基因工程大腸桿菌表達系統(tǒng)

1、基因工程大腸桿菌表達系統(tǒng)最佳的基因表達體系：最佳的基因表達體系：目的基因的表達產量高目的基因的表達產量高;表達產物穩(wěn)定表達產物穩(wěn)定;生物活性高生物活性高;表達產物容易分離純化。表達產物容易分離純化。第一節(jié)基因的表達系統(tǒng)與表達策略第一節(jié)基因的表達系統(tǒng)與表達策略第1頁/共61頁宿主細胞的選擇適合目的基因表達的宿主細胞的要求適合目的基因表達的宿主細胞的要求: : 1 1、容易獲得較高濃度的細胞；、容易獲得較高濃度的細胞； 2 2、能利用易得廉價原料；、能利用易得廉價原料； 3 3、不致病、不產生內毒素；、不致病、不產生內毒素； 4 4、發(fā)熱量低、需氧低、適當的發(fā)酵溫度和細胞形態(tài)；、發(fā)熱量低、需氧低、

2、適當的發(fā)酵溫度和細胞形態(tài)； 5 5、容易進行代謝調控；、容易進行代謝調控； 6 6、容易進行、容易進行DNADNA重組技術操作；重組技術操作； 7 7、產物的產量、產率高，、產物的產量、產率高， 8 8、產物容易提取純化。、產物容易提取純化。第2頁/共61頁宿主細胞分為兩大類：宿主細胞分為兩大類：1 1、原核細胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、原核細胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、 鏈霉菌等；鏈霉菌等；2 2、真核細胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動、真核細胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動物細胞等。物細胞等。第3頁/共61頁一、真核基因的大腸桿菌表達體系一、真核基因的大腸桿菌表達體系 目前，已

3、被用于表達外源蛋白質的表達系目前，已被用于表達外源蛋白質的表達系統(tǒng)有細菌（大腸桿菌和枯草桿菌）、酵母、昆統(tǒng)有細菌（大腸桿菌和枯草桿菌）、酵母、昆蟲、植物和哺乳動物細胞等。但比較而言，大蟲、植物和哺乳動物細胞等。但比較而言，大腸桿菌表達系統(tǒng)具有明顯的優(yōu)越性。腸桿菌表達系統(tǒng)具有明顯的優(yōu)越性。第4頁/共61頁大腸桿菌表達體系的優(yōu)越性大腸桿菌表達體系的優(yōu)越性： 1. 1. 對大腸桿菌的背景知識（完成基因組全測序哦），特別是基因表達調控對大腸桿菌的背景知識（完成基因組全測序哦），特別是基因表達調控的分子機理有（乳糖操縱子）深刻的了解；的分子機理有（乳糖操縱子）深刻的了解； 2. 2. 是一種安全的基因工

4、程實驗體系，擁有各類適用的寄主菌株和不同類型是一種安全的基因工程實驗體系，擁有各類適用的寄主菌株和不同類型的載體；的載體； 3. 3. 許多克隆的真核基因都可以在大腸桿菌細胞中實現有效、高水平的表達；許多克隆的真核基因都可以在大腸桿菌細胞中實現有效、高水平的表達； 4. 4. 大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉，易用于批量生產。大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉，易用于批量生產。第5頁/共61頁大腸桿菌中表達體系的不足大腸桿菌中表達體系的不足： 1. 1. 真核基因，在結構上同原核基因之真核基因，在結構上同原核基因之間存在著很大的差別。間存在著很大的差別。 2. 2. 真核基因的轉錄信號同

5、原核的不同。真核基因的轉錄信號同原核的不同。 細菌的細菌的RNARNA聚合酶不能識別真核的聚合酶不能識別真核的啟動子；外源基因可能含有具大腸桿菌啟動子；外源基因可能含有具大腸桿菌轉錄終止信號功能的核苷酸序列。轉錄終止信號功能的核苷酸序列。 3. 3. 真核基因真核基因mRNAmRNA的分子結構同細菌的分子結構同細菌的有所差異，影響真核基因的有所差異，影響真核基因mRNAmRNA穩(wěn)定穩(wěn)定性。性。第6頁/共61頁4. 4. 許多真核基因的蛋白質產物，都要許多真核基因的蛋白質產物，都要經過轉譯后的加工修飾（正確折疊和經過轉譯后的加工修飾（正確折疊和組裝），而大多數的這類修飾作用在組裝），而大多數的這

6、類修飾作用在細菌細胞中并不存在；細菌細胞中并不存在；5. 5. 細菌的蛋白酶，能夠識別外來的真細菌的蛋白酶，能夠識別外來的真核基因所表達的蛋白質分子，并把它核基因所表達的蛋白質分子，并把它們降解掉。們降解掉。6. 6. 大腸桿菌周質內存在各種內毒素。大腸桿菌周質內存在各種內毒素。第7頁/共61頁克隆基因正確表達的基本條件克隆基因正確表達的基本條件 最基本條件最基本條件：應該能夠進行正常的轉：應該能夠進行正常的轉錄和轉譯，以及在正常情況下還與轉錄和轉譯，以及在正常情況下還與轉譯后加工及新生多肽在細胞中的分布譯后加工及新生多肽在細胞中的分布有關。有關。啟動子啟動子、終止子終止子以及正確以及正確讀碼

7、讀碼框（框（ORF）。 第8頁/共61頁重要條件重要條件：編碼的蛋白質產物應能維持正常的編碼的蛋白質產物應能維持正常的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性。具有核糖體結合位點；具有核糖體結合位點；具有強啟動子；具有強啟動子；第9頁/共61頁二、大腸桿菌的表達載體二、大腸桿菌的表達載體1、大腸桿菌表達載體的基本成分、大腸桿菌表達載體的基本成分TTGACA。TATAAT-3517-10PRTAAGGAGG（N）8ATG（91%）GTG（8%）TTG（1%）編碼序列編碼序列TAATGATAGTTtetrOriRBS第10頁/共61頁外源基因在大腸桿菌中高效表達的原理 啟動子 終止子 核糖體結合位點 密碼子 質粒拷貝數轉錄

