IL-33TLRs信號通路在A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用

1、IL-33/TLRs信號通路在A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用摘要目的 觀察生長轉(zhuǎn)化因子1（TGF-1）對上皮來源的A549細(xì)胞增殖及相關(guān)細(xì)胞標(biāo)記物的影響，探討IL-33/TLR4信號通路在上皮來源的A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用。方法 培養(yǎng)A549細(xì)胞，用5ng/ml的TGF-1刺激A549細(xì)胞；在不同時(shí)間點(diǎn)，MTT法檢測TGF-1對A549細(xì)胞增殖的影響；Real-time PCR方法檢測IL-33/TLR4信號通路中關(guān)鍵因子IL-33，TLR4、PI3K基因的表達(dá)改變；western blot方法檢測-SMA， E-cad， p-AKT蛋白的動態(tài)表達(dá)。結(jié)果 （1）.MTT結(jié)果顯示，

2、各組細(xì)胞生長良好，隨時(shí)間的延長，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，但加入5ng/ml TGF-1刺激12h，24h，48h后，A549細(xì)胞的增值與對照組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。（2）.在5ng/ml的TGF-1刺激下，A549細(xì)胞與對照組相比，E-cad蛋白表達(dá)量逐漸下降（P0.05），而-SMA的表達(dá)呈逐漸上升的趨勢（P0.05）。提示，A549細(xì)胞上皮細(xì)胞特征逐漸減少，而間質(zhì)細(xì)胞特征逐漸增多，即A549細(xì)胞發(fā)生了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。（3）. Real-time PCR結(jié)果顯示，經(jīng)5ng/ml的TGF-1處理的A549細(xì)胞與對照組相比，在12h、24h、48h，IL-33/TLR4信號通路的關(guān)鍵基因I

3、L-33、TLR4均呈先升高后下降的趨勢，在24h時(shí)表達(dá)量最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。（4）.western blot結(jié)果顯示，經(jīng)5ng/ml的TGF-1處理的A549細(xì)胞，隨時(shí)間的延長，在12h、24h、48h，p-AKT的表達(dá)量逐漸升高，與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05）.(2)With the stimulation of the TGF1(5ng/ml).The expression of the epithelial cell marker protein E-cad decreased gradually（P0.05）.But the expression of

4、 -SMA showed an increasing tendency（P0.05）.The results suggested that the characteristics of the epithelial cells decreased gradually. But the characteristics of the mesenchymal cells increased gradually. Epithelial mesenchymal transition happened in the A549 cells.(3)The results of the Real-time PC

5、R showed that the expression of the IL-33 and TLR4 in the IL-33/TLR4signalpathway of the A549 cells treated by TGF1 (5ng/ml) were first increased and then decreased In 12h,24h,48h compared with the control group. Theexpressionin the 24h was the highest,the difference was statistically significant(P0

6、.05).(4) The results of the western blot showed that the expression of the p-AKT in the A549 cells which is treated by TGF1 (5ng/ml) increased gradually compared with the control group with theextension of time(in 12h,24h,48h).The difference was statistically significant(P0.05).Conclusion:(1) After

7、the stimulation of the TGF1 in the A549 cells. The expression of the epithelial cell marker protein E-cad decreased gradually. But the expression of the Mesenchymalcellmarker protein -SMA increased gradually. The results showed that epithelialmesenchymal transitionisinduced by TGF1 in A549 cell. It

8、confirmed that epithelialmesenchymal transition is closely related topulmonary fibrosis.(2) In the processof epithelialmesenchymal transition induced by TGF1 in A549 cell. The expression of IL-33, TLR4, p-AKT increased, It was inferred that in the process of the epithelial cell injury and the excess

9、ive repair of the mesenchymal cell, the over expression of IL-33 and TLR4 played a role in IL-33/TLR4 signaling pathway.(3)The expression of the p-AKT increased gradually with the extension of the time. So in the process of epithelialmesenchymal transition, PI3K/AKT signaling pathway is activated. T

10、LR4 can bind to PI3K andthe activation of TLR4depended on IL-33.It was inferred that theactivation of the PI3K/AKT pathwaywas associated with the overexpression of IL-33.(4) With the extension of time, IL-33 and TLR4 increased first and then decreased. Combined with our previous study, we speculated

