、微衛(wèi)星DNA?；匚慕Y(jié)構(gòu)：在DNA鏈上，兩個(gè)拷貝反向串聯(lián)在一起，中間沒(méi)有間隔序列。RFLP：即限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，個(gè)體之間DNA的核苷酸序列存在差異，稱(chēng)為DNA多態(tài)性。由于堿基組成的變化而改變了限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，從而導(dǎo)致相應(yīng)的限制性片段的長(zhǎng)度和數(shù)量發(fā)生變化，稱(chēng)為RFLP。多基因家族multigene family：核苷酸序列或編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)具有一定程度同源性的基因，其編碼產(chǎn)物常具有相似的功能。假基因pseudogene與某些有功能的基因結(jié)構(gòu)相似，但不能表達(dá)基因產(chǎn)物的基因。引起DNA損傷的因素及機(jī)制：1、紫外線(xiàn)引起DNA損傷：形成胸腺嘧啶

11、二聚體引起DNA之間的交聯(lián)、DNA與蛋白質(zhì)的交聯(lián)、甚至DNA鏈的斷裂。2、電力輻射引起DNA損傷：可導(dǎo)致堿基變化：由.OH自由基引起，包括DNA鏈上的堿基氧化修飾、過(guò)氧化物的形成、堿基環(huán)的破壞和脫落等可導(dǎo)致脫氧核糖的變化：脫氧核糖分解，最后可引起DNA鏈斷裂?？蓪?dǎo)致DNA斷裂：使脫氧核糖破壞或磷酸二酯鍵斷開(kāi)。引起DNA鏈交聯(lián)：包括DNA-DNA鏈間鏈內(nèi)交聯(lián)和DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)。3、烷化劑引起(ynq)DNA損傷：烷化劑導(dǎo)致(dozh)堿基烷基化烷化劑導(dǎo)致(dozh)堿基脫落烷化劑導(dǎo)致DNA斷鏈烷化劑導(dǎo)致DNA鏈交聯(lián)4、堿基類(lèi)似物、修飾劑引起堿基對(duì)的改變5、其他因素：丫啶類(lèi)化合物引起堿基插入和堿

12、基缺失；氧自由基。6、DNA也會(huì)產(chǎn)生自發(fā)性損傷：DNA復(fù)制時(shí)產(chǎn)生堿基錯(cuò)配；DNA修復(fù)使產(chǎn)生堿基錯(cuò)配；堿基自發(fā)改變導(dǎo)致DNA損傷：互變異構(gòu)位導(dǎo)致DNA突變；脫氨基作用導(dǎo)致DNA突變；堿基丟失導(dǎo)致DNA突變。DNA損傷（突變）可分為：鏈內(nèi)共價(jià)交聯(lián)、鏈間共價(jià)交聯(lián)、DNA鏈斷裂、堿基突變（轉(zhuǎn)換和顛換）、插入或缺失、DNA重組等。DNA損傷修復(fù)機(jī)制：1、某些DNA損傷可以直接修復(fù)：DNA斷裂口可以直接修復(fù)；二聚體可被光復(fù)活酶直接修復(fù)；烷基化堿基可以直接修復(fù)。2、切除修復(fù)是細(xì)胞內(nèi)最普遍的修復(fù)方式：過(guò)程 = 1 * GB3 識(shí)別：DNA特異內(nèi)切酶或糖苷酶識(shí)別DNA損傷位點(diǎn)； = 2 * GB3 切除：在損傷

13、位點(diǎn)的5上游切斷DNA鏈，沿5-3方向逐步切除DNA損傷部分合成：DNA聚合酶在缺口處催化DNA合成并沿5-3方向延伸連接：在DNA連接酶的作用下，新合成的DNA片段與原來(lái)的DNA鏈連接。切除修復(fù)可分為單個(gè)核苷酸切除修復(fù)和核苷酸片段切除修復(fù)。3、重組修復(fù)是DNA損傷較多時(shí)的修復(fù)方式4、SOS修復(fù)是DNA損傷嚴(yán)重時(shí)的應(yīng)急性修復(fù)方式。5、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)控制是真核生物誘導(dǎo)修復(fù)的主要機(jī)制基因表達(dá)：是指生物基因組中結(jié)構(gòu)基因所攜帶的遺傳信息經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯等一系列過(guò)程，合成特定的蛋白質(zhì)，進(jìn)而發(fā)揮其特定的生物學(xué)功能和生物學(xué)效應(yīng)的全過(guò)程。因子依賴(lài)性和非依賴(lài)性?xún)煞N機(jī)制介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的終止：1、不依賴(lài)因子的終止子有兩個(gè)重

14、要特征：一個(gè)反向重復(fù)序列，使RNA末端形成一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)在信息鏈上有一連串的T，因而RNA末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)之后緊接著出現(xiàn)一串U，RNA/DNA雜交分子的rU-dA堿基對(duì)結(jié)合力較弱，當(dāng)發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成時(shí)，RNA聚合酶停止移動(dòng)，RNA鏈從DNA上脫落。2、有一些基因的RNA轉(zhuǎn)錄終止階段依賴(lài)因子。當(dāng)RNA聚合酶移動(dòng)至終止子部位時(shí)，因子與其結(jié)合，并發(fā)揮ATP酶和解鏈酶活性，使RNA與DNA分離，轉(zhuǎn)錄過(guò)程終止。原核生物的tRNA轉(zhuǎn)錄后的加工：1、剪切作用將多順?lè)醋映跫?jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分離并切除多余序列；2、有些tRNA分子在3端需要修復(fù)或添加CCA序列；3、通過(guò)某些堿基的化學(xué)修飾在tRNA分子中形成希有堿基。蛋白質(zhì)編碼區(qū)

15、（開(kāi)放閱讀框ORF）:在mRNA的核苷酸序列中，有一段序列是一個(gè)特定蛋白質(zhì)多肽鏈的序列信息，這一段核苷酸序列從起始密碼子開(kāi)始、倒終止密碼子結(jié)束，稱(chēng)為蛋白質(zhì)編碼區(qū)或開(kāi)放閱讀框，此段核苷酸序列決定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。SD序列：mRNA起始密碼子AUG上游813個(gè)堿基處存在的一段特定的核苷酸序列，該序列稱(chēng)為SD序列，是mRNA的起始密碼子之所以能與小亞基定位結(jié)合的關(guān)鍵。SD序列與小亞基中16SrRNA3端的序列互補(bǔ)，當(dāng)mRNA與小亞基結(jié)合時(shí)，SD序列與16SrRNA3端的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合，使起始密碼子定位于翻譯起始部位。真核生物mRNA的加工：1、甲基化鳥(niǎo)苷酸以5端磷酸基團(tuán)連接mRNA5端形成帽子結(jié)構(gòu)

