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文檔簡介

1、生物活性分子的分離與表征第3章、沉淀法第4章、吸附層析第5章、紙層析第6章、凝膠過濾層析第7章、離子交換層析第8章、親和層析第第9 9章、疏水層析章、疏水層析第第9章章 疏水層析疏水層析 Hydrophobic Interaction Chromatography 9.1、概述9.2、疏水層析原理9.3、疏水層析介質(zhì)9.4、疏水層析實驗技術(shù)9.5、疏水層析的應(yīng)用9.6、反相層析9.1、概述 疏水層析(HIC)亦稱為疏水作用層析,是利用固定相載體上偶聯(lián)的疏水性配基與流動相中的一些疏水分子發(fā)生可逆性結(jié)合而進行分離的層析技術(shù)。 從作用機制來看,它屬于吸附層析。 非極性化合物例如苯、環(huán)己烷在水中的溶解

2、度非常小,與水混合時會形成互不相溶的兩相,即非極性分子有離開水相進入非極性相的趨勢,即所謂的疏水性(Hydrophobicity)。 非極性溶質(zhì)與水溶劑的相互作用則稱為疏水效應(yīng)(Hydrophobic effect) 。疏水效應(yīng)疏水作用疏水作用(hydrophobic interaction):非極性分子進入水中,有聚集在一起形成最小疏水面積的趨勢,保持這些非極性分子聚集在一起的作用則稱為疏水作用。 對于可溶蛋白,溶劑是水,疏水側(cè)鏈因此被包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部。最終的結(jié)構(gòu)是最適合周圍溶液的熱動力學(xué)折衷的結(jié)果。 就球形蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)而言,其分子中的疏水性殘基數(shù)是從外向內(nèi)逐步增加的。 雖然疏水氨基酸大多被

3、包埋在球形蛋白內(nèi)部,有些則暴露在外,在蛋白質(zhì)表面形成疏水區(qū)域,這部分暴露在外疏水性基團稱為疏水補丁疏水補丁。疏水和親水部件表面的溶菌酶。最疏水部分是深紅色,淺紅色的更少的疏水性。最親水部分顯示在深藍色的,更少的親水部分是淺藍色。高度規(guī)則的水殼層包圍在配基和蛋白的疏水表面周圍。疏水物質(zhì)被迫融合以減少這種殼的總面積(熵最大)。在純水中,任何疏水效應(yīng)都太弱而不能導(dǎo)致配基和蛋白之間或蛋白自身的相互作用。鹽能夠增強疏水作用。A) 9.2、疏水層析原理B)在高高鹽濃度下,暴露于分子表面的疏水性殘基疏水性殘基才能與疏疏水性固定相水性固定相作用作用。 高濃度鹽溶液降低流動相的離子強度進行解吸附也就是:疏水作用

4、弱(即親水性強)的物質(zhì),用 高濃度鹽溶液洗脫時,會先被洗下來。當(dāng)鹽溶液濃度降低時,疏水作用強的物質(zhì)才會隨后被洗下來。(相同鹽濃度下,疏水作用弱的物質(zhì)先被洗下來,疏水作用強的物質(zhì)隨后被洗下來)對于疏水性很強的物質(zhì),則需要在流動相添加適量有機溶劑降低極性才能達到解吸附的目的。 疏水層析介質(zhì)由基質(zhì)和配體(疏水性基團)兩部分構(gòu)成。 基質(zhì)主要有多糖類如瓊脂糖、纖維素和人工合成聚合物類如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯類。其中,瓊脂糖類凝膠仍是應(yīng)用最廣泛的疏水介質(zhì)。 9.3、疏水層析介質(zhì) HIC介質(zhì)的疏水配基主要為烷基和芳介質(zhì)的疏水配基主要為烷基和芳香基香基,其,其烷基通常在烷基通常在C8以下,芳香基多為以下,芳香