8、水平翻譯水平第11頁/共61頁（1）啟動子）啟動子 要使克隆的外源基因高水平表達的最佳要使克隆的外源基因高水平表達的最佳啟動子，必須具備以下幾個條件：啟動子，必須具備以下幾個條件：1）必須是一個強啟動子。）必須是一個強啟動子。2）這個啟動子應能呈現一種低限的基礎表達）這個啟動子應能呈現一種低限的基礎表達水平。使用高度抑制型的啟動子是一種極為水平。使用高度抑制型的啟動子是一種極為重要的條件。重要的條件。3）這種啟動子應是誘導型的，能通過簡單的）這種啟動子應是誘導型的，能通過簡單的方式使用廉價的誘導物而得以誘導，如物理方式使用廉價的誘導物而得以誘導，如物理（如熱）和化學（如（如熱）和化學（如IPT

9、G）誘導）誘導 。第12頁/共61頁（2）轉錄終止子）轉錄終止子* 當上游啟動子驅動的轉錄作用通讀過下游啟動當上游啟動子驅動的轉錄作用通讀過下游啟動子時，便會使該啟動子的功能受到抑制。子時，便會使該啟動子的功能受到抑制。啟動啟動子封堵作用子封堵作用* 在克隆基因編碼區(qū)的在克隆基因編碼區(qū)的3-末端接上一個有效的轉末端接上一個有效的轉錄終止子，便能夠阻止轉錄通讀。錄終止子，便能夠阻止轉錄通讀。 此外，轉錄終止子還能增強此外，轉錄終止子還能增強mRNA分子的穩(wěn)分子的穩(wěn)定性，從而大大提高蛋白質產物的水平。定性，從而大大提高蛋白質產物的水平。第13頁/共61頁（3）翻譯起始序列）翻譯起始序列 mRNA轉

10、錄本轉錄本5端的獨特的結構特征（核糖端的獨特的結構特征（核糖體結合位點，體結合位點，RBS），是決定），是決定mRNA翻譯效率翻譯效率的主要因素。的主要因素。 至今，仍未鑒定出通用有效的翻譯起始序列的保至今，仍未鑒定出通用有效的翻譯起始序列的保守結構，但卻已經發(fā)展出許多種可以用來有效地降守結構，但卻已經發(fā)展出許多種可以用來有效地降低在低在mRNA轉錄本轉錄本5-末端形成二級結構的實驗方法，末端形成二級結構的實驗方法，從而提高克隆的外源基因的表達效率。從而提高克隆的外源基因的表達效率。 例如例如: 在在RBS序列中增加序列中增加AT含量；含量；誘發(fā)特異堿基誘發(fā)特異堿基發(fā)生定點突變；發(fā)生定點突變；

11、以及使用翻譯偶聯系統(tǒng)進行克隆基以及使用翻譯偶聯系統(tǒng)進行克隆基因的表達。因的表達。第14頁/共61頁（4）翻譯增強子）翻譯增強子 大腸桿菌和噬菌體基因中存在一些特殊的序列元大腸桿菌和噬菌體基因中存在一些特殊的序列元件，能夠顯著地增強異源基因在大腸桿菌細胞中的件，能夠顯著地增強異源基因在大腸桿菌細胞中的表達效率。這類特殊序列元件特稱為表達效率。這類特殊序列元件特稱為翻譯增強子翻譯增強子。 例如：例如：T7噬菌體基因噬菌體基因10的前導序列（的前導序列（g10-L）、）、以大腸桿菌以大腸桿菌atpE基因為代表的一些基因為代表的一些mRNA分子分子5-UTR中的富含中的富含U的區(qū)段，以及直接位于的區(qū)段

12、，以及直接位于T7基因起基因起始密碼子下游的始密碼子下游的“下游元件下游元件”等。等。分子機制不明。分子機制不明。第15頁/共61頁（5）翻譯終止密碼）翻譯終止密碼 對對mRNA翻譯終止而言，一個必不可少的條翻譯終止而言，一個必不可少的條件是必須存在終止密碼子。因此，在構建大腸桿件是必須存在終止密碼子。因此，在構建大腸桿菌表達載體時，通常安置上全部的三個終止密碼菌表達載體時，通常安置上全部的三個終止密碼子，以便阻止發(fā)生核糖體的子，以便阻止發(fā)生核糖體的“跳躍跳躍”現象?，F象。 已知大腸桿菌格外偏愛使用終止密碼已知大腸桿菌格外偏愛使用終止密碼UAA，尤其，尤其是當連上一個是當連上一個U而形成而形成

13、UAAU四聯核苷酸的情況下，四聯核苷酸的情況下，翻譯終止的效率進一步提高。翻譯終止的效率進一步提高。第16頁/共61頁2、常用的大腸桿菌表達載體、常用的大腸桿菌表達載體 迄今為止，基因工程學家已經設計并構建了迄今為止，基因工程學家已經設計并構建了一系列的以原核啟動子取代真核啟動子的質粒一系列的以原核啟動子取代真核啟動子的質粒表達載體系統(tǒng)。表達載體系統(tǒng)。 最常用的：最常用的： 噬菌體的噬菌體的PL啟動子，大腸桿啟動子，大腸桿菌的菌的Lac啟動子、啟動子、Trp啟動子，以及啟動子，以及pBR322質粒的質粒的 -內酰胺酶啟動子等一批強啟動子構內酰胺酶啟動子等一批強啟動子構成的。成的。第17頁/共6