16、。2、多聚腺苷酸的加入形成mRNA的3尾。3、mRNA前體經(jīng)剪接過(guò)程除去內(nèi)含子序列。4、mRNA分子中的少數(shù)堿基可被甲基化。5、RNA編輯：是通過(guò)對(duì)mRNA的加工使遺傳信息在mRNA水平上發(fā)生改變。時(shí)間特異性：在多細(xì)胞生物從受精卵到組織、器官形成的各個(gè)不同發(fā)育階段，相應(yīng)基因嚴(yán)格按照一定時(shí)間順序開(kāi)啟或關(guān)閉，這就是基因表達(dá)的時(shí)間特異性。空間特異性：在個(gè)體生長(zhǎng)全過(guò)程，某種基因產(chǎn)物在個(gè)體按不同組織空間順序出現(xiàn)。分子(fnz)伴侶（伴侶蛋白）：是一類(lèi)序列上沒(méi)有相關(guān)性但有共同功能的保守性蛋白，他們?cè)诩?xì)胞內(nèi)能協(xié)助其他多肽結(jié)構(gòu)完成正確的折疊、組裝(z zhun)、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解。管家基因：在生物體生命的全過(guò)程都是

17、必須的，且在一個(gè)生物個(gè)體的幾乎所有細(xì)胞(xbo)中持續(xù)表達(dá)的基因。原核生物轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控：原核生物基因多以操縱子的形式存在。操縱子由調(diào)控區(qū)與信息區(qū)組成，上游是調(diào)控區(qū)，包括啟動(dòng)子與操縱元件兩部分。啟動(dòng)子是同RNA聚合酶結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的特異性DNA序列，操縱元件是特異的阻遏物結(jié)合區(qū)。1、啟動(dòng)子決定轉(zhuǎn)錄方向、模板鏈、轉(zhuǎn)錄效率。2、不同的因子可以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RNA聚合酶，打開(kāi)特定的一套基因。3、阻遏蛋白在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)基因表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用。4、正調(diào)控蛋白結(jié)合于特異DNA序列后促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。5、到位蛋白通過(guò)DNA重組倒位而調(diào)節(jié)基因表達(dá)、6、RNA聚合酶抑制物可與RNA結(jié)合并抑制轉(zhuǎn)錄。7、衰減子可以在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中

18、控制轉(zhuǎn)錄水平。嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)：細(xì)菌在缺乏氨基酸的環(huán)境中，RNA聚合酶活性降低，RNA合成減少或停止。衰減子attenuator：細(xì)菌中的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯合成是偶聯(lián)在一起的。這一特點(diǎn)使細(xì)菌的一些操縱子中的特殊序列可以在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中控制轉(zhuǎn)錄水平。這些特殊結(jié)構(gòu)稱(chēng)為衰減子。衰減子又稱(chēng)為弱化子，位于一些操縱子中第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因之前，是一段能減弱轉(zhuǎn)錄作用的順序。乳糖操縱子的作用機(jī)制1、乳糖操縱子（lac operon）的組成：大腸桿菌乳糖操縱子含Z、Y、A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別編碼半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶，此外還有一個(gè)操縱元件O，一個(gè)啟動(dòng)子P和一個(gè)調(diào)節(jié)基因I（是調(diào)節(jié)基因，編碼產(chǎn)生阻遏蛋白）。2、阻遏

19、蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)：沒(méi)有乳糖存在時(shí)，I基因編碼的阻遏蛋白結(jié)合于操縱序列O處，抑制RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合，乳糖操縱子處于阻遏狀態(tài)，不能合成分解乳糖的三種酶；有乳糖存在時(shí)，乳糖作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)阻遏蛋白變構(gòu)，不能結(jié)合于操縱序列，乳糖操縱子被誘導(dǎo)開(kāi)放合成分解乳糖的三種酶。所以，乳糖操縱子的這種調(diào)控機(jī)制為可誘導(dǎo)的負(fù)調(diào)控。3、CAP的正性調(diào)節(jié)：lac啟動(dòng)子是弱啟動(dòng)子，在啟動(dòng)子上游有CAP結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)大腸桿菌從以葡萄糖為碳源的環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)橐匀樘菫樘荚吹沫h(huán)境時(shí)，cAMP濃度升高，與CAP結(jié)合，使CAP發(fā)生變構(gòu)，CAP結(jié)合于乳糖操縱子啟動(dòng)序列附近的CAP結(jié)合位點(diǎn)，激活RNA聚合酶活性，促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合于

20、操縱子后促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)乳糖操縱子實(shí)行正調(diào)控，加速合成分解乳糖的三種酶。4、協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)：乳糖操縱子中的I基因編碼的阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控與CAP的正調(diào)控兩種機(jī)制，互相協(xié)調(diào)、互相制約。CAP：是大腸桿菌分解代謝物基因活化蛋白，這種蛋白可將葡萄糖饑餓信號(hào)傳遞個(gè)許多操縱子，使細(xì)菌在缺乏葡萄糖時(shí)可以利用其他能源。CAP結(jié)合DNA是由cAMP控制的。cAMP結(jié)合于CAP，誘導(dǎo)CAP發(fā)生構(gòu)象改變，使之能夠結(jié)合于特定的DNA序列，激活臨近基因的轉(zhuǎn)錄。cAMP水平降低時(shí)，cAMP與CAP解離，CAP轉(zhuǎn)回到無(wú)活性的構(gòu)象，并與DNA解離，這將關(guān)閉葡萄糖以外的其他的與糖代謝相關(guān)的操縱子。由于CAP的作用依賴(lài)于cAMP

21、，因此，CAP又稱(chēng)為cAMP受體蛋白。原核生物翻譯水平的調(diào)控：一、SD序列是影響翻譯的重要因素：1、SD序列的順序及位置影響翻譯起始效率。2、mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)可以屏蔽SD序列。二、mRNA的穩(wěn)定性（降解速度）是翻譯調(diào)控的另一重要機(jī)制。mRNA的5端與核糖體結(jié)合，可明顯提高其穩(wěn)定性。三、翻譯產(chǎn)物也可以對(duì)相應(yīng)的mRNA的翻譯進(jìn)行調(diào)控：1、核糖體蛋白控制其mRNA的翻譯。2、翻譯終止因子RF2調(diào)節(jié)自身的翻譯。四、小分子RNA可以抑制特定mRNA的翻譯?；蛑嘏牛褐改承┗蚱胃淖?cè)瓉?lái)存在順序，通過(guò)調(diào)整有關(guān)基因片段的銜接順序，再重排成為一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄單位。真核生物在轉(zhuǎn)錄水平(shupng)的調(diào)控：主要