5、基多為苯基苯基 。 R代表疏水配基,代表疏水配基,M代表基質(zhì)。調(diào)節(jié)兩種反代表基質(zhì)。調(diào)節(jié)兩種反應(yīng)物的比例可控制介質(zhì)的配基密度應(yīng)物的比例可控制介質(zhì)的配基密度 (A)丁基(B)辛基(C)苯基(D)新戊基 偶聯(lián)至基質(zhì)的常見配基類型 對某些蛋白而言,上述有些配基與其結(jié)合力對某些蛋白而言,上述有些配基與其結(jié)合力太強太強,洗脫,洗脫有時需用有機溶劑,有變性風(fēng)險;具有時需用有機溶劑,有變性風(fēng)險;具中等疏水的高分子配基中等疏水的高分子配基( (如聚乙二醇和聚如聚乙二醇和聚丙三醇丙三醇等等) )不僅可提供足夠的結(jié)合力,且避免了上述缺點。不僅可提供足夠的結(jié)合力,且避免了上述缺點。常用商品化疏水層析介質(zhì)常用商品化疏水

6、層析介質(zhì)1.1. Butyl Sepharose 4 Fast FlowButyl Sepharose 4 Fast Flow 工作pH范圍為3-13,清洗pH范圍為2-14,工作的最大速度是600cm/h,配基結(jié)合量為每ml 50mol 正丁烷基正丁烷基,疏水性最弱,適合含脂族配體的生物分子。2. Octyl Sepharose 4 Fast Flow2. Octyl Sepharose 4 Fast Flow 工作pH范圍為3-13,清洗pH范圍為2-14,工作的最大速度是600cm/h,配基結(jié)合量為每ml50mol正辛烷基正辛烷基,疏水性中等,適合各種蛋白的分離和純化。 Phenyl S

7、epharose 6 Fast Flow Phenyl Sepharose 6 Fast Flow工作pH范圍為3-13,清洗pH范圍為2-14,工作的最大速度是600cm/h配基結(jié)合量為每ml 40 mol苯基Phenyl,疏水性最強,載量高,適合含芳香族配體的生物分子的預(yù)處理,一、層析柱的制備1、層析介質(zhì)選擇 配基的性質(zhì)與密度對決定疏水相互作用層析介質(zhì)最終的選擇性、結(jié)合能力起到重要的作用。9.4、疏水層析實驗技術(shù) 配基的種類和目的蛋白配基的種類和目的蛋白的性質(zhì)在確定疏水相互作用的性質(zhì)在確定疏水相互作用層析的選擇性方面是高度顯層析的選擇性方面是高度顯著的參數(shù)。最合適的配基必著的參數(shù)。最合適的

8、配基必須通過用目的蛋白進行篩選須通過用目的蛋白進行篩選試驗來確定。試驗來確定。圖21 在使用一種苯基配基、同樣的運行條件下三種單克隆抗體相互作用不同。總的來說, 疏水相互作用填料可以根據(jù)它們和樣品組分的相互作用分為兩類。直鏈烷基(丁基,辛基,醚基,異丙基)顯示一個純的疏水性質(zhì),而芳香基配基(苯基)顯示混合型性質(zhì),包括芳香性和疏水性相互作用。在進行常壓疏水層析時,大多數(shù)是選用苯基(或辛基)-Sepharose CL-4B吸附劑作固定相。2、層析柱的選擇柱床高度通常為515cm。對一個優(yōu)化好的分離方案進行規(guī)模放大時,規(guī)模放大時,可保持柱高不變,增加柱的直徑可保持柱高不變,增加柱的直徑粗柱子(內(nèi)徑為

9、1.6 5.0cm)適合進行HIC層析。3、裝柱將選定的親水性吸附劑如苯基-Sepharose Cl-4B懸浮于乙醇溶液中,浸泡一段時間;采用離心(或過濾)方法,棄上清液,收集沉淀物;并以50(mV)濃度懸浮于樣品緩沖液中;爾后,按常規(guī)方法裝入層析柱,經(jīng)洗滌、平衡完畢,即可加樣。 二、鹽的選擇在疏水相互作用層析中,結(jié)合過程比洗脫過程更具有選擇性。所以,優(yōu)化起始緩沖液的條件很重要。正確選擇的鹽種類和濃度是影響載量和最終選擇性的最重要參數(shù)。往平衡的緩沖液和樣品中加入一種鹽析鹽,有利于固定化配基與蛋白質(zhì)的相互作用。隨著鹽濃度的提高,結(jié)合到固定化配基上的蛋白質(zhì)量也相應(yīng)提高 。 在實踐中,鈉、或銨的硫酸