11、 that when lung was injured, IL-33 played a role of warning. It started the repair of lung tissue. With the extension of the time, the effect of the IL-33 decreased. TLR4 which is the downstream of the IL-33 alsoincreased firstly and then decreased,andthe activation of PI3K/AKT pathway presents thec

12、ascade. The downstream moleculesgraduallyactivated,ultimately involved in the processof pulmonary fibrosis.Keywords:epithelialmesenchymaltransition(EMT);Interleukin-33(IL-33);Tolllike receptors(TLRs);phosphatidylinositol -3-kinase(PI3K).第一章 緒論1 間質(zhì)性肺病的概述及研究進(jìn)展間質(zhì)性肺疾?。↖LD，interstitial lung disease），又稱為彌

13、漫性肺實(shí)質(zhì)性疾病(diffuse parenchymal lung disease，DPLD)，是由多組疾病組成的一類不同性質(zhì)的疾病，包括200多個病種?；静±碜兓癁閺浡苑螌?shí)質(zhì)、肺泡炎癥和間質(zhì)纖維化，臨床上主要表現(xiàn)為X線胸片彌漫性浸潤陰影、進(jìn)行性加重的呼吸困難、限制性通氣障礙、彌散功能降低和低氧血癥。目前國際上將ILD/ DPLD分為四類：(1)已知病因的間質(zhì)性肺疾?。喝缢幬?，結(jié)締組織疾病相關(guān)的肺部病變等；(2) 少見的間質(zhì)性肺疾病，如慢性嗜酸性粒細(xì)胞性肺炎、朗格罕斯細(xì)胞肉芽腫病、淋巴管平滑肌瘤病、肺出血-腎炎綜合征即Goodpasture 綜合征等； (3) 肉芽腫性間質(zhì)性肺疾病，如外源

14、過敏性肺泡炎、結(jié)節(jié)病、Wegenerr肉芽腫等； (4)特發(fā)性間質(zhì)性肺炎（idiopathic interstitial pneumonia，IIP）：尋常性/特發(fā)性即UIP/IPF、脫屑性間質(zhì)性肺炎（DIP）、非特異性間質(zhì)性肺炎（NSIP）、淋巴細(xì)胞性間質(zhì)性肺炎（LIP）、急性間質(zhì)性肺炎（AIP）、呼吸性細(xì)支氣管炎性間質(zhì)性肺?。≧B-ILD）、隱源性機(jī)化性肺炎（COP）1。特發(fā)性肺纖維化（IPF，idiopathic pulmonary fibrosis）是最常見的肺間質(zhì)疾病，也是肺間質(zhì)纖維化的主要原因。2011年美國胸科學(xué)會（ATS），歐洲呼吸學(xué)會（ERS），日本呼吸學(xué)會（JRS），拉丁美

15、洲胸科學(xué)會（ALAT）共同發(fā)表了關(guān)于IPF的最新研究概況的循證指南，為IPF的診療提供了更加完善的方案。IPF是一種不明原因的、慢性、進(jìn)展性的肺部彌漫性疾病，病變部位局限于肺組織，主要表現(xiàn)為呼吸困難和肺功能的障礙。該指南提出診斷IPF時(shí)，需排除其他已知原因的引起的ILD，同時(shí)強(qiáng)調(diào)了高分辨率CT（HRCT）在IPF診斷中的重要性2。疾病的發(fā)展是一個動態(tài)過程，在臨床上需結(jié)合癥狀、體征、職業(yè)史、用藥史、環(huán)境因素、影像學(xué)檢查、肺功能、病理活檢、支氣管肺泡灌洗等相關(guān)檢查，對IPF進(jìn)行全面細(xì)致的診斷。由于診斷技術(shù)的不斷提高，IPF的檢出率不斷增加，但目前的治療手段并未獲得滿意的療效。在藥物治療治療方面，指

16、南提出目前尚無有明確療效的藥物。糖皮質(zhì)激素、秋水仙堿、環(huán)孢素A、免疫抑制劑、乙酰半胱氨酸、干擾素-等傳統(tǒng)藥物的治療效果尚不肯定，對于愿意接受藥物治療的診斷明確的IPF患者，指南推薦的治療方案是乙酰半胱氨酸+硫唑嘌呤+潑尼松，抗凝治療，乙酰半胱氨酸，吡非尼酮；非藥物治療在一定程度上能夠緩解部分患者病情，如長期氧療、肺康復(fù)訓(xùn)練、肺移植等2。IPF明確診斷后，患者的中位生存時(shí)間約為35年，預(yù)后極差，患者生活質(zhì)量明顯下降，因此對IPF的發(fā)病機(jī)制、治療方案有待深入研究。IPF病理改變的特點(diǎn)為肺組織內(nèi)變化不均，分布不均，可見正常組織，間質(zhì)的炎癥，纖維增生，蜂窩肺等病理表現(xiàn)共存，主要位于兩肺的周邊部和基底部