22、是通過(guò)(tnggu)反式作用因子、順式作用元件和RNA聚合酶的相互作用來(lái)完成的，主要是反式作用因子結(jié)合順式作用元件后影響轉(zhuǎn)錄(zhun l)起始復(fù)合物的形成過(guò)程。一、轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成是轉(zhuǎn)錄的可調(diào)控環(huán)節(jié)：真核生物RNA聚合酶識(shí)別的是由通用轉(zhuǎn)錄因子與DNA形成的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，只有當(dāng)一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到DNA上，形成有功能的啟動(dòng)子，才能被RNA聚合酶所識(shí)別并結(jié)合。轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成過(guò)程為：TFD結(jié)合TATA盒；RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合TFD-DNA復(fù)合物形成一個(gè)閉合的復(fù)合物；其他轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶結(jié)合形成一個(gè)開(kāi)放復(fù)合物，開(kāi)放轉(zhuǎn)錄。二、反式作用因子是真核細(xì)胞內(nèi)重要的基因表達(dá)調(diào)控蛋白

23、。反式作用因子（trans-acting factor）：真核細(xì)胞內(nèi)含有的大量可以通過(guò)直接或間接結(jié)合順式作用元件而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)因子。在結(jié)構(gòu)上含有與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。在轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程中，反式作用因子的作用是：促進(jìn)或抑制TFD與TATA盒結(jié)合；促進(jìn)或抑制RNA聚合酶與TFD-DNA復(fù)合物的結(jié)合；促進(jìn)或抑制轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成。反式作用因子三個(gè)基本特征一般具有三個(gè)功能域：DNA識(shí)別結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄活性域和結(jié)合其他蛋白結(jié)合域；能識(shí)別并結(jié)合上游調(diào)控區(qū)中的順式作用元件；對(duì)基因的表達(dá)有正性或負(fù)性調(diào)控作用，激活和阻遏基因的表達(dá)。反式作用因子結(jié)構(gòu)域具有多種結(jié)構(gòu)模式：1、DNA結(jié)合域有不同的結(jié)構(gòu)模式：鋅指

24、結(jié)構(gòu)借助半胱氨酸和組氨酸與鋅離子結(jié)合；同源結(jié)構(gòu)域具有螺旋回折螺旋結(jié)構(gòu)：許多反式作用因子結(jié)合DNA的結(jié)構(gòu)域中具有一段相同的保守序列，是60個(gè)左右氨基酸組成的螺旋回折螺旋結(jié)構(gòu)的區(qū)域，稱(chēng)為同源結(jié)構(gòu)域（homeodomain,HD）,簡(jiǎn)稱(chēng)同源域。亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)使兩個(gè)單體結(jié)合并形成DNA結(jié)合域。螺旋-環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)易于形成二聚體堿性-螺旋含較多的堿性氨基酸。2、轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域是反式作用因子的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。其模型有：酸性-螺旋結(jié)構(gòu)。帶有負(fù)電荷的-螺旋區(qū)。富含谷氨酰胺結(jié)構(gòu)域存在于多種轉(zhuǎn)錄因子中。富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域 常與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相連。三、轉(zhuǎn)錄起始是由多種激活的反式作用因子進(jìn)行復(fù)合調(diào)控反式作用因子的活性調(diào)節(jié)：表

25、達(dá)式調(diào)節(jié)反式作用因子合成出來(lái)就具有活性；共價(jià)修飾磷酸化和去磷酸化，糖基化；配體結(jié)合許多激素受體是反式作用因子；蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)復(fù)合物的解離與形成。反式作用因子與順式作用元件的結(jié)合：反式作用因子被激活后，即可識(shí)別并結(jié)合上游啟動(dòng)子元件和增強(qiáng)子中的保守性序列，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起調(diào)節(jié)作用。反式作用因子的作用方式成環(huán)、扭曲、滑動(dòng)、Oozing。反式作用因子的組合式調(diào)控作用：每一種反式作用因子結(jié)合順式作用元件后雖然可以發(fā)揮促進(jìn)或抑制作用，但反式作用因子對(duì)基因調(diào)控不是由單一因子完成的而是幾種因子組合發(fā)揮特定的作用。真核生物轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控機(jī)制mRNA的加工和運(yùn)輸可形成轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控：5端加帽

26、和3端多聚腺苷酸化的調(diào)控意義：5端加帽和3端多聚腺苷酸化是保持mRNA穩(wěn)定的一個(gè)重要因素，它至少保證mRNA在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中不被降解。mRNA選擇性剪接對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的作用mRNA運(yùn)輸?shù)目刂普{(diào)節(jié)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的mRNA量。MRNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯和降解偶聯(lián)進(jìn)行 在細(xì)菌中，轉(zhuǎn)錄和翻譯在細(xì)胞內(nèi)的同一部位進(jìn)行，這兩過(guò)程是緊密聯(lián)系、同時(shí)進(jìn)行的。RNA聚合酶結(jié)合到DNA上開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，并沿著DNA移動(dòng)，合成RNA，一旦轉(zhuǎn)錄開(kāi)始，核糖體就會(huì)結(jié)合到MRNA的5端并開(kāi)始翻譯。大部分細(xì)菌mRNA都非常不穩(wěn)定，開(kāi)始轉(zhuǎn)錄后很快就開(kāi)始降解，mRNA的穩(wěn)定性對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量有很大的影響。磷酸化-去磷酸化決定(judng)蛋白質(zhì)的

27、活性狀態(tài) 磷酸化修飾是蛋白質(zhì)共價(jià)(n ji)修飾的一種重要方式，包括磷酸化和去磷酸化兩種反應(yīng)。這種修飾決定特定蛋白質(zhì)的活性狀態(tài)。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化分別由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化完成。蛋白激酶具有轉(zhuǎn)磷酸基的功能，它能將ATP分子中的-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)分子中，使ATP轉(zhuǎn)變成ADP，蛋白質(zhì)則被磷酸化。磷蛋白磷酸酶是一種去磷酸酶，它能將磷酸化蛋白的磷酸基水解下來(lái)(xi li)，使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)槿チ姿峄癄顟B(tài)。第九章 細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)信息分子：攜帶生物信息，在細(xì)胞之間進(jìn)行傳遞的小分子化學(xué)物質(zhì)受體：靶細(xì)胞中能夠被體內(nèi)一些生物活性物質(zhì)如激素、細(xì)胞因子所識(shí)別，并與之結(jié)合將信號(hào)傳至細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生生物效應(yīng)的物質(zhì)，也