14、1頁三、大腸桿菌的轉化方法三、大腸桿菌的轉化方法1、Cohen轉化法轉化法1972年年Cohen改進而成，是目前最常用的方法。改進而成，是目前最常用的方法。操作步驟：操作步驟：（1）將處于對數生長期的新鮮培養(yǎng)物（）將處于對數生長期的新鮮培養(yǎng)物（0.5-0.6OD)，于，于4, 4000轉轉/分鐘離心分鐘離心10分鐘，回收細菌細胞；分鐘，回收細菌細胞；（2）將細胞用）將細胞用0的的0.1mol/L CaCl2溶液重新懸浮細胞沉淀，溶液重新懸浮細胞沉淀，以誘導細胞感受態(tài)產生；以誘導細胞感受態(tài)產生；（3）加入適量的）加入適量的DNA后，于后，于42 熱處理熱處理90秒；秒；（4）將混合物快速轉移到冰

15、浴中，是細胞冷卻）將混合物快速轉移到冰浴中，是細胞冷卻1-2分鐘，分鐘，加入適當的培養(yǎng)基在加入適當的培養(yǎng)基在37 培養(yǎng)培養(yǎng)45分鐘，使細胞復蘇，并表分鐘，使細胞復蘇，并表達質粒所攜帶的轉化基因；達質粒所攜帶的轉化基因；（5）選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，選擇轉化體。）選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，選擇轉化體。第18頁/共61頁2、Hanahan轉化法轉化法 1983年由年由Hanahan設計。它的特點是在感受態(tài)細胞設計。它的特點是在感受態(tài)細胞的誘導方面，除了用的誘導方面，除了用CaCl2和和MnCl2等二價離子按一等二價離子按一定形式組合方式處理細胞外，還利用二甲亞砜定形式組合方式處理細胞外，還利用二甲亞砜（DMSO）、

16、二硫蘇糖醇（）、二硫蘇糖醇（DTT）和氯化六氨合高鈷）和氯化六氨合高鈷等進一步處理細胞，其它方面與上法相同。等進一步處理細胞，其它方面與上法相同。 這種方法的優(yōu)點是形成高頻率的感受態(tài)細胞，可使這種方法的優(yōu)點是形成高頻率的感受態(tài)細胞，可使轉化效率提高轉化效率提高100-1000倍，而且對大小質粒都能進行倍，而且對大小質粒都能進行有效的轉化。有效的轉化。 值得注意的是：值得注意的是：此法要求的條件高，對外界污染此法要求的條件高，對外界污染物極其敏感，對各方面的要求很高。因此，只在極物極其敏感，對各方面的要求很高。因此，只在極少數情況下才使用此法。少數情況下才使用此法。第19頁/共61頁3、電轉化法

17、、電轉化法第20頁/共61頁 電轉化法的轉化效率受電場強度、電脈沖的電轉化法的轉化效率受電場強度、電脈沖的時間和時間和DNA濃度等參數的影響。濃度等參數的影響。 轉化效率：轉化效率：108-109轉化體轉化體/g DNA。 當電壓和電脈沖時間的一定方式組合而導致當電壓和電脈沖時間的一定方式組合而導致50%-70%細菌死亡時，轉化效率達到最高。細菌死亡時，轉化效率達到最高。第21頁/共61頁 制備用于電轉化的感受態(tài)細胞相對容易。制備用于電轉化的感受態(tài)細胞相對容易。 當細菌長到對數中期，冷卻、離心，然后用當細菌長到對數中期，冷卻、離心，然后用冷卻的去離子水反復清洗，最后用冷卻的去離子水反復清洗，最

18、后用10%甘油重甘油重懸細胞，使其濃度為懸細胞，使其濃度為3 1010細胞細胞/毫升，在干冰毫升，在干冰或液氮中速凍后置于或液氮中速凍后置于-70 貯存。貯存。 轉化必須在轉化必須在0-4 下進行。下進行。 如果在室溫下操作，轉化效率會大大降低。如果在室溫下操作，轉化效率會大大降低。第22頁/共61頁四、克隆的真核基因在大腸桿菌細胞中的表達四、克隆的真核基因在大腸桿菌細胞中的表達1、外源蛋白質在大腸桿菌細胞中的表達部位、外源蛋白質在大腸桿菌細胞中的表達部位* 克隆在大腸桿菌細胞中的外源基因的表達部位：克隆在大腸桿菌細胞中的外源基因的表達部位： 細胞質；細胞周質；分泌到細胞外細胞質；細胞周質；分

19、泌到細胞外 這三種表達部位各有不同的優(yōu)缺點，而且對這三種表達部位各有不同的優(yōu)缺點，而且對表達量和表達產物的制備有很大關系。表達量和表達產物的制備有很大關系。第23頁/共61頁在大腸桿菌細胞不同部位表達外源蛋白質的優(yōu)缺點在大腸桿菌細胞不同部位表達外源蛋白質的優(yōu)缺點表達部位表達部位 優(yōu)點優(yōu)點 缺點缺點細胞質細胞質 1、 形成包涵體形成包涵體 1、蛋白質折疊了可能無法恢復起生物學活性、蛋白質折疊了可能無法恢復起生物學活性 （1）蛋白質易于以高純度和高濃度方式分離）蛋白質易于以高純度和高濃度方式分離 2、還原的環(huán)境不利于二硫鍵的形成、還原的環(huán)境不利于二硫鍵的形成 （2）蛋白質受保護而免受胞內酶的降解）