10、鹽有效的促進在疏水相互作用層析中配基-蛋白相互作用,在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上有穩(wěn)定作用。 因此,最常用的鹽:Na2SO4、NaCl和(NH4)2SO4 。在給定的濃度下,和其它的鹽相比,硫酸銨能夠給出最好的分辨率,但在pH高于8.0的情況下不推薦使用。硫酸鈉是一種非常好的鹽析試劑,但是在高濃度下,蛋白穩(wěn)定性的問題可能會阻礙它的應(yīng)用。圖22 不同鹽對選擇性的影響:按順序增大洗脫體積洗脫:細胞色素C、溶菌酶、核糖核酸酶A、-糜蛋白酶原。如果目的分子洗脫得太晚或根本不洗脫,或者不能更換到不同的填料,嘗試使用50%的鹽濃度結(jié)合。有些蛋白在高鹽濃度下開始沉淀。起始緩沖液中的鹽濃度需要降低以避免在運行中的沉淀。重復(fù)

11、的以小量上樣也能幫助避免由于沉淀引起的產(chǎn)量丟失。圖23 起始溶液中的鹽濃度影響選擇性和分辨率。對于疏水相互作用,選擇緩沖液離子并不致關(guān)重要。最經(jīng)常使用磷酸緩沖液。pH 的選擇必須和蛋白穩(wěn)定性和活力兼容。然而,在疏水相互作用層析過程中,pH5-8.5對于最終的選擇性和分辨率的影響都非常小。pH的增加減弱疏水相互作用,在pH高于8.5或低于5的時候,蛋白的存留會更加顯著的改變。三、緩沖液 添加劑可以用來改善選擇性和分辨率。例如,樣品和疏水相互作用層析填料結(jié)合太緊時。然而,如果在高濃度使用,就有使目的蛋白失活或/和變性的可能。添加劑可以通過促進蛋白溶解性,改變蛋白構(gòu)象,促進結(jié)合著的蛋白的洗脫來影響分

12、離。水溶性醇、去垢劑等是疏水相互作用層析中最廣泛使用的添加劑。四、層析步驟平衡上樣平衡除雜洗脫34Equilibration1. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionEquilibrate the column and adjust the sample to binding conditionsHydrophobic ligandGel matrixWater moleculesSample application1. Equilibration2. Sample application3. Washing4. Elut

13、ionGel matrixProteinsHydrophobic groups Washing out unbound material1. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionConc. saltAbsNon-bound proteinsElution1. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionTarget elutesConc. saltAbsElutionConc. saltAbs1. Equilibration2. Sample applicat

14、ion3. Washing4. ElutionMore strongly bound proteins加樣加樣在進行任何疏水相互作用層析前,需確定樣品的“鹽穩(wěn)定范圍”。比如,加入逐步增加的鹽至粗提物中,用來確定蛋白沉淀發(fā)生的濃度。確認(rèn)樣品在上樣到柱子時低于該鹽濃度,以避免沉淀。樣品制備:建立鹽溶解性范圍后,從最高的能夠保持生物學(xué)活力而不發(fā)生沉淀問題的鹽濃度開始。調(diào)節(jié)樣品到起始緩沖液的鹽濃度來促進疏水相互作用。使用高濃度的儲液調(diào)節(jié)鹽濃度,以避免由于加入固體鹽時局部鹽濃度過高而造成沉淀。直接調(diào)節(jié)樣品的pH。由于疏水相互作用對pH不是非常敏感,不需要完全的緩沖液交換。在上樣前用簡單的步驟凈化所有的樣