28、即細(xì)胞接受細(xì)胞外信號(hào)的接收裝置，直接參與細(xì)胞的信息傳遞。受體的化學(xué)性質(zhì)主要為蛋白質(zhì)。受體的作用：1、識(shí)別外源性信息分子，與受體相對(duì)應(yīng)，信息分子亦可以稱(chēng)為配體；2、將配體的信號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，使之稱(chēng)為細(xì)胞內(nèi)分子可以識(shí)別的信號(hào)，并傳遞到其他分子，引起細(xì)胞的應(yīng)答。受體與信息分子的結(jié)合特點(diǎn)：高度親和力、高度特異性、可逆行、可飽和性、放大效應(yīng)。受體的分類(lèi)：1、細(xì)胞表面受體：水溶性、表面信號(hào)分子：離子通道受體、G蛋白偶聯(lián)受體、單次跨膜受體。2、細(xì)胞內(nèi)受體：脂溶性化學(xué)信號(hào)?？梢晕挥诩?xì)胞質(zhì)也可以位于細(xì)胞核內(nèi)。蛋白激酶（protein kinase）：能夠?qū)?磷酸基團(tuán)從磷酸供體分子上轉(zhuǎn)移至底物蛋白的氨基酸受體上的一大

29、類(lèi)酶。蛋白磷酸酶（protein phosphatase）是具有催化已經(jīng)磷酸化的蛋白質(zhì)分子發(fā)生去磷酸化反應(yīng)的一類(lèi)酶分子，與蛋白激酶相對(duì)應(yīng)存在，共同構(gòu)成磷酸化與去磷酸化這一重要的蛋白質(zhì)活性的開(kāi)關(guān)系統(tǒng)。對(duì)蛋白激酶所引起的變化產(chǎn)生衰減信號(hào)接頭蛋白也稱(chēng)調(diào)控結(jié)合元件(modular binding domain) 即信號(hào)分子中存在著的一些特殊的結(jié)構(gòu)域，大約50-100個(gè)氨基酸構(gòu)成，信號(hào)分子通過(guò)這些特殊結(jié)構(gòu)域相互識(shí)別和作用而有序銜接，形成不同的信號(hào)傳遞鏈。SH2結(jié)構(gòu)域 信號(hào)分子與含磷酸酪氨酸蛋白分子SH3結(jié)構(gòu)域 信號(hào)分子與含脯氨酸蛋白分子PH結(jié)構(gòu)域 磷脂分子PIP2、PIP3PTB結(jié)構(gòu)域 同SH2 ：信號(hào)

30、分子與含磷酸酪氨酸蛋白分子G蛋白的循環(huán)和活化：一、G蛋白的組成 三聚體G蛋白由、三種亞基組成。亞基具有GTP水解酶活性，又有調(diào)節(jié)效應(yīng)蛋白作用，和亞基具有調(diào)節(jié)亞基作用，也有調(diào)節(jié)效應(yīng)蛋白的作用，而且亞基上有脂鏈，故具有固定作用。這三個(gè)亞基可以聚合在一起形成三聚體，也可以解離為和形式。當(dāng)G蛋白與GDP相結(jié)合時(shí)無(wú)活性，而與GTP結(jié)合時(shí)則活化成激活狀態(tài)。 二、G蛋白循環(huán)受體與信息分子結(jié)合后，受體構(gòu)象改變，并使與受體相偶聯(lián)的G蛋白構(gòu)象改變，使GTP置換了GDP。G蛋白激活后，離開(kāi)受體并解離成和亞基GTP，亞基水解GTP，并調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶的活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cAMP等第二信使的濃度，從而把信息傳導(dǎo)給下游分子

31、，同時(shí)，與亞基結(jié)合的GTP水解成GDP，然后亞基GDP復(fù)合物重新與亞基結(jié)合形成無(wú)活性的三聚體，完成一次信息傳導(dǎo)。G蛋白這種有活性和無(wú)活性狀態(tài)的轉(zhuǎn)換稱(chēng)為G蛋白循環(huán)與轉(zhuǎn)錄因子偶聯(lián)的受體： 多位于胞內(nèi)，與一些疏水性信息分子相識(shí)別，如類(lèi)固醇激素、甲狀腺素、前列腺素、維生素A等。這種受體主要包括三個(gè)區(qū)域，羧基端為激素等信息分子的結(jié)合區(qū)域，氨基端為轉(zhuǎn)錄活化區(qū)，調(diào)控某些基因的啟動(dòng)子或上游的調(diào)控基因，中央部分為DNA的結(jié)合區(qū)，富含堿性氨基酸，平時(shí)此區(qū)與抑制蛋白結(jié)合形成復(fù)合物。受體與信息分子結(jié)合時(shí)，發(fā)生構(gòu)象變化，抑制蛋白脫落，暴露出DNA的結(jié)合區(qū)，轉(zhuǎn)入胞核內(nèi)，與特定DNA部位結(jié)合，調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性。cAMPPKA

32、途徑(tjng)-活化(huhu)：信號(hào)分子與受體結(jié)合(jih)，引起受體構(gòu)象變化受體活化G蛋白（結(jié)合GTP，與解離）活化后的G蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶（AC）AC催化ATP生成cAMPcAMP活化PKA（依賴(lài)cAMP的蛋白激酶）PKA使目標(biāo)蛋白磷酸化，調(diào)節(jié)代謝酶的活性或調(diào)節(jié)基因的表達(dá)cAMPPKA途徑-失活：信息分子與受體解離，受體失活G蛋白失活（GTP被水解成GDP，亞基重新聚合）AC失活cAMP被磷酸二酯酶水解PKA失活胰島素受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路（一）胰島素受體介導(dǎo)的IRS-1-Ras-MAPK信號(hào)通路：這一通路主要涉及胰島素受體的基因表達(dá)調(diào)控的信號(hào)傳導(dǎo)。步驟：1、受體二聚體的形成及其磷酸

33、化。2、募集接頭蛋白Grb2。3、Grb2的SH3募集SOS.4、Ras的活化。5、MAPK的級(jí)聯(lián)激活。6、轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。（二）胰島素受體介導(dǎo)的IRS-PI3K-PKB信號(hào)通路：此通路與胰島素對(duì)代謝的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，與細(xì)胞存活密切相關(guān)。步驟：1、PI3K的p85亞單位通過(guò)SH2結(jié)構(gòu)域與發(fā)生了洛氨酸磷酸化的IRS-1結(jié)合，p110催化亞單位激活。2、活化的PI3K催化PIP2磷酸化（D-3）生成PIP3。3、PIP3與PKB的PH（pleckstrin-homology domain）功能區(qū)結(jié)合，PKB構(gòu)象變化并轉(zhuǎn)位到胞膜，同時(shí)PIP3依賴(lài)的蛋白激酶（PDK）也與PIP3結(jié)合，