20、蛋白質受保護而免受胞內酶的降解 （3）蛋白質沒有活性，不會使細胞受傷害）蛋白質沒有活性，不會使細胞受傷害 2、表達的質粒載體構建比較簡單、表達的質粒載體構建比較簡單 周質周質 1、周質中蛋白質種類較少，純化簡單、周質中蛋白質種類較少，純化簡單 1、信號肽并非總是有助于蛋白質的轉運、信號肽并非總是有助于蛋白質的轉運 2、蛋白質酶解程度不嚴重、蛋白質酶解程度不嚴重 2、有可能形成包涵體、有可能形成包涵體 3、促進二硫鍵的形成及蛋白質的折疊、促進二硫鍵的形成及蛋白質的折疊 4、蛋白質、蛋白質N-末端結構真實末端結構真實胞外胞外 1、蛋白質的酶解作用程度很底、蛋白質的酶解作用程度很底 1、在大腸桿菌細

21、胞中表達的外源真核蛋白通、在大腸桿菌細胞中表達的外源真核蛋白通 2、目標蛋白的純化容易，由于分泌到胞外的、目標蛋白的純化容易，由于分泌到胞外的 常不會分泌到胞外常不會分泌到胞外 蛋白種類少蛋白種類少 2、由于分泌到胞外的蛋白質相當于稀釋，因、由于分泌到胞外的蛋白質相當于稀釋，因 3、增進了蛋白質的折疊作用、增進了蛋白質的折疊作用 此目標蛋白的得率較低此目標蛋白的得率較低 4、蛋白質、蛋白質N-末端結構真實末端結構真實第24頁/共61頁* Talmadge和和Gilbert（1982）將外源蛋白質在）將外源蛋白質在大腸桿菌細胞中的不同部位表達。結果：大腸桿菌細胞中的不同部位表達。結果： 細胞質中

22、表達的大鼠胰島素原的半衰期僅有細胞質中表達的大鼠胰島素原的半衰期僅有2min左右，而表達在大腸桿菌周質中大鼠胰島素左右，而表達在大腸桿菌周質中大鼠胰島素原的半衰期延長了原的半衰期延長了10倍以上。（倍以上。（原因：細胞周質原因：細胞周質中蛋白酶的含量低中蛋白酶的含量低）到目前為止，這方面的技術還很不成熟，外泌率低。到目前為止，這方面的技術還很不成熟，外泌率低。* 使克隆基因表達的外源蛋白質分泌到胞外的使克隆基因表達的外源蛋白質分泌到胞外的培養(yǎng)基中，是獲得蛋白質穩(wěn)定性的最佳途徑。培養(yǎng)基中，是獲得蛋白質穩(wěn)定性的最佳途徑。第25頁/共61頁2、外源蛋白質在大腸桿菌細胞中的穩(wěn)定性、外源蛋白質在大腸桿菌

23、細胞中的穩(wěn)定性 當一種克隆的外源基因在大腸桿菌中不能實當一種克隆的外源基因在大腸桿菌中不能實現其功能表達時，我們往往會認為這是由于轉現其功能表達時，我們往往會認為這是由于轉錄或翻譯過程發(fā)生了問題。其實在早期的研究錄或翻譯過程發(fā)生了問題。其實在早期的研究中就有許多實驗表明，克隆的外源基因即便是中就有許多實驗表明，克隆的外源基因即便是在大腸桿菌中得到了表達，也并不一定就意味在大腸桿菌中得到了表達，也并不一定就意味著它的多肽產物是穩(wěn)定的。著它的多肽產物是穩(wěn)定的。影響因素包括：影響因素包括：第26頁/共61頁（1）蛋白質的降解作用）蛋白質的降解作用 在大腸桿菌的細胞中，含有大量的各種類型的蛋白酶，在大

24、腸桿菌的細胞中，含有大量的各種類型的蛋白酶，廣泛分布在細胞質、周質、內外膜等部位，參與許多方廣泛分布在細胞質、周質、內外膜等部位，參與許多方面的代謝活動，包括選擇性地酶解異常的蛋白質。面的代謝活動，包括選擇性地酶解異常的蛋白質。 已知有許多因素，如已知有許多因素，如不完全多肽不完全多肽、氨基酸取代突變氨基酸取代突變、多酶復合體亞基的超量合成多酶復合體亞基的超量合成、氧化作用或游離自由基的氧化作用或游離自由基的作用而造成的翻譯后損傷作用而造成的翻譯后損傷，以及以及基因工程技術的效應基因工程技術的效應等，等，都可以導致蛋白質分子受損或構型變化，形成異常蛋白都可以導致蛋白質分子受損或構型變化，形成異

25、常蛋白質。質。第27頁/共61頁 為了避免在大腸桿菌中發(fā)生外源蛋白質的降解，為了避免在大腸桿菌中發(fā)生外源蛋白質的降解，或將此降解作用控制在最低水平，已針對性發(fā)展出或將此降解作用控制在最低水平，已針對性發(fā)展出了許多種不同的技術方案。主要有：了許多種不同的技術方案。主要有：1）讓外源蛋白質定位在周質或胞外表達；）讓外源蛋白質定位在周質或胞外表達；2）使用蛋白酶缺陷的大腸桿菌做表達菌株；）使用蛋白酶缺陷的大腸桿菌做表達菌株；3）將轉化有克隆基因的寄主菌株放置在低溫環(huán)境中生長；）將轉化有克隆基因的寄主菌株放置在低溫環(huán)境中生長；4）使目標基因以融合蛋白形式表達；）使目標基因以融合蛋白形式表達；5）置換多