15、品,這樣可以避免堵柱子的風(fēng)險,減少強力清洗步驟的需要,避免柱子性能的破壞和柱壓的增加。黏度隨著溫度而變化,在高鹽濃度下會增加。樣品的可溶性或黏度可能會影響柱子的上樣量。高樣品黏度導(dǎo)致畸變的流速樣式,最終導(dǎo)致變寬的、破壞的峰和壓力問題。稀釋粘稠的樣品。如果不能稀釋,用更低些的鹽濃度或具有更大顆粒大小的填料可能會幫助克服黏度問題。樣品濃度通常應(yīng)該不超過50毫克/毫升。保證樣品,柱子,起始和洗脫緩沖液都在同樣的溫度。大多數(shù)條件下,增高溫度會增強疏水相互作用,所以在更低的溫度工作(通常低于10度)能夠使由于疏水相互作用而導(dǎo)致的樣品組分間的聚集最小化。降低溫度可以作為通過加入去垢劑來提高可溶性的替代方案

16、。洗脫洗脫(1)采用降低流動相中鹽濃度的方式洗脫(最常用)。 (2)通過往流動相中添加有機溶劑,如:乙二醇、丙醇、異丙醇等,降低流動相極性的方式洗脫(溶劑中穩(wěn)定性良好的物質(zhì))。(3)往流動相中添加去污劑等,去污劑本身能與介質(zhì)發(fā)生強烈吸附,從而將結(jié)合在其上的目標(biāo)組分置換下來 (分離膜蛋白)。五、HIC柱的再生、清潔和貯存 輕度污染時,蒸餾水洗滌。污染物緊密結(jié)合時,先用6 mol/L尿素或6 mol/L鹽酸胍洗滌,再用起始緩沖液或貯存緩沖液洗滌。NaOH可用于溶解變性和沉淀的蛋白質(zhì)及脂類 未使用的介質(zhì)儲存在封閉的容器中,在4-25的條件下保存。用過的介質(zhì)應(yīng)貯存在含有適當(dāng)抑菌劑的溶液中,在4 8的條

17、件下保存。 9.5、疏水層析的應(yīng)用1、多種生物大分子的分離純化。 2、去除DNA。 在用基因工程生產(chǎn)的各種藥物中,世界衛(wèi)生組織(WHO) 規(guī)定藥物中DNA 的殘留量應(yīng)低于100pg/ml。利用HIC純化技術(shù)則可以有效地除去殘留的DNA ,因為在DNA的結(jié)構(gòu)中幾乎不存在疏水區(qū)域,因此難以和疏水色譜填料結(jié)合而被除去。3、一些脲變性或胍變性蛋白質(zhì)的復(fù)性 。 將鹽酸胍變性的牛血清白蛋白、溶菌酶、核糖核酸酶混合物通過HIC柱,30分鐘內(nèi)可獲得除去變性劑、分離和完全復(fù)性三種功效。4、研究蛋白折疊機理。 運用HIC技術(shù)可以對變性蛋白質(zhì)復(fù)性過程中產(chǎn)生的中間體進行分離,通過對這些中間體的研究,可以了解蛋白質(zhì)的折

18、疊機理。 實例1:從雜交瘤細胞培養(yǎng)液中濃縮并純化單克隆抗體Sample: Hybridoma cell culture supernatant, mouse IgG1, anti-IgE. Ammonium sulfate added to 0.5 MColumn: HiLoad 16/10 Phenyl Sepharose HPStart buffer: 20 mM potassium phosphate, 0.5 M ammonium sulfate, pH 7.0Elution buffer: 20 mM potassium phosphate, pH 7.0 Gradient: 010

19、0% elution buffer in 10 CVFlow: 100 cm/h 在雜交瘤細胞培養(yǎng)液中產(chǎn)生的鼠IgG1 anti-IgE,和Phenyl Sepharose結(jié)合非常強,大多的胎牛血清蛋白流過了柱子,最終獲得了高于95%的純度的單抗。實例2:從CHO細胞中獲得重組乙肝病毒表面抗原(r-HbsAg)乙肝病毒是一種能導(dǎo)致急性和慢性肝炎,肝硬化和原發(fā)性肝癌的感染因子。據(jù)估計,世界上5%的人口都感染了這種病毒??梢杂弥亟M技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)重組乙肝表面抗原(r-HBsAg)來作為未感染人群的有效疫苗。由于r-HBsAg極端疏水,它和大多數(shù)疏水相互作用層析填料都能緊密結(jié)合,因此可使用疏水層析進行