34、使二者相互靠近。4、PDK催化PKB發(fā)生磷酸化，激活PKB。5、PKB可磷酸化多種蛋白，介導(dǎo)代謝調(diào)節(jié)、細(xì)胞存活等效應(yīng)。細(xì)胞通訊方式 1)細(xì)胞間隙連接通訊 兩個(gè)相鄰的細(xì)胞間通過(guò)管道狀的親水性孔道自由交換分子質(zhì)量1500以下的水溶性分子2)膜表面分子接觸通訊 每個(gè)細(xì)胞都有眾多的蛋白質(zhì)或糖蛋白、蛋白聚糖分子分布于質(zhì)膜的外表面。這些表面分子作為細(xì)胞的觸角，可以與相鄰細(xì)胞的膜表面分子特異性相互識(shí)別和相互作用，以達(dá)到功能上相互協(xié)調(diào)，即為膜表面分子接觸通訊。3）化學(xué)信號(hào)介導(dǎo)的通訊 多細(xì)胞生物與鄰近細(xì)胞或相對(duì)較遠(yuǎn)距離的細(xì)胞之間的信息交流主要是由細(xì)胞所分泌的化學(xué)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)或小分子有機(jī)化合物所完成的。這些分子

35、稱(chēng)為化學(xué)信號(hào)。它們作用于周?chē)蚓嚯x較遠(yuǎn)的期貨種類(lèi)細(xì)胞，調(diào)節(jié)其功能，這種通訊方式稱(chēng)為化學(xué)通訊。第十章 細(xì)胞增生和凋亡的分子機(jī)制細(xì)胞周期中的四個(gè)checkpoint:（1）G1晚期 限制點(diǎn) 監(jiān)控G1期細(xì)胞大小及環(huán)境中是否有生長(zhǎng)因子（2）G1S 轉(zhuǎn)折 監(jiān)控DNA是否損傷（3）G2 M 轉(zhuǎn)折 監(jiān)控DNA是否損傷、DNA是否已正確完整地復(fù)制。（4）有絲分裂中期關(guān)卡 監(jiān)控姐妹染色單體是否已穩(wěn)定的附著在紡錘體上。參與細(xì)胞周期調(diào)控的蛋白質(zhì)1、周期蛋白（cyclin) 2、周期蛋白依賴(lài)性激酶（Cdk）3、周期蛋白-周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制因子（CKI）4、Rb蛋白及E2F-DP1轉(zhuǎn)錄因子5、調(diào)節(jié)CdK磷酸化和去磷

36、酸化的蛋白激酶和磷酸酶6、泛素（ubiquitin）和使蛋白泛素化的酶（一）cyclin和Cdk復(fù)合物驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程 周期蛋白B和Cdk1的復(fù)合物又稱(chēng)成熟促進(jìn)因子。 Cdk 是種蛋白激酶，單獨(dú)存在的Cdk無(wú)活性，與相應(yīng)的cyclin結(jié)合后變構(gòu)而激活，并受磷酸化和去磷酸化的調(diào)控在有無(wú)活性間轉(zhuǎn)換，有活性的Cdk 復(fù)合物能夠磷酸化底物蛋白，調(diào)控它們的活性，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期，而 Cdk 復(fù)合物的活性又受CKI的抑制。（二）CKI抑制Cdk1及周期蛋白-Cdk復(fù)合物的活性CKI分類(lèi)：Ink 4 家族：p15,p16,p18,p19蛋白。主要抑制Cdk4或Cdk6，抑制cyclin D與Cdk4或Cdk6結(jié)

37、合，也抑制其復(fù)合物利用ATP磷酸化底物的功能。Cip/Kip 家族： p21,p27,p57蛋白。是細(xì)胞接受到接觸抑制、DNA損傷、低氧或某些細(xì)胞因子信號(hào)后的產(chǎn)物，主要功能是與cyclin Cdk復(fù)合物結(jié)合，抑制它們的活性。（三）Rb蛋白與E2F-DP1結(jié)合，使E2F-DP1不能引起基因的轉(zhuǎn)錄，起負(fù)調(diào)控的作用。（四）使Cdk磷酸化和去磷酸化的酶也調(diào)節(jié)Cdk活性（五）泛素-蛋白酶體介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解也起調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用。周期(zhuq)蛋白：是一類(lèi)呈細(xì)胞周期特異性或時(shí)相性表達(dá)、累積(lij)與分解的蛋白質(zhì)，它與周期素依賴(lài)性激酶共同影響細(xì)胞周期的運(yùn)行。調(diào)控蛋白的協(xié)同(xitng)作用（一）Cdk4/

38、6和Cdk2的活化是限制點(diǎn)處調(diào)控的關(guān)鍵因素分別與cyclin D、E先后結(jié)合，導(dǎo)致RB磷酸化釋放E2F-DP1，靶基因轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞由G1S，然后cyclin D、E經(jīng)SCF復(fù)合物多泛素化而降解。（二）Cdk1的活化是G2M關(guān)卡處關(guān)鍵調(diào)控因素cyclin B與Cdk1結(jié)合，導(dǎo)致底物蛋白的磷酸化，G2 M。（三）APC介導(dǎo)多泛素化蛋白降解是細(xì)胞離開(kāi)M期進(jìn)入G1期的關(guān)鍵調(diào)控因素 cyclin A/B Cdk1 APC磷酸化連接姐妹染色體蛋白降解， M G1。（四）DNA損傷關(guān)卡致G1、G2期停滯 1 、通過(guò)系列磷酸化導(dǎo)致G2停滯 DNA損傷 活化ATM和ATR 磷酸化Chk2和Chk1cdc25C 與

39、14-3-3結(jié)合cdc25C無(wú)法活化Cdk1 G2停滯DNA修復(fù)。 2、P53致G1、G2停滯 細(xì)胞凋亡（apoptosis)：是機(jī)體細(xì)胞在正常生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)的程序性死亡過(guò)程，它的發(fā)生受機(jī)體的嚴(yán)密調(diào)控。細(xì)胞凋亡的形態(tài)特點(diǎn)：染色體固縮、膜起泡、核膜消失、DNA斷裂凋亡小體形成。主要的細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（一）外源性死亡受體途徑的關(guān)鍵步驟是死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物的形成 有8種受體，都屬于TNF家族成員。 Fas結(jié)合Fas LFas 三聚體，激活死亡結(jié)構(gòu)域募集FADD分子 Fas-FasL-FADD 死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC），并激活死亡效應(yīng)域caspase 8自我激活激活caspa

40、se 3 細(xì)胞凋亡。（二）內(nèi)源性線(xiàn)粒體途徑的關(guān)鍵步驟是細(xì)胞色素C從線(xiàn)粒體膜間隙釋放到細(xì)胞漿 進(jìn)入胞漿的細(xì)胞色素C與Apaf 1、ATP/dATP結(jié)合形成凋亡體（apoptosome） Apaf 1通過(guò)胱天蛋白酶募集域（CARD）與caspase 9前體的CARD相互作用而募集caspase 9前體 caspase 9自我激活激活caspase 3 細(xì)胞凋亡。（三）正、負(fù)調(diào)節(jié)和兩條凋亡途徑的串話(huà)第十七章 細(xì)胞增生和凋亡相關(guān)基因與疾病原癌基因（proto-oncogene)是一類(lèi)廣泛存在生物體中，高度保守的基因，其產(chǎn)物具有調(diào)控細(xì)胞增生的重要功能，當(dāng)其受某些因素的影響，能發(fā)生突變（活化）成為癌基因，