26、肽鏈中某些氨基酸，消除蛋白酶切點；）置換多肽鏈中某些氨基酸，消除蛋白酶切點；6）對目標蛋白質作疏水性修飾。）對目標蛋白質作疏水性修飾。第28頁/共61頁（2）結構決定因子與蛋白質的穩(wěn)定性）結構決定因子與蛋白質的穩(wěn)定性 與蛋白質穩(wěn)定性相關的確切的分子結構特征？與蛋白質穩(wěn)定性相關的確切的分子結構特征？ 不清楚不清楚 但已經明確了若干種影響蛋白質穩(wěn)定性的結但已經明確了若干種影響蛋白質穩(wěn)定性的結構決定因子。構決定因子。 其中最重要的：其中最重要的：N-端氨基酸性質。端氨基酸性質。第29頁/共61頁N-端氨基酸性質端氨基酸性質 “N-端法則端法則”: 在生物體內蛋白質新陳代謝的在生物體內蛋白質新陳代謝的

27、穩(wěn)定性，主要取決于穩(wěn)定性，主要取決于N-端氨基酸的性質。端氨基酸的性質。 在大腸桿菌細胞質內，若蛋白質在大腸桿菌細胞質內，若蛋白質N-端為端為Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr 和和Trp等殘基，則其穩(wěn)定等殘基，則其穩(wěn)定性較差；而同樣條件下，若性較差；而同樣條件下，若N-端為除了前述端為除了前述6種氨基酸之外的其它任何一種氨基酸殘基時，種氨基酸之外的其它任何一種氨基酸殘基時，其穩(wěn)定性則大大提高。其穩(wěn)定性則大大提高。 重組操作時，重組操作時， N-端增加一個增加穩(wěn)定性的氨基酸端增加一個增加穩(wěn)定性的氨基酸第30頁/共61頁（3）表達天然的蛋白質）表達天然的蛋白質 以形成融合蛋白的形式在大腸桿菌

28、細胞中以形成融合蛋白的形式在大腸桿菌細胞中表達外源真核基因具有許多方面的優(yōu)越性。表達外源真核基因具有許多方面的優(yōu)越性。例如，產物比較穩(wěn)定，可以免受胞內蛋白酶例如，產物比較穩(wěn)定，可以免受胞內蛋白酶的降解作用，可以獲得較高的產率。的降解作用，可以獲得較高的產率。 Tacon等人在等人在80年代初期，使用大腸桿菌的年代初期，使用大腸桿菌的trp啟動子和與之相連的啟動子和與之相連的SD序列，構建了兩種序列，構建了兩種有利于表達天然蛋白質的質粒載體。有利于表達天然蛋白質的質粒載體。pWT551和和pWT571第31頁/共61頁（4）分子伴侶）分子伴侶（molecular chaperone）穩(wěn)定作用穩(wěn)定

29、作用分子伴侶：分子伴侶：指一類多功能蛋白質，它能夠通過阻指一類多功能蛋白質，它能夠通過阻止諸如聚合作用這樣的副反應，來促使其它蛋白止諸如聚合作用這樣的副反應，來促使其它蛋白質按正確的方式折疊，而其本身卻不是最終形成質按正確的方式折疊，而其本身卻不是最終形成的功能蛋白質的組成成分。的功能蛋白質的組成成分。 通過分子伴侶與克隆的外源基因在大腸桿菌通過分子伴侶與克隆的外源基因在大腸桿菌寄主細胞中共表達是增強目標蛋白的穩(wěn)定性、寄主細胞中共表達是增強目標蛋白的穩(wěn)定性、實現高水平表達的有效方法。實現高水平表達的有效方法。第32頁/共61頁（5）大腸桿菌突變體菌株與蛋白質的穩(wěn)定性）大腸桿菌突變體菌株與蛋白質

30、的穩(wěn)定性 通過產生融合蛋白途徑增加外源多肽穩(wěn)定性的通過產生融合蛋白途徑增加外源多肽穩(wěn)定性的方法，已有許多文獻報道，但此法的一個突出缺方法，已有許多文獻報道，但此法的一個突出缺點是所產生的融合蛋白并不一定都能夠在體外將點是所產生的融合蛋白并不一定都能夠在體外將天然蛋白質完整無損地切割下來。天然蛋白質完整無損地切割下來。 一種相當有效的變通辦法是，使用胞內蛋白酶一種相當有效的變通辦法是，使用胞內蛋白酶含量很低的大腸桿菌突變株，作為表達外源蛋白含量很低的大腸桿菌突變株，作為表達外源蛋白質的寄主細菌。其中用得最多的是質的寄主細菌。其中用得最多的是缺失缺失lon蛋白蛋白酶酶的大腸桿菌突變株。的大腸桿菌突

31、變株。第33頁/共61頁五、影響克隆基因在大腸桿菌中表達效率的因素五、影響克隆基因在大腸桿菌中表達效率的因素 啟動子的強度、啟動子的強度、DNA轉錄起始序列、密碼子轉錄起始序列、密碼子的選擇、的選擇、mRNA分子的二級結構、轉錄的終止、分子的二級結構、轉錄的終止、質粒的拷貝數以及質粒的穩(wěn)定性和寄主細胞生質粒的拷貝數以及質粒的穩(wěn)定性和寄主細胞生理特征理特征等都會不同程度地影響克隆基因的表達等都會不同程度地影響克隆基因的表達效率。效率。第34頁/共61頁1、啟動子對克隆基因表達效率的影響、啟動子對克隆基因表達效率的影響(1) 啟動子結構對表達效率的影響啟動子結構對表達效率的影響 大腸桿菌啟動子的序