20、純化。Column: Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow packed in XK 50/20, 130 ml穿透峰洗脫峰標(biāo)準(zhǔn)品9.6 反相層析Reversed-Phase Chromatography 根據(jù)溶質(zhì)的性質(zhì),采用極性的流動相和非極性的固定相的分離體系,利用固定相非極性基團的疏水效應(yīng)疏水效應(yīng)而建立的一種分離模式。反相層析介質(zhì)的表面通常比疏水層析介質(zhì)更加疏水。這導(dǎo)致更強的相互作用,以至于為了成功的洗脫,需要用非極性的有機溶劑比如乙腈或甲醇。疏水相互作用層析則提供了利用生物分子疏水性的另一種方法,即通過在更極性的,變性能力更弱的環(huán)境下工作。反相層析具有極高的分辨率

21、,可以分離反相層析具有極高的分辨率,可以分離只具有微弱疏水性差異的組分。只具有微弱疏水性差異的組分。RP-HPLC separates rabbit and human insulin that differ by only a single amino acid. Column: VYDACColumn: VYDAC214TP54 214TP54 Eluent: 2730% acetonitrile (ACN) in 0.1% TFA over 25 Eluent: 2730% acetonitrile (ACN) in 0.1% TFA over 25 minutes at 1.5 mL/

22、minute.minutes at 1.5 mL/minute. “反相”一詞是從“常相”衍生出來的。常相層析是一種使用親水固定相和含有己烷或氯甲烷等有機溶劑作為流動相的技術(shù)。在反相層析中,固定相是疏水的,所以使用了水/有機溶劑作為流動相使用,就是說,固定相比流動相更加疏水。反相層析填料作為吸附體而洗脫溶液作為流動相。正相與反相色譜區(qū)別固定相固定相REVERSED PHASE:NORMAL PHASE:正相與反相色譜區(qū)別洗脫順序洗脫順序反相層析介質(zhì)載體:球形微粒多孔硅膠、特殊的高分子合成材料。特點:機械強度高;具有較多的可用于活化的羥基;微孔結(jié)構(gòu)容易控制。配基:烷基化合物,如C4C4、C8C8

23、、C12C12、C18C18等。等。碳鏈越長,疏水性越大,穩(wěn)定性越好。碳鏈長,所占空間體積較大,介質(zhì)表面可使用的有效孔徑變小,柱效下降。生物大分子:C4C4、C8C8的烷基;的烷基;多肽:多肽:C18C18烷基烷基Peptide separation on different reversed-phase columns Columns: VYDAC218TP54 (C18); 214TP54 (C4); 219TP54 (phenyl);Eluent: 1530 % ACN in 0.1% aqueous TFA over 30 minutes at 1.0mL/min. Sample: 1

24、.oxytocin, 2.bradykinin, 3. angiotensinII, 4.neurotensin, 5.angiotensinI.反相介質(zhì)的合成辛基硅膠介質(zhì)的合成過濾后分別用四氯化碳、丙酮溶劑洗滌,過夜即可。4.5 g正辛基二甲基氯硅烷40 g 四氯化碳密閉容器混勻,超聲波脫氣100 mg硅膠載體超聲波脫氣30 min30 min室溫下反應(yīng)24 h24 h常用反相柱的規(guī)格:30 mm30 mm2.1 mm2.1 mm100 mm 100 mm 2.1 mm2.1 mm50 mm 50 mm 1 mm1 mm介質(zhì)顆粒度:5-7 m5-7 m,孔徑,孔徑30 nm30 nm流動相流