17、。病變早期以肺泡炎為主，同時(shí)伴少量的纖維增生；中期肺泡炎癥的消退，但出現(xiàn)大量成纖維細(xì)胞的增殖，膠原纖維的增生；后期肺組織纖維化的形成。IPF的發(fā)病原因尚不清楚，可能與長期接觸粉塵、毒物、病毒感染、吸煙、自身免疫、遺傳因素、環(huán)境污染和放射線等有關(guān)。目前，全世界IPF患者有一千余萬人，在我國的發(fā)病率也有35/10萬每年，且呈逐年升高的趨勢。發(fā)病后的平均存活時(shí)間為2.53年.據(jù)統(tǒng)計(jì)，男性發(fā)病率為20.2/100,000，女性發(fā)病率為13.2/100,000，且發(fā)病率呈上升趨勢。美國一項(xiàng)研究表明，在十年（19922003）內(nèi)死于特發(fā)性肺纖維化的人數(shù)已經(jīng)上升了50%3-5。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，IPF的

18、男性發(fā)病率較女性高（1.5-1.7:1），吸煙、粉塵及木屑等環(huán)境是其危險(xiǎn)因素，僅0.5-3.7%的患者可能與遺傳因素有關(guān)8-9。目前尚無治療IPF的特效藥物，雖然肺移植是唯一能延長IPF患者生存期的措施，但因供體極少、且價(jià)格昂貴、移植后生存率低6-7等原因，不能廣泛應(yīng)用于臨床。盡管對其開展研究已有數(shù)十年之久，但是仍未找到明顯的致病因素，尚不能完整陳述其致病機(jī)制。經(jīng)典的發(fā)病機(jī)制認(rèn)為，IPF可能是炎癥、組織損傷、修復(fù)持續(xù)疊加和惡性循環(huán)的結(jié)果。各種致病因素包括炎癥，組織損傷等，可損傷肺泡上皮細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞與上皮下基底膜，啟動成纖維細(xì)胞募集、增生和分化，引起肺泡中巨噬細(xì)胞活化，淋巴細(xì)胞、中性粒

19、細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，促進(jìn)炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放，導(dǎo)致早期肺損傷；在隨后肺纖維化的形成過程中，炎癥細(xì)胞釋放的炎性介質(zhì)與多種細(xì)胞因子起到重要作用10 。因此，認(rèn)為慢性損傷和纖維增生修復(fù)最終導(dǎo)致了肺纖維化，起主導(dǎo)作用的細(xì)胞主要是肺泡上皮細(xì)胞和活化的成纖維細(xì)胞（即肌成纖維細(xì)胞）。肺腺癌細(xì)胞來源的A549細(xì)胞在纖維化過程中呈現(xiàn)的變化與人肺泡上皮細(xì)胞相似，因此本試驗(yàn)選用A549細(xì)胞為研究對象。2 IL-33/TLRs-PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 白細(xì)胞介素-33（IL-33）是近年來新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，2005年被鑒定為屬白介素-1類家族新成員11。IL-33廣泛表達(dá)于許多組織，但其表達(dá)亦受細(xì)胞類

20、型的限制12。人類和小鼠的IL-33 mRNA在胃、肺、脊髓、腦、皮膚出表達(dá)水平較高，而在淋巴組織、脾、胰腺、腎臟和心臟出現(xiàn)表達(dá)較低。在細(xì)胞水平上IL-33主要出現(xiàn)在間質(zhì)細(xì)胞包括上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等13，而且，IL-33在呼吸道、消化道等與外界接觸的黏膜系統(tǒng)具有更高的表達(dá)水平。IL-1 和IFN- 刺激后，正常人皮膚成纖維細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞以及在支氣管平滑肌細(xì)胞中均出現(xiàn)了IL-33 mRNA 的高水平表達(dá)。牛肺泡蛋白沉積癥以及皮癬皮膚樣品中IL-33 mRNA 的表達(dá)呈現(xiàn)顯著升高的趨勢 14。 向志光等15對IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠的肺組織檢查發(fā)現(xiàn)，肺組織存在