41、導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。原癌基因的特點(diǎn)：1、廣泛存在于生物體；2、高度保守，功能相似；3、產(chǎn)物有重要功能；4、某些因素作用下，可發(fā)生突變，使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。原癌基因的產(chǎn)物：是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵分子。生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)因子受體、非受體洛氨酸蛋白激酶、G蛋白。原癌基因的活化(huhu)機(jī)制：1、點(diǎn)突變(tbin)2、基因(jyn)擴(kuò)增3、基因重排4、染色體易位5、插入誘變癌基因的功能： 1、轉(zhuǎn)化（transformation)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，持續(xù)增生。調(diào)控轉(zhuǎn)化的原癌基因產(chǎn)物主要是位于細(xì)胞及胞漿。2、永生化（immortalization) 細(xì)胞分化受阻，不衰老死亡。調(diào)控永生化的原癌基因產(chǎn)物主要是位

42、于細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子。抑癌基因（tumor suppressor gene）：指存在于正常細(xì)胞內(nèi)的一大類(lèi)可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并具有潛在抑癌作用的基因，當(dāng)這類(lèi)基因發(fā)生突變、缺失或失活時(shí)，可引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。抑癌基因的作用：1、RB和P53調(diào)節(jié)細(xì)胞周期關(guān)卡 1）低磷酸化的RB蛋白能阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期2）正常細(xì)胞受持續(xù)的細(xì)胞分裂因素刺激后p16基因表達(dá)，p16蛋白抑制Ddk4/6 3）p16基因座位中還有p14ARF基因，它與p16基因部分重疊，能與p16基因一起表達(dá)4）DNA損傷也能活化p53基因表達(dá)5）p53能使細(xì)胞周期停滯及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，此外還可活化p21基因表達(dá)，起抑制周期蛋

43、白-Cdk復(fù)合物的作用2、調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制細(xì)胞增生3、促進(jìn)DNA修復(fù)維持基因組穩(wěn)定第十一章 基因分析的基本策略Sanger雙脫氧鏈末端終止法原理： 在DNA聚合酶催化下，以單鏈或雙鏈DNA為模板，采用DNA引物引導(dǎo)新鏈DNA的合成。DNA鏈中核苷酸以3,5-磷酸二酯鍵連接，合成DNA所用的底物是 2-脫氧核苷三磷酸。2,3ddNTP與普通dNTP不同，它們?cè)诿撗鹾颂堑?位置缺少一個(gè)羥基。在DNA聚合酶作用下通過(guò)三磷酸基團(tuán)摻入到延伸的DNA鏈中，但由于沒(méi)有3羥基，不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，因此，正在延伸的DNA鏈不能繼續(xù)延伸。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳就可以分辨出具有特定末端不同長(zhǎng)度的DN

44、A片段。Maxam-Gilbert化學(xué)裂解法原理：用化學(xué)試劑處理具末端放射性標(biāo)記的DNA片段，造成堿基的特異性切割，產(chǎn)生一組具有不同長(zhǎng)度的DNA鏈的反應(yīng)混合物，經(jīng)電泳分離得出待測(cè)DNA片段的核苷酸序列?；蚩截悢?shù)的分析Southern Blot原理：根據(jù)基因序列合成探針，利用同源互補(bǔ)序列可以退火形成異源雙鏈的原理，探測(cè)檢測(cè)對(duì)象中能與探針結(jié)合的DNA序列。Southern blot的基本步驟：DNA的酶切消化和基因探針的標(biāo)記；酶切消化：要保證基因的完整性。 探針標(biāo)記：探針序列的確定和檢測(cè)信號(hào)的選擇。Northern blot定性分析mRNA。 技術(shù)的關(guān)鍵是在于 RNA的制備和（變性）電泳。PCR

45、技術(shù)的基本原理：作為引物的一對(duì)寡核苷酸與模板DNA同源序列按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則形成局部雙鏈，然后在TaqDNA聚合酶作用下引導(dǎo)新鏈DNA的合成，經(jīng)過(guò)25-30個(gè)變性、退火和延伸的循環(huán)，獲得特異性的DNA片段擴(kuò)增產(chǎn)物。RT-PCR技術(shù)：以RNA為模板體外擴(kuò)增cDNA 的技術(shù)，可用于定性和相對(duì)定量（半定量）。 基本步驟：提取總RNA，然后將其中的mRNA在體外逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行特定基因的PCR擴(kuò)增。轉(zhuǎn)錄后RNA剪接的分析RNA酶保護(hù)試驗(yàn)（RPA）：是一種液相雜交技術(shù)，通過(guò)RNase A 和RNase T1專(zhuān)一性降解單鏈RNA，分析受到保護(hù)的雜交雙鏈RNA，以確定RNA的剪接情

46、況、剪接位點(diǎn)以及基因內(nèi)含子的可能位置等。蛋白質(zhì)的定性定量分析：指的是對(duì)特定基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的定性和定量及定位分析。一、從總蛋白質(zhì)中鑒定特定的蛋白質(zhì)Western blot 技術(shù)(jsh)：是一種免疫印跡技術(shù)(jsh)，以偶連標(biāo)記物的抗體分子作為探針，檢測(cè)轉(zhuǎn)移到固相支持物上的蛋白質(zhì)分子?；静襟E：蛋白質(zhì)樣品的制備和SDS電泳分離，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜，標(biāo)記的抗體與膜上蛋白質(zhì)進(jìn)行抗原抗體的結(jié)合，檢測(cè)(jin c)并分析標(biāo)記物信號(hào)。（在樣品中蛋白質(zhì)表達(dá)水平很低時(shí)，可通過(guò)免疫沉淀收集蛋白質(zhì)。）二、在細(xì)胞水平分析特定蛋白質(zhì)流式細(xì)胞術(shù)：用熒光標(biāo)記的抗體結(jié)合細(xì)胞表面或內(nèi)部的特定蛋白質(zhì)分子（抗原），經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀分析熒光