25、動相多采用酸性的、低離子強度的水溶液。由于生物大分子的疏水部分相差較大,流動相只用一種水溶液不能滿足多分離組分的要求,在水溶液中加入一定比例的與之相混的有機溶劑,對其極性進行調(diào)整。常用的有機溶劑:甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等。乙腈的毒性是甲醇的5倍,是乙醇的25倍。常用流動相:常用流動相:0.10.1三氟乙酸乙腈三氟乙酸乙腈(TFATFAACNACN)系統(tǒng)。系統(tǒng)。TFATFA特點:紫外吸收少特點:紫外吸收少可揮發(fā),易除去可揮發(fā),易除去可靠性可靠性 缺點:在缺點:在190-250 nm190-250 nm波長下易造成基線漂移。波長下易造成基線漂移??梢酝ㄟ^調(diào)整溶劑可以通過調(diào)整溶劑A

26、 A與溶劑與溶劑B B中中TFATFA的量來的量來消除。消除。使用新鮮配制的使用新鮮配制的TFATFA,不宜在儲液瓶中長,不宜在儲液瓶中長時間放置。時間放置。Significant differences in the peptide separation pattern due to differences in TFA concentration are evident. Column: C18 Column: C18 (VYDAC(VYDAC218TP54). Flow 218TP54). Flow rate: 1 mL/min.Eluent: rate: 1 mL/min.Eluent

27、: Gradient from 050% Gradient from 050% ACN in aqueous TFA, ACN in aqueous TFA, concentration as concentration as indicated.Sample: indicated.Sample: Trypticdigest of Trypticdigest of apotransferrin. Note: apotransferrin. Note: Only part of the Only part of the chromatogram is shown.chromatogram is

28、shown.洗脫液的選擇pH 離子對試劑有機修飾劑最優(yōu)的pH是需要建立得最重要的參數(shù)Elution of five peptides at pH 2.0, 4.4 and 6.5 with phosphate as the buffer.Column: VYDACColumn: VYDAC218TP54 (C18, 5 218TP54 (C18, 5 m, 4.6 x 250 mm). m, 4.6 x 250 mm). EluentEluent: : 1530% ACN in 30 min at 1.0 1530% ACN in 30 min at 1.0 mLmL/min; plus A.

29、 20 /min; plus A. 20 mMphosphatemMphosphate, pH , pH 2.0 B. 20 2.0 B. 20 mMphosphatemMphosphate, pH 4.4 C. 20 , pH 4.4 C. 20 mMphosphatemMphosphate, pH 6.5 , pH 6.5 Peptides: 1. bradykinin2. oxytocin3. Peptides: 1. bradykinin2. oxytocin3. angiotensinIIangiotensinII 4. 4. neurotensin5. neurotensin5.

30、angiotensinIangiotensinI. .離子對試劑增加帶電組分的疏水性,提高其與填料的結(jié)合,并因此改變滯留時間的通常方法是向洗脫液中添加離子對試劑。這些試劑通過離子相互作用和帶電基團結(jié)合,因此抑制它們對整體疏水性的影響。由于大多數(shù)蛋白和肽具有輕微的堿性,離子對試劑通常是酸,比如三氟乙酸(TFA),三乙胺之類的堿則用于帶負電的分子。有機修飾劑開始洗脫時,需向洗脫液中添加有機修飾劑來增強洗脫力量。有機修飾劑必須可以和水互溶,不具有紫外吸光,以便檢測正在洗脫的分子。沸點必須足夠低以便洗脫后的揮發(fā)。洗脫類型梯度洗脫:分離純化常用 梯度通常是由相對親水的條件(高水含量,低有機修飾劑含量)向

31、疏水條件(低水含量,高有機溶劑含量)進行。分步洗脫:脫鹽典型的反相色譜圖At 39% ACN, the retention time of lysozymeis nearly 18 At 39% ACN, the retention time of lysozymeis nearly 18 minutes. Increasing the ACN concentration to 40% minutes. Increasing the ACN concentration to 40% reduces the retention time by more than half, to 7.6 reduces the retention time by more than half, to 7.6 minutes. Increasing the ACN concentration to 42% minutes. Increasing the ACN concentrat

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