21、著炎癥性病理改變，在氣管和血管周圍的炎性病灶出現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞的浸潤，杯狀細(xì)胞增生，粘液在呼吸道積聚。IL-33信號通路的靶細(xì)胞主要包括Th2細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞等，嗜酸性粒細(xì)胞可以驅(qū)動和激活炎癥信號，可以認(rèn)為IL-33參與了肺部炎癥反應(yīng)。在外傷或感染引起組織損傷時(shí)，作為警報(bào)素的IL-33分泌增多，啟動組織的修復(fù)反應(yīng)16。Prefontaine D等在動物實(shí)驗(yàn)中研究發(fā)現(xiàn)哮喘者氣道平滑肌的IL-33表達(dá)量高于無哮喘者，特別是在嚴(yán)重哮喘發(fā)作時(shí)更明顯17，且國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)抗IL-33抗體能防止小鼠哮喘的進(jìn)展18，表明IL-33在哮喘的發(fā)病過程中發(fā)揮了一定的作用。 本課題組

22、前期通過小鼠IPF模型證明肺纖維化過程中存在IL-33/ST2信號通路的異常激活，IL-33表達(dá)量升高，在第14天表達(dá)達(dá)到最高，提示IL-33可能參與了肺纖維化過程19。同時(shí)，在細(xì)胞層面本課題組研究結(jié)果提示IL-33能與ST2受體結(jié)合，激活I(lǐng)L-33/ST2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在肺纖維化的發(fā)病機(jī)制中起了重要作用20。 Toll樣受體（Toll like receptor,TLRs）是一類進(jìn)化高度保守的病原分子識別受體，是連接天然免疫和特異性免疫的跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，屬型跨膜蛋白, 要包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)三部分。胞外區(qū)富含亮氨酸重復(fù)序列，其功能是作為模式受體可以檢測到微生物的病原體相關(guān)模式分子，跨

23、膜區(qū)富含半胱氨酸，主要負(fù)責(zé)信號的傳導(dǎo)，胞內(nèi)區(qū)與白細(xì)胞介素-1的胞內(nèi)區(qū)相似，簡稱TIR結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與其他含有TIR結(jié)構(gòu)的蛋白相互作用，并招募MyD88分子等蛋白。迄今為止，哺乳動物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)13種TLRs，即：TLR1-TLR13。TLR4是其中一種，在肺部分布較多，與許多肺部疾病有的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。TLR4介導(dǎo)的信號通路分為MyD88依賴途徑和TRIF依賴的信號途徑。研究發(fā)現(xiàn)TLR4在肝纖維化、腎纖維、膽囊纖維化中發(fā)揮了重要作用，在肺纖維化的作用少有研究。經(jīng)典的TLR4/MyD88信號通路為研究的熱點(diǎn) 21-23。 近年來發(fā)現(xiàn)除MyD88經(jīng)典信號通路外，MyD88還可以募集PI3K，形成TLR4

24、/PI3K-AKT信號通路。PI3K/AKT信號通路主要發(fā)現(xiàn)于各種腫瘤疾病，能夠抑制細(xì)胞的凋亡而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。肺纖維化的形成與肺成纖維細(xì)胞凋亡不足有關(guān)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號通路的抗凋亡促進(jìn)增殖的作用在肺纖維化疾病的發(fā)病機(jī)制中起了作用24-25。TLR4與ST2同屬白介素-1受體超家族，有極其相似的TIR結(jié)構(gòu)，可以作為IL-33的受體，結(jié)合后激活I(lǐng)L-33/TLR4信號通路，進(jìn)而發(fā)揮作用，用IL-33刺激肺泡巨噬細(xì)胞后，TLR4受體有增高的趨勢26。1.3 本研究的目的、方法、意義及技術(shù)路線設(shè)計(jì)1.3.1 研究目的 通過體外實(shí)驗(yàn)，以TGF-1刺激上皮來源的A549細(xì)胞，觀察其對細(xì)胞增

25、殖及相關(guān)細(xì)胞標(biāo)記物的影響，探討IL-33/TLRs信號通路在A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymaltransition，EMT）中的作用機(jī)制。1.3.2 研究方法 采用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究方法。具體技術(shù)方法包括細(xì)胞培養(yǎng)，MTT比色法，Real-time PCR，Western blot等。1.3.3 研究意義 目前國內(nèi)外對于IL-33在肺纖維化方面的研究較少，在本實(shí)驗(yàn)旨在通過TGF-1誘導(dǎo)型肺泡上皮來源的A549細(xì)胞EMT過程，制備細(xì)胞層面的肺纖維化模型，探討IL-33/TLR4信號通路與肺纖維化之間的關(guān)系，從而為肺纖維化尋求新的治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。1.