47、信號(hào)，從而根據(jù)細(xì)胞表達(dá)特定蛋白質(zhì)的情況對(duì)基因的表達(dá)活性作出判斷。三、細(xì)胞定位分析特定的蛋白質(zhì)免疫組織化學(xué)（或免疫細(xì)胞化學(xué)）技術(shù)基本步驟：抗體的制備與標(biāo)記，標(biāo)本（組織或細(xì)胞）的制備，組化染色和結(jié)果的觀(guān)察。第十二章 基因功能分析的基本策略特定基因功能研究的基本策略：通過(guò)特定基因的導(dǎo)入和特定基因的剔除或表達(dá)的抑制，制備模式生物體或體外培養(yǎng)的細(xì)胞模型，觀(guān)察和檢測(cè)其表型（包括整體、細(xì)胞、分子水平）的變化，從而分析、鑒定特定基因的功能。轉(zhuǎn)基因模型包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型和轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞模型。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgenic animal）:應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育的攜帶外源基因并能穩(wěn)定遺傳的動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因技術(shù) 是指將外源

48、基因?qū)胧芫鸭?xì)胞或胚胎干細(xì)胞中，通過(guò)外源基因與細(xì)胞染色體DNA間隨機(jī)重組的發(fā)生而將外源基因插入到受體染色體DNA中，并隨著細(xì)胞的分裂而遺傳給后代，以這種方式可以制造轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備基本步驟：將目的基因（或基因組片段）導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的受精卵（或著床前胚胎細(xì)胞），然后將其植入受體動(dòng)物的輸卵管或子宮中，發(fā)育成攜帶有外源基因的個(gè)體，并通過(guò)分析其基因組中外源基因的整合狀況及其揭示外源基因功能的表型，在此基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)常規(guī)的遺傳育種方法培育出轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用：1、確定特定基因的功能 2、發(fā)現(xiàn)新基因功能 3、發(fā)現(xiàn)新基因（突變） 4、研究基因表達(dá)的時(shí)空性 5、建立動(dòng)物模型 6、產(chǎn)生需要

49、的器官或組織基因敲除（gene knockout）：指通過(guò)DNA同源重組定向地將外源基因替換宿主細(xì)胞染色體DNA中特定的基因，從而使特定的基因在細(xì)胞內(nèi)或生物體內(nèi)失活的過(guò)程1打靶載體的構(gòu)建：同源序列要足夠長(zhǎng)，要含有篩選用的標(biāo)志基因。2 胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng)3打靶載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞4同源重組胚胎干細(xì)胞的篩選5基因敲除胚胎干細(xì)胞注射入胚泡6胚泡植入假孕小鼠的子宮中7雜交育種獲得純合的基因敲除動(dòng)物基因敲除動(dòng)物（gene knockout animal）：采用同源重組定向剔除特定基因的技術(shù)，所制備的某特定基因喪失功能的動(dòng)物?；蚯贸∈螅簯?yīng)用基因敲除技術(shù)，使兩條染色體上特定等位基因都喪失功能的小鼠?；?/p>

50、表達(dá)的抑制或沉默是通過(guò)在RNA水平的干涉來(lái)分析特定基因功能的方法。（1）反義RNA封閉目標(biāo)RNA的功能 （2）RNA干涉（RNA interference, RNAi） 使特定基因沉默。反義RNA（antisence RNA)：能與mRNA互補(bǔ)配對(duì)的RNA分子。兩種方法：1、人工合成反義RNA導(dǎo)入細(xì)胞抑制mRNA 2、構(gòu)建載體導(dǎo)入細(xì)胞轉(zhuǎn)錄反義RNA 抑制mRNARNA干涉是指由短雙鏈RNA誘導(dǎo)的同源mRNA的降解過(guò)程，可使基因表達(dá)受到抑制。原理：雙鏈RNA 激活Dicer（ 酶復(fù)合物，由核酸內(nèi)切酶和解旋酶組成），識(shí)別異常的雙鏈RNA并將其切割成短雙鏈RNA（siRNA，21-23bp）， si

51、RNA與Dicer結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC），雙鏈RNA經(jīng)解旋酶作用，成為單鏈RNA，識(shí)別并結(jié)合靶RNA分子，致核酸內(nèi)切酶的切割，失去編碼蛋白質(zhì)的功能。兩個(gè)步驟：1、長(zhǎng)雙鏈RNA成為小干涉性RNA （SiRNA); 2、RISC形成，識(shí)別SiRNA同源的mRNA ，并切割。選擇(xunz)目標(biāo)RNA干涉(gnsh)靶點(diǎn)的注意點(diǎn)：1、避開(kāi)蛋白(dnbi)結(jié)合部位，選擇AUG下游50-100bp區(qū)的AA（N19）TT或AA（N21）序列；2、GC比50%左右，長(zhǎng)30nt；3、與其它RNA序列無(wú)同源性。主要步驟：1、確定目標(biāo)RNA并選擇被干涉靶點(diǎn)；2、準(zhǔn)備針對(duì)目標(biāo)RNA的siRNA；3

52、、用siRNA干涉目標(biāo)RNA;4、目標(biāo)RNA含量和蛋白質(zhì)水平的分析。不同的基因突變類(lèi)型引起不同的遺傳效應(yīng) 1?；蛲蛔円疬z傳密碼的改變 1）錯(cuò)義突變是能導(dǎo)致蛋白質(zhì)氨基酸組成和排列順序發(fā)生改變的基因突變2）無(wú)義突變是能導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止的基因突變3）同義突變是不引起蛋白質(zhì)氨基酸組成和排列順序發(fā)生任何改變的基因突變4）移碼突變是使閱讀框移動(dòng)的基因突變2?；蛲蛔冇绊慼nRNA的剪接 如果基因變導(dǎo)師發(fā)生在特定剪接位點(diǎn)上，就會(huì)影響hnRNA的剪接，導(dǎo)致剪接錯(cuò)誤，產(chǎn)生異常的mRNA，最終產(chǎn)生異常的蛋白表達(dá)產(chǎn)物，改變相應(yīng)的生物學(xué)形狀?；蛲蛔?在基因的特定DNA序列中，其堿基組成及排列順序可因機(jī)體內(nèi)外

53、因素的作用發(fā)生改變，導(dǎo)致DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，改變基因結(jié)構(gòu)，形成基因突變?；蛲蛔兊念?lèi)型 1。點(diǎn)突變是單個(gè)堿基的突變2。缺失是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的丟失3。插入是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的增加4。倒位是一段核苷酸序列方向倒轉(zhuǎn)5基因突變還可分為配子突變與體細(xì)胞突變6。動(dòng)態(tài)突變指重復(fù)拷貝數(shù)隨世代的傳遞而改變第十三章 基因工程DNA 重組（DNA recombination）：不同來(lái)源的DNA分子通過(guò)共價(jià)連接（磷酸二酯鍵）而組合成新的DNA分子，這一過(guò)程稱(chēng)為DNA重組。重組DNA技術(shù)又稱(chēng)為分子克隆技術(shù)或基因工程技術(shù)。分子克隆：在體外對(duì)DNA分子按照既定目的和方案進(jìn)行人工重組，將重組分子導(dǎo)入宿主，使其在宿主中擴(kuò)