32、列結構具有兩個保守序大腸桿菌啟動子的序列結構具有兩個保守序列，即列，即-35區(qū)（區(qū)（5-TTGACA）和）和-10區(qū)（區(qū)（5-TATAAT），后者又叫），后者又叫Pribnow盒。盒。 應用半乳糖激酶系統(tǒng)檢測結果表明：啟動子應用半乳糖激酶系統(tǒng)檢測結果表明：啟動子序列與上述保守序列之間相似程度越高，其表序列與上述保守序列之間相似程度越高，其表達能力也就越強，兩者呈正比關系。達能力也就越強，兩者呈正比關系。第35頁/共61頁 此外，此外，兩個保守序列之間的距離也影響兩個保守序列之間的距離也影響克隆基因的表達效率，這段間隔距離越接克隆基因的表達效率，這段間隔距離越接近于近于17個堿基個堿基，啟動子的

33、活性就越強。，啟動子的活性就越強。第36頁/共61頁（2）啟動子與克隆基因的間隔距離對表）啟動子與克隆基因的間隔距離對表達效率的影響達效率的影響 Roberts等用等用 plac5.1 DNA的含有的含有l(wèi)ac啟動子和啟動子和SD序列與序列與 cro基因表達序列構建了不同間隔距離基因表達序列構建了不同間隔距離的重組質粒載體。從中挑選了的重組質粒載體。從中挑選了9種不同的重組質粒種不同的重組質粒載體，分別轉化大腸桿菌細胞，然后測定各種克載體，分別轉化大腸桿菌細胞，然后測定各種克隆所產生的隆所產生的cro蛋白質含量，同時也對每種質粒中蛋白質含量，同時也對每種質粒中的連接的連接lac-cro基因的結

34、合區(qū)序列進行測定。基因的結合區(qū)序列進行測定。第37頁/共61頁ACAATTTCACAGGAAACAGGATCCGGGACTATTTTACCTATGGCGGTGATAATGGTTGCATGTACTAAGGAGGTTGTATGTGTTAAAGTGTCCTTTGTCCTAGGCCCTGATAAAATGGATACCGCCACTATTACCAACGTACATGATTCCTCCAACATACBamHI從lac啟動子開始轉錄Cro轉譯起始密碼SDlacpTR213pTR199pTR214pTR188pTR194pTR210pTR182pTR1901.630.0851.000.650.510.850.0012

35、 0.0006* 圖中示出圖中示出 pTR161質粒的從質粒的從lac啟動子到啟動子到cro基因轉譯起點間的堿基序列。還基因轉譯起點間的堿基序列。還示出示出pTR161質粒的質粒的8種派生質粒的序列缺失程度。數字表示相對于種派生質粒的序列缺失程度。數字表示相對于pTR161的蛋的蛋白質合成數量。白質合成數量。結果表明：結果表明：攜帶不同重組體質粒的菌株所合成的攜帶不同重組體質粒的菌株所合成的cro蛋白質數量，是同蛋白質數量，是同lac-cro基基因的結合區(qū)序列相關聯，但這種相關性并沒有一定的規(guī)律；因的結合區(qū)序列相關聯，但這種相關性并沒有一定的規(guī)律；但但 5端與端與SD序列之序列之間的距離應間的

36、距離應 15bp。第38頁/共61頁（3）提高克隆基因表達效率的實驗方案）提高克隆基因表達效率的實驗方案BamHIEcoRIEcoRI酶切酶切BamHI具具EcoRI末端的克隆片段末端的克隆片段BamHIT4T4連接酶連接酶EcoRIEcoRIBamHI酶切酶切S1核酸酶消化核酸酶消化通過控制消化時間通過控制消化時間制造不同缺失大小制造不同缺失大小Lac啟動子片段啟動子片段克隆基因克隆基因T4連接酶連接酶EcoRIEcoRILac啟動子片段啟動子片段EcoRIEcoRIEcoRIEcoRI第39頁/共61頁2 2、質粒載體的生物學特性與基因表達效率、質粒載體的生物學特性與基因表達效率（1 1）

37、質粒的拷貝數）質粒的拷貝數 由于細胞中的核糖體數量與任何一種由于細胞中的核糖體數量與任何一種mRNA分子數量相比，都是大大超量的。因分子數量相比，都是大大超量的。因此，增加此，增加mRNA分子數量是提高克隆基因表分子數量是提高克隆基因表達效率的有效途徑。達效率的有效途徑。 增加增加mRNA分子數量的因素有兩種：分子數量的因素有兩種：1）啟動子強度；啟動子強度；2）基因的拷貝數，即基因劑）基因的拷貝數，即基因劑量；最簡易的方法是將基因克隆到高拷貝的量；最簡易的方法是將基因克隆到高拷貝的質粒載體上。質粒載體上。第40頁/共61頁 質粒的拷貝數受質粒復制控制區(qū)和宿主質粒的拷貝數受質粒復制控制區(qū)和宿主

38、菌的遺傳背景影響。迄今所使用的絕大多菌的遺傳背景影響。迄今所使用的絕大多數高拷貝數的質粒載體，都是由數高拷貝數的質粒載體，都是由ColE1衍衍生而來的。生而來的。 ColE1及其衍生質粒的復制，受兩種及其衍生質粒的復制，受兩種負調節(jié)成分的控制：負調節(jié)成分的控制：RNAI和和Rom蛋白質。蛋白質。第41頁/共61頁 RNAI是由是由ColE質粒質粒DNA編碼的長度為編碼的長度為108 nt的不翻譯的不翻譯RNA分子，它通過干擾分子，它通過干擾RNAII的加工來的加工來抑制質粒的復制。抑制質粒的復制。 Rom蛋白是由蛋白是由ColE質粒質粒rom基因編碼的一種反基因編碼的一種反式作用抑制劑，它可形