26、3.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程圖第二章IL-33/TLRs信號通路在TGF-1誘導(dǎo)A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用1材料與方法1.1儀器光學(xué)顯微鏡日本Olympus公司臺式低速離心機(jī)江蘇海門市其林貝爾儀器制造公司臺式冷凍溫控低速離心機(jī), 5702 RH德國eppendorf公司電熱恒溫水浴箱江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠超凈工作臺蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司Mini-Protean III蛋白電泳儀美國Bio-Rad公司TY-200S脫色搖床金壇市醫(yī)療儀器廠小型臺式高速冷凍離心機(jī)，5417R型德國Eppendorf公司臺式高速離心機(jī)美國THERMA公司CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱德國Forma公司紫外凝膠成像儀Ultros

27、pec2000德國SYNGENE公司蛋白電泳轉(zhuǎn)移裝置美國Bio-Rad公司凝膠成像及分析系統(tǒng)美國Gene公司核酸檢測儀德國Eppendorf公司ABI2720普通PCR儀美國Applied Biosystem 公司MX3000熒光定量PCR儀美國Bio-Rad公司Typhoon 9000掃描系統(tǒng)美國GE公司1.2試劑及材料DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)均購自WISENT公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司，TGF-1購自Perotech公司，鼠抗人-平滑肌肌動蛋白(-smooth muscle actin,-SMA)抗體，兔抗人E鈣粘

28、蛋白（E-cadherin，E-cad）抗體，ECL顯色試劑盒均購自武漢博士德公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，GAPDH多克隆抗體均購自SANT CRUZ公司。DMSO購自CALBIOCHEM公司，MTT購自Sigma公司。Trizol試劑購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量試劑盒均購自TaKaRa公司。1.3主要溶液及成份實(shí)驗(yàn)主要溶液及其配方如下所示：溶液 成分Tris-HCl（pH 6.8） 6.05g Tris堿和0.4g SDS,加超純水定容至100ml，用濃鹽酸調(diào)pHTris-HCl（pH 8.8） 18.2g Tris堿和0

29、.4g SDS，加超純水定容至100ml，用濃鹽酸調(diào)pH10%SDS貯存液 100g電泳級的SDS，加超純水定容至1000滿了，加熱至68助溶，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.25Tris-甘氨酸電泳液 5.1g Tris堿和94g甘氨酸溶于950ml超純水，再加入50ml 10%的SDS貯存液10%過硫酸銨 1g過硫酸銨溶解于10ml超純水中，-20保存考馬斯亮藍(lán)R-250染液 90ml甲醇：水（1:1，V/V），和10ml冰醋酸混合液，加入考馬斯亮藍(lán)R-250 0.25g，充分溶解，然后過濾后備用脫色液 10%乙酸，30%甲醇，60% 超純水轉(zhuǎn)膜液 Tris 5.8g，甘氨酸2.9g和0.37g S

30、DS加超純水定容至800ml 中，再加入200ml甲醇 10TBS 80g NaCl，2g KCl和30g 加超純水定容至1000ml，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4TBS/T 將10TBS稀釋10倍后以1:1000的比例加入吐溫20消化液 型膠原酶7.5 mg溶于5 mL DMEM培養(yǎng)基含10胎牛血清用0.2 m濾器過濾除菌 (不超過1周)聚丙烯酰胺凝膠制備配方見表1：表1聚丙烯酰胺凝膠配方積層膠（ml）10%分離膠（ml）水2.74.030%丙烯酰胺0.673.31.5mMTris-cl (PH8.8)2.51mMTris-cl(PH6.8)0.510%十二烷基硫酸鈉0.040.110%過硫酸胺0.0401TEMED0.0040.0041.4實(shí)驗(yàn)細(xì)胞A549細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。1.5 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代、凍存、復(fù)蘇細(xì)胞培養(yǎng)：A549細(xì)胞選用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，以4-5105/ml接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放置于37，5%CO2細(xì)胞培