54、增和繁殖，以獲得該DNA分子的大量拷貝?；蚬こ?genetic engineering)：有目的地通過(guò)分子克隆技術(shù)，利用克隆基因表達(dá)、制備特定的蛋白或多肽產(chǎn)物，或定向改造基因結(jié)構(gòu)所用的方法及相關(guān)的工作統(tǒng)稱(chēng)為基因工程。基因工程的研究?jī)?nèi)容：1.目的基因的獲取：從生物有機(jī)體的基因組中分離帶有目的基因的DNA片段；2.重組：在體外將帶有目的基因的DNA片段連接到能自我復(fù)制并具有選擇標(biāo)志的載體分子上，形成重組分子；3.將重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞（細(xì)菌）:K-12。4.帶有重組子的細(xì)菌擴(kuò)增，獲得大量的繁殖群體。5.篩選：從大量的細(xì)胞繁殖群體中篩選出帶有重組DNA分子的克隆。6.分析和表達(dá)：將選出的細(xì)胞克隆的

55、目的基因進(jìn)行進(jìn)一步分析并實(shí)現(xiàn)功能蛋白的表達(dá)分子克隆常用的工具酶：一、限制性核酸內(nèi)切酶（RE）：是細(xì)菌產(chǎn)生的一類(lèi)能識(shí)別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)特定的堿基順序的核酸水解酶。分類(lèi)：可分為、型三大類(lèi)。型酶作用特點(diǎn)：只有限制性活性，無(wú)甲基化活性；只需Mg+作為催化反應(yīng)輔助因子，無(wú)須。識(shí)別順序一般為46個(gè)堿基，通常是回文結(jié)構(gòu)（反轉(zhuǎn)重復(fù)順序），即具有180的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)。二、DNA連接酶（DNA Ligase）：T4 DNA Ligase。催化兩個(gè)獨(dú)立雙鏈DNA片段5-磷酸基和3-羥基之間形成磷酸二酯鍵；修復(fù)雙鏈DNA中一條鏈上的缺口。三、DNA聚合酶（DNA Polymerase）1、DNA polymeras

56、e I （全酶，Kornberg polymerase）具有至少3種活性： 53聚合酶活性；5 3外切酶活性；3 5外切酶活性。應(yīng)用：1、催化DNA缺口平移（nick translation）反應(yīng)，制備高比活DNA探針；2. 第二cDNA鏈合成3. 對(duì)雙鏈DNA3突出末端進(jìn)行末端標(biāo)記；4. Sanger 測(cè)序 2、大腸桿菌DNA聚合酶klenow片段：53聚合酶；3 5外切酶；缺失53外切酶活性 應(yīng)用：全酶第2-4。四、逆轉(zhuǎn)錄酶 （reverse transcriptase）依賴(lài)于RNA的DNA聚合酶，這是一種有效的轉(zhuǎn)錄RNA成為DNA的酶，產(chǎn)物DNA又稱(chēng)cDNA（complementary

57、DNA）。用于mRNA為模板合成cDNA，是構(gòu)建cDNA文庫(kù)和RT-PCR技術(shù)中的關(guān)鍵工具酶。五、末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）:將dNTP加到DNA3羥基。作用：3端標(biāo)記DNA探針在載體和待克隆片段上形成同聚物尾，以利DNA重組。六、堿性磷酸酶（AP）： 催化去除DNA、RNA、NTP及dNTP的5磷酸基團(tuán)。1. 在用32P標(biāo)記5末端前，去除DNA或RNA的5磷酸基；2. 在連接反應(yīng)中，去除載體DNA片段5磷酸基，防止自身環(huán)化。載體(zit)(Vector)能在連接酶作用(zuyng)下和外源DNA片段連接(linji)并運(yùn)送DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子DNA聚合酶1的應(yīng)用 1.催化

58、DNA缺口平移（nick translation）反應(yīng)2.對(duì)雙鏈DNA3突出末端進(jìn)行末端標(biāo)記3.第二cDNA鏈合成：類(lèi)似“缺口平移”4. Sanger 測(cè)序基因克隆主要步驟 1)制備目的基因和相關(guān)載體2)將目的基因和有關(guān)載體進(jìn)行連接3)將重組的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞4)DNA重組體的篩選和鑒定5)DNA重組的擴(kuò)增、表達(dá)和其它研究良好的載體應(yīng)具備以下條件：1. 必須有自身的復(fù)制子；2. 載體分子上必須有限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn),即多克隆位點(diǎn)（multicloning site,MCS），以供外源DNA插入3. 載體應(yīng)具有可供選擇的遺傳標(biāo)志，以區(qū)別陽(yáng)性重組子和陰性重組子； 4. 載體分子必須具有足夠的容量

59、5. 可通過(guò)特定的方法導(dǎo)入宿主(氯化鈣，磷酸鈣，電擊，等)。6. 對(duì)于表達(dá)載體還應(yīng)配備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子，前導(dǎo)順序，增強(qiáng)子，加尾信號(hào)等調(diào)控DNA元件。一、質(zhì)粒載體：小片段DNA克隆，測(cè)序。特點(diǎn)1、分子量相對(duì)較小，能在細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定存在，有較高的拷貝數(shù)。2、具有一個(gè)以上的遺傳標(biāo)記，便于對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇，如抗生素的抗性基因、-半乳糖苷酶基因（lac Z）等。3、具有多個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶的單一切點(diǎn)，便于外源基因的插入。如果在這個(gè)位點(diǎn)有外源基因的插入，會(huì)導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，而便于篩選。二、噬菌體載體：構(gòu)建基因文庫(kù)（shotgun 基因組文庫(kù)、cDNA文庫(kù)）及 表達(dá)文庫(kù)。DNA可以作為載體，通過(guò)替換

60、自身序列的方式攜帶外源DNA，這種載體稱(chēng)為替換型載體三、粘性質(zhì)粒適合克隆較大的DNA片段：由質(zhì)粒和噬菌體的cos粘性末端構(gòu)建而成。粘粒載體大小為4-6kb，插入片段則可大至29-50kb應(yīng)用于大分子量DNA克隆。特點(diǎn)：含有質(zhì)粒的抗藥性標(biāo)記如Ampr基因。帶有噬菌體的粘性末端（cos區(qū)）具有一個(gè)或多個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。粘性質(zhì)粒本身不大非重組體粘粒很小，不能在體外包裝，因而重組體的本底很低，有利于篩選。四、M13 噬菌體載體：制備單鏈DNA, 人工誘變五、病毒載體可將外源DNA帶入哺乳動(dòng)物細(xì)胞六、BAC ：大片段DNA 克隆，0.1-0.4 MB。構(gòu)建物理圖譜基因工程的操作程序（大題）：一、