39、成二聚體增強式作用抑制劑，它可形成二聚體增強RNAI和和RNAII之間的堿基配對，從而抑制引物的形成。之間的堿基配對，從而抑制引物的形成。 因此，因此， rom基因的缺失或基因的缺失或RNAI基因的突變，基因的突變，都會引起質?？截悢档脑黾?。都會引起質?？截悢档脑黾?。第42頁/共61頁（2）質粒載體的不穩(wěn)定性對表達效率的影響）質粒載體的不穩(wěn)定性對表達效率的影響 質粒分離的不穩(wěn)定性是指質粒缺陷性分配引質粒分離的不穩(wěn)定性是指質粒缺陷性分配引起的質粒丟失現象。起的質粒丟失現象。 天然質粒都可以穩(wěn)定地保持在寄主細胞內，這天然質粒都可以穩(wěn)定地保持在寄主細胞內，這是由于它們具有一段是由于它們具有一段分配功

40、能區(qū)分配功能區(qū)Par所致。分配所致。分配功能區(qū)功能區(qū)Par能夠保證質粒分子在每次細胞周期中能夠保證質粒分子在每次細胞周期中都能準確地分離，并均勻地分配到子細胞中去。都能準確地分離，并均勻地分配到子細胞中去。第43頁/共61頁 克服質粒丟失的方法：克服質粒丟失的方法：1）將）將Par克隆到表達載體；克隆到表達載體；2）對無質粒細胞進行反選擇。）對無質粒細胞進行反選擇。大體步驟為：使大體步驟為：使攜帶目的基因的質粒同時帶上編碼攜帶目的基因的質粒同時帶上編碼 啟動子的啟動子的 cl基因，形成特殊的重組質粒。然后用一種啟動子基因，形成特殊的重組質粒。然后用一種啟動子缺陷的缺陷的 突變體感染攜帶這種重組

41、體質粒的大腸突變體感染攜帶這種重組體質粒的大腸桿菌寄主細胞，使之成為溶源性細菌。在這種溶桿菌寄主細胞，使之成為溶源性細菌。在這種溶源性細菌中，重組質粒的喪失，伴隨著發(fā)生源性細菌中，重組質粒的喪失，伴隨著發(fā)生 阻阻遏物的喪失，則原噬菌體便被誘發(fā)進入溶菌生長遏物的喪失，則原噬菌體便被誘發(fā)進入溶菌生長周期，從而使寄主細胞裂解死亡。周期，從而使寄主細胞裂解死亡。第44頁/共61頁3、mRNA轉錄本的分子特性對基因表達效率的影響轉錄本的分子特性對基因表達效率的影響（1）翻譯起始系列對表達效率的影響）翻譯起始系列對表達效率的影響 許多細菌基因起始密碼子許多細菌基因起始密碼子5上游都存在上游都存在510個核

42、苷個核苷酸的核糖體結合位點（酸的核糖體結合位點（RBS），特稱為），特稱為SD序列序列。它包。它包含含5-UAAGGAGG-3的全部或其中一部分。的全部或其中一部分。 已經鑒定出已經鑒定出SD序列與序列與16S rRNA分子之間的堿基互分子之間的堿基互補程度，可明顯地影響補程度，可明顯地影響mRNA的翻譯速率。當此序列的翻譯速率。當此序列為為5-GGAGG-3時，可與時，可與16S rRNA 3端區(qū)段完全互補，端區(qū)段完全互補，翻譯效率最高；而當該序列發(fā)生單堿基突變時，翻譯翻譯效率最高；而當該序列發(fā)生單堿基突變時，翻譯效率便下降效率便下降30倍之多。倍之多。第45頁/共61頁 連接在連接在SD序

43、列后面的序列后面的4個堿基成分的改變，會對個堿基成分的改變，會對翻譯效率發(fā)生很大影響。翻譯效率發(fā)生很大影響。如果這個區(qū)域是由如果這個區(qū)域是由4個個A或或4個個T堿基組成，其翻譯最有效；而當是由堿基組成，其翻譯最有效；而當是由4個個C或或4個個G堿基組成，翻譯效率則只及最高翻譯效率的堿基組成，翻譯效率則只及最高翻譯效率的50%或或25%。 直接位于起始密碼直接位于起始密碼AUG上游的三個堿基的三聯上游的三個堿基的三聯體組成，同樣也對翻譯效率發(fā)生影響。體組成，同樣也對翻譯效率發(fā)生影響。以以 -半乳糖半乳糖苷酶苷酶mRNA的翻譯為例，當這三聯體組分為的翻譯為例，當這三聯體組分為UAU或或CUU時，翻

44、譯效率最高；而如果是時，翻譯效率最高；而如果是UUC、UCA或或AGG時，翻譯水平下降時，翻譯水平下降20倍。倍。第46頁/共61頁(2) mRNA的穩(wěn)定性對表達效率的影響的穩(wěn)定性對表達效率的影響 mRNA的的穩(wěn)定性穩(wěn)定性是指是指mRNA分子的相對壽命，或對分子的相對壽命，或對內源內源RNase降解作用的抵抗能力。降解作用的抵抗能力。 在細菌細胞中，有兩類不同的核糖核酸酶參與在細菌細胞中，有兩類不同的核糖核酸酶參與mRNA降解作用：核糖核酸內切酶（降解作用：核糖核酸內切酶（RNaseE、RNaseK和和RNaseIII）和核糖核酸外切酶（）和核糖核酸外切酶（RNaseII和和PNPasepol

45、ynucleotide phosphorylase）。）。 在不同種類的細菌中，這些核糖核酸酶的含量比例不在不同種類的細菌中，這些核糖核酸酶的含量比例不同。例如，在大腸桿菌細胞中，同。例如，在大腸桿菌細胞中，90%的外切核酸酶是的外切核酸酶是RNaseII；而在枯草桿菌細胞中，占絕對優(yōu)勢的外切核酸；而在枯草桿菌細胞中，占絕對優(yōu)勢的外切核酸酶是酶是PNPase第47頁/共61頁 為了維護自身的穩(wěn)定性，為了維護自身的穩(wěn)定性， mRNA 分子在進化過分子在進化過程中也形成了兩種保護性結構元件：程中也形成了兩種保護性結構元件：5-UTR系列系列和和3-UTR系列系列以及以及順反子間區(qū)（順反子間區(qū)（in

46、tercistronic region）的莖環(huán)結構）的莖環(huán)結構。 將大腸桿菌將大腸桿菌mRNA分子的某些保護性結構元分子的某些保護性結構元件與外源件與外源mRNA融合，便可起到穩(wěn)定劑的作用。融合，便可起到穩(wěn)定劑的作用。第48頁/共61頁4、遺傳密碼子的使用對基因表達效率的影響、遺傳密碼子的使用對基因表達效率的影響（1）密碼子使用的偏愛性）密碼子使用的偏愛性 遺傳密碼有簡并性，即一種氨基酸有數個同遺傳密碼有簡并性，即一種氨基酸有數個同義密碼子；例如，亮氨酸共有義密碼子；例如，亮氨酸共有6個密碼子。個密碼子。 無論真核基因還是原核基因，一種特定的氨基無論真核基因還是原核基因，一種特定的氨基酸并不是

47、以同等頻率使用所有的同義密碼子，而酸并不是以同等頻率使用所有的同義密碼子，而主要使用其中的某一兩種。這種遺傳密碼使用的主要使用其中的某一兩種。這種遺傳密碼使用的非隨機性現象非隨機性現象密碼子使用的偏愛性密碼子使用的偏愛性。第49頁/共61頁造成密碼子使用的偏愛性的兩個原因：造成密碼子使用的偏愛性的兩個原因：1）細胞中同工）細胞中同工tRNA的豐度差異；的豐度差異；2）嘧啶堿基結尾的密碼子（）嘧啶堿基結尾的密碼子（C或或U）之間的非）之間的非隨機選擇。隨機選擇。實驗發(fā)現，密碼子第實驗發(fā)現，密碼子第3位結尾的嘧啶位結尾的嘧啶堿基在使用上是非隨機的，存在著偏愛性，且堿基在使用上是非隨機的，存在著偏愛

48、性，且這種偏愛性與基因的表現度有關。對于具高表這種偏愛性與基因的表現度有關。對于具高表達活性的基因，如果密碼子的頭兩個堿基是達活性的基因，如果密碼子的頭兩個堿基是AA或或UU，則其第三位堿基偏向選用，則其第三位堿基偏向選用C，而如果頭，而如果頭兩個堿基是兩個堿基是GG或或CC，則其第三個堿基偏向選，則其第三個堿基偏向選用用U。3） 堿基含量（堿基含量（AT/GC）第50頁/共61頁（2）密碼子使用的偏愛性對基因表達效率的影響）密碼子使用的偏愛性對基因表達效率的影響* 富含大腸桿菌罕見密碼子的外源真核基因是很富含大腸桿菌罕見密碼子的外源真核基因是很難在大腸桿菌細胞中得到有效的表達。反之，則難在大

49、腸桿菌細胞中得到有效的表達。反之，則表達效率提高。表達效率提高。 * 到底多少含量的罕見密碼子才不會給克隆在大到底多少含量的罕見密碼子才不會給克隆在大腸桿菌的外源基因的表達造成負面影響？腸桿菌的外源基因的表達造成負面影響？機制還不明確。機制還不明確。第51頁/共61頁5、寄主細胞的生理狀態(tài)對基因表達的影響、寄主細胞的生理狀態(tài)對基因表達的影響 大腸桿菌的生理狀態(tài)會或多或少地影響外源基大腸桿菌的生理狀態(tài)會或多或少地影響外源基因的表達效率；但究竟是怎樣影響外源基因的表因的表達效率；但究竟是怎樣影響外源基因的表達效率，仍缺乏全面系統(tǒng)的研究。達效率，仍缺乏全面系統(tǒng)的研究。 影響大腸桿菌生理狀態(tài)的因素：包

50、括培養(yǎng)基影響大腸桿菌生理狀態(tài)的因素：包括培養(yǎng)基營養(yǎng)成分、細胞培養(yǎng)方式、以及培養(yǎng)溫度和培營養(yǎng)成分、細胞培養(yǎng)方式、以及培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基中所溶解的氧等。養(yǎng)基中所溶解的氧等。第52頁/共61頁宿主細胞的選擇適合目的基因表達的宿主細胞的要求適合目的基因表達的宿主細胞的要求: : 1 1、容易獲得較高濃度的細胞；、容易獲得較高濃度的細胞； 2 2、能利用易得廉價原料；、能利用易得廉價原料； 3 3、不致病、不產生內毒素；、不致病、不產生內毒素； 4 4、發(fā)熱量低、需氧低、適當的發(fā)酵溫度和細胞形態(tài)；、發(fā)熱量低、需氧低、適當的發(fā)酵溫度和細胞形態(tài)； 5 5、容易進行代謝調控；、容易進行代謝調控； 6 6、容易進行、容易進行DNADNA重組技術操作；重組技術操作； 7 7、產物的產量、產率高，、產物的產量、產率高， 8 8、產物容易提取純化。、產物容易提取純化。第53頁/共61頁大腸桿菌中表達體系的不足大腸桿菌中表達體系的不足： 1. 1. 真核基因，在結構上同原核基因之真核基因，在結構上同原核基因之間存在著很大的差別。間存在著很大的差別。 2. 2. 真